多孔有機籠毛細管電色譜手性柱的研究

禹紫云，唐明華，章俊輝，袁黎明

（云南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650500）

毛細管電泳（CE）是微柱分離和經(jīng)典電泳技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，是近年來的研究熱點［1］。而毛細管電色譜（CEC）是結(jié)合CE［2］與高效液相色譜（HPLC）的優(yōu)點而發(fā)展起來的一種高效快捷的分離手段。固定相［3－6］是色譜柱中最核心的部分，在分離過程中，CEC的固定相不僅起著保留待測物的作用，還會產(chǎn)生電滲流對樣品進行分離。通常采用外層涂敷聚酰亞胺、內(nèi)徑25～100μm的熔融石英管柱［7］制作色譜柱。毛細管因具有電阻大、內(nèi)徑小、比表面積大等特點，使得CEC可在微電流、高電壓的環(huán)境下工作［8］，并被廣泛用于環(huán)境分析、藥物分析、手性分離等諸多前沿領(lǐng)域。

多孔有機籠（POC）［9－10］是一種具有三維空腔結(jié)構(gòu)的依靠分子間堆積組裝通過亞胺鍵、碳碳鍵、硼酸酯鍵等共價鍵連接而成的多孔材料。該多孔材料的形狀一般為四面體、八面體、十二面體和球形。用于合成多孔有機籠的反應(yīng)較多，其中，席夫堿反應(yīng)因不需要使用價格高昂的催化劑，且屬于動態(tài)共價化學(xué)反應(yīng)，易形成穩(wěn)定有序的多孔材料［11－12］，被廣泛運用與研究［13－14］。用伯胺與醛或者酮發(fā)生席夫堿反應(yīng)容易獲得有機分子胺籠，且氨基較為活潑，為后期衍生、將多孔有機籠功能化提供了多種可能性。但亞胺鍵不穩(wěn)定，易發(fā)生水解（尤其是在酸性或堿性環(huán)境下），因此其應(yīng)用受到限制。為了解決這一問題，Cooper等［15］通過一種合成策略，將多孔有機籠的頂點與含羰基的物質(zhì)結(jié)合在一起，以此來維持晶體的穩(wěn)定性，使其孔隙大小不發(fā)生改變。與金屬有機骨架［16－19］、介孔二氧化硅［20－22］等多孔材料不同的是，POC的溶解性較好，在常見的大部分有機溶劑中均能溶解，故POC可以作為固定相用于制備色譜柱。2016年，本課題組將CC9用做氣相色譜的固定相［23］，發(fā)現(xiàn)涂敷了CC9的色譜柱具有很好的選擇性、較高分離度和良好的重現(xiàn)性，且其拆分外消旋體的效果與CC3－R色譜柱互補。

本文基于（1R，2R）-二苯乙二胺與2-羥基-1，3，5-均苯三甲醛之間的席夫堿縮合反應(yīng)制備了一種羥基官能團化的多孔有機分子籠，其在大多數(shù)有機溶劑中具有良好的溶解性，可用作開管毛細管電色譜（OT－CEC）手性固定相。本研究將該POC均勻涂敷在毛細管壁上制成色譜柱，通過拆分位置異構(gòu)體和外消旋體來研究其分離性能。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

苯酚（99%）、三氟乙酸（99%）、硫脲（99%）、六亞甲基四胺（99%）和（1R，2R）-二苯乙二胺（98%）購于上海Adamas－beta試劑有限公司；三氯甲烷（99%）、鹽酸（37%）、二甲亞砜（99%）、磷酸（85%）、氫氧化鈉（99%）、二氯甲烷（99.5%）購于天津風船化學(xué)試劑有限公司；二氫黃酮（99%）、酮洛芬（99%）購于比利時Acros Organics公司；o，m，p-硝基苯酚（99%）、o，m，p-硝基苯胺（99%）購于上海Aladdin試劑有限公司；生物緩沖劑三羥基氨基甲烷（Tris，99.9%）購于北京Solarbio公司。

所有手性樣品的分離均在CL 1020高效毛細管電泳儀（北京華陽利民儀器有限公司）上進行，該儀器配備的紫外檢測器檢測波長為190～700 nm。

1.2 2-羥基-1，3，5-均苯三甲醛的合成

在2.96 g（28 mmol）苯酚與8.6 g（61 mmol）六亞甲基四胺混合物中加入30 mL三氟乙酸，并在N2保護下于130℃油浴中攪拌24 h，隨后將反應(yīng)升溫至150℃攪拌2.5 h，接著降溫至120℃，加入50 mL濃度為4 mol/L的HCl，靜置12 h后，可獲得淡黃色粉末，用甲醇、1 mol/L HCl、二氯甲烷洗滌，得到2-羥基-1，3，5-均苯三甲醛。

1.3 多孔有機籠的合成

根據(jù)文獻［24］方法合成多孔有機籠材料：將0.159 g（0.75 mmol）（1R，2R）-二苯乙二胺加入二甲亞砜與高純水（9∶1，體積比）的混合液中，超聲使其充分溶解，然后加入0.089 g（0.5 mmol）2-羥基-1，3，5-均苯三甲醛于室溫下反應(yīng)14 d。反應(yīng)結(jié)束后可獲得黃色沉淀，依次用三氯甲烷、水洗滌，干燥處理后得到黃色粉末。

1.4 多孔有機籠開管柱制備

將熔融石英毛細管壁依次用1 mol/L NaOH、0.1 mol/L HCl和高純水進行粗糙化處理，烘干備用。POC溶解于二氯甲烷溶液中，超聲后過濾。用流速恒定的高純氮氣將上述濾液推入粗糙化后的毛細管內(nèi)，用較小流速的氮氣將色譜柱吹干。

1.5 毛細管電色譜實驗條件

本實驗選用的緩沖溶液為Tris－H3PO4，電滲流標記物為硫脲。截取一段POC開管毛細管色譜柱（58 cm×75μm），在距末端6 cm處開窗，色譜柱的有效分離長度為52 cm。初次使用該色譜柱之前，依次用去離子水、緩沖溶液沖洗色譜柱直至基線穩(wěn)定。實驗過程中，樣品的紫外檢測波長均為254 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 POC晶體的表征

2.1.1X射線表征采用X射線衍射法（XRD）探究POC晶體粉末的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，其特征衍射峰（圖1）與文獻［24］報道一致。

圖1 POC晶體粉末的XRD衍射圖Fig.1 XRD diffraction pattern of POC crystal powder

2.1.21H NMR譜圖將POC溶于氘代氯仿（CDCl3）中測得的1H NMR譜圖見圖2：1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ8.92－8.86（m，4 H），8.66－8.58（m，4 H），8.42－8.39（m，4 H），8.30－8.18（m，8 H），7.22－7.06（m，6 H），4.83－4.65（m，12 H）ppm。

圖2 POC的核磁共振氫譜圖Fig.2 1H NMR spectrum of POC

2.1.3紅外光譜圖采用KBr壓片法測得的POC晶體的紅外光譜圖見圖3?？梢钥吹?，1 636 cm-1處較強的特征吸收峰為亞胺鍵（C==N）拉伸帶，位于3 061 cm-1和2 868 cm－1處的峰為N==C―H和C―H拉伸帶，位于3 420 cm-1處的吸收峰是―OH拉伸帶，在約3 033、1 602、1 489、1 458 cm-1處的吸收峰由苯環(huán)中C==C―H和C==C的拉伸振動產(chǎn)生。

圖3 POC晶體的紅外譜圖Fig.3 FTIR spectrum of POC crystal

POC晶體的分子式為C120H96N12O4，理論上：C 81.54%，H 5.47%，N 9.50%。通過元素分析后得到：C 81.36%，H 5.32%，N 9.45%。

以上所有表征均與文獻［24］報道相符，證明成功合成POC。

2.1.4熱穩(wěn)定性及比表面積分析在毛細管電色譜中，固定相材料的穩(wěn)定性對實驗結(jié)果有很大影響。CEC在運行過程中，毛細管色譜柱兩端施加的電壓高達上萬伏，由于管壁內(nèi)徑極小，很容易產(chǎn)生大量焦耳熱，所以用于毛細管電色譜的固定相需要具有較好的熱穩(wěn)定性。本文通過熱重實驗進行了POC的熱穩(wěn)定性分析。從25℃勻速升溫到800℃，發(fā)現(xiàn)在約300℃時材料開始大量分解，表明POC熱穩(wěn)定性較好。

POC是一種具有空腔結(jié)構(gòu)的多孔材料，為測試其比表面積、空腔結(jié)構(gòu)的體積及孔徑大小，對其進行氮氣吸附實驗。結(jié)果顯示，POC的比表面積為408.64 m2·g－1，孔體積為0.15 cm3·g－1，孔徑大小為1.67 nm。

2.1.5掃描電鏡表征將POC溶于二氯甲烷，用高純氮氣推入毛細管內(nèi)制成開管柱。將制成的色譜柱進行掃描電鏡（SEM）分析，觀察該多孔材料在毛細管內(nèi)壁的涂敷情況，結(jié)果見圖4?？梢钥吹?，涂層厚度約為1μm，且POC均勻涂敷在毛細管內(nèi)壁上。

圖4 空管柱（A）和POC手性色譜柱（B）的掃描電鏡圖Fig.4 SEM images of empty tube column（A）and POC chiral chromatographic column（B）

2.2 電壓選擇及pH值對POC手性色譜柱電滲流的影響

本實驗在Tris－H3PO4緩沖溶液濃度為100 mmol/L，pH值為3.51的條件下，將工作電壓從6 kV逐漸增加到18 kV，測試了色譜柱工作電壓與電流的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)隨著電壓的增加，工作電流線性增加（r=0.992）。當電壓在6～18 kV范圍時，產(chǎn)生的焦耳熱較小，可用作分離電壓。

選擇Tris－H3PO4緩沖溶液濃度為100 mmol/L，以硫脲作標記物，分離電壓為15 kV，分別對空管柱、POC開管毛細管柱在不同pH值流動相中的電滲流變化情況進行考察，結(jié)果見圖5。隨著pH值增加，空管柱和POC色譜柱的電滲流均增加，但POC色譜柱電滲流的增加趨勢較緩慢，且在相同情況下，其電滲流大小均小于空管柱。這是因為，與空管柱相比，POC色譜柱上涂敷有一層多孔材料，與緩沖溶液的接觸面積遠低于空管柱，毛細管內(nèi)壁解離出的Si－O－數(shù)量較少，電滲流較小。

圖5 POC手性柱電滲流隨pH值的變化情況Fig.5 Changes of electroosmotic flow of POC chiral column with pH values

2.3 POC手性色譜柱對位置異構(gòu)體的拆分

硝基苯酚與硝基苯胺均有3個位置異構(gòu)體，因結(jié)構(gòu)存在差異，用途也各不相同。為檢測POC手性毛細管柱對位置異構(gòu)體的拆分性能，嘗試使用該色譜柱對o，m，p-硝基苯酚、o，m，p-硝基苯胺進行拆分。本實驗選擇濃度為100 mmol/L、pH 3.51的Tris－H3PO4緩沖溶液進行分離測試（分離電壓為15 kV），結(jié)果見表1。圖6為上述3種位置異構(gòu)體的分離譜圖?？梢钥吹?，POC毛細管色譜柱對o，m，p-硝基苯酚、o，m，p-硝基苯胺的分離效果較好。這是因為，POC是一種手性多孔材料，具有多個手性識別位點，當位置異構(gòu)體通過該手性色譜柱時，與多孔材料充分接觸并發(fā)生相互作用，且位置異構(gòu)體的分子結(jié)構(gòu)、大小存在差異，從而可達到分離。

圖6 POC毛細管柱對o，m，p-硝基苯酚（A）和o，m，p-硝基苯胺（B）位置異構(gòu)體的拆分色譜圖Fig.6 Chromatograms of o，m，p-nitropheno（lA）and o，m，p-nitropheniline（B）positional isomers on POC column chromatographic column：58 cm×75μm（effective length 52 cm），pH 3.51，100 mmol/L Tris－H3PO4 system，separation voltage：15 kV，injection time：5 s

表1 位置異構(gòu)體在POC手性柱上的分離情況Table 1 Separation of positional isomers on POC chiral column

2.4 POC手性毛細管柱對手性化合物的拆分

為探究POC毛細管柱對手性化合物的拆分能力，選用二氫黃酮與酮洛芬進行測試。通過改變電壓、緩沖溶液的濃度和pH值，探討兩者在POC毛細管柱中獲得最佳分離效果的實驗條件。

2.4.1分離電壓對手性化合物拆分的影響選用100 mmol/L，pH 3.51的Tris－H3PO4緩沖體系，考察分離電壓對手性化合物二氫黃酮與酮洛芬拆分的影響，結(jié)果見表2和圖7。當電壓從15 kV增加至16 kV時，二氫黃酮的分離度由0.34增大到1.52，而電壓上升至17 kV時，分離度反而降低。酮洛芬在13 kV下的分離度為3.58，且峰拖尾較嚴重；電壓為14 kV時，可獲得最大分離度。隨著分離電壓增大，分析樣品的出峰時間縮短。但當工作電壓超過一定范圍時，會在柱內(nèi)產(chǎn)生大量的焦耳熱，影響拆分手性化合物的效率。

圖7 POC毛細管柱在不同分離電壓下對二氫黃酮（A）與酮洛芬（B）手性樣品的拆分譜圖Fig.7 Chromatograms of flavonone（A）and ketoprofen（B）chiral samples by POC column under different separation voltages chromatographic column 58 cm×75μm（effective length 52 cm），pH 3.51，100 mmol/L Tris－H3PO4 system，separation voltage：15 kV，injection time：5 s

表2 不同分離電壓對外消旋體的拆分情況Table 2 Separation of racemates by different separation voltages

2.4.2緩沖溶液濃度對手性化合物拆分的影響在最佳分離電壓下，考察了pH 3.51的不同濃度的緩沖溶液對手性化合物二氫黃酮和酮洛芬在POC手性毛細管柱上拆分的影響。發(fā)現(xiàn)當緩沖溶液濃度由75 mmol/L增到100 mmol/L時，兩者的分離度均增加；當濃度上升至125 mmol/L時，其分離度均不同程度的降低。即在POC手性毛細管柱中，二氫黃酮與酮洛芬獲得最佳分離度所需的緩沖溶液的濃度為100 mmol/L。由此可知緩沖溶液的濃度對手性樣品分離度的影響較大，在一定范圍內(nèi)，分離度隨著濃度的增大而增大，可能是因為隨著緩沖溶液濃度的增加，毛細管柱內(nèi)的電滲流降低，致使手性化合物表觀淌度增加；但當緩沖液濃度超過該范圍時，由于柱內(nèi)焦耳熱過大，引起區(qū)帶展寬，使得分離度降低，甚至無法拆分對映異構(gòu)體。

2.4.3緩沖溶液pH值對手性化合物拆分的影響緩沖溶液pH值的改變會引起溶質(zhì)數(shù)量及溶質(zhì)所帶電荷性質(zhì)的改變，進而導(dǎo)致毛細管內(nèi)電滲流的改變。在一定范圍內(nèi)，隨著緩沖溶液pH值的增加，手性樣品的分離時間縮短，分離效率提高。同時緩沖溶液pH值的穩(wěn)定性對CEC中的電滲流存在一定影響，進而影響分析結(jié)果的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性［25］。故在分離手性藥品時，必須在pH值適宜的緩沖溶液中進行。

在獲得的二氫黃酮和酮洛芬的最佳分離電壓和緩沖溶液濃度條件下，通過改變緩沖溶液的pH值，考察其對手性樣品拆分的影響，結(jié)果見表3。

表3 不同pH值的緩沖溶液對外消旋體的拆分情況Table 3 The resolution of racemates in buffer solutions with different pH values

由表3可知，在分離電壓為16 kV，緩沖溶液濃度為100 mmol/L，pH 4.5時，二氫黃酮獲得最大分離度；當pH值從2.5增至3.5時，酮洛芬的分離度為5.57，pH 4.5時，分離度下降為4.26。說明緩沖溶液的pH值應(yīng)控制在一定范圍內(nèi)，否則會影響拆分效果。根據(jù)上述實驗結(jié)果，獲得二氫黃酮和酮洛芬在POC毛細管柱上的最佳分離條件（見表4），其分離色譜圖見圖8。該手性色譜柱可以拆分二氫黃酮與酮洛芬，可能是由于手性樣品與有機分子籠之間存在立體構(gòu)型匹配作用、主－客體包含作用和π－π相互作用。由于微觀結(jié)構(gòu)對識別手性化合物的影響是一個十分復(fù)雜的問題，目前還無法準確闡述其拆分手性化合物的機理。

表4 外消旋體在POC毛細管柱上獲最大分離度的實驗條件Table 4 Experimental conditions for maximum resolution of racemate on POC column

圖8 POC毛細管柱分離二氫黃酮（A）與酮洛芬（B）手性化合物的色譜圖Fig.8 Chromatograms of the separation of flavonone（A）and ketoprofen（B）chiral compounds on POC column

2.5 POC手性毛細管柱重現(xiàn)性及穩(wěn)定性評價

選擇酮洛芬為測試物，在工作電壓16 kV、pH 3.5的100 mmol/L的緩沖溶液中進行實驗，考察了POC手性毛細管柱的穩(wěn)定性及重現(xiàn)性。連續(xù)5次進樣，酮洛芬保留時間的相對標準偏差（RSD）為1.2%；連續(xù)3 d進樣，其保留時間的RSD為4.0%。在同等條件下制備3根手性柱對酮洛芬進行拆分，其保留時間的RSD為5.5%。結(jié)果表明，POC手性毛細管柱具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

3 結(jié) 論

本文以（1R，2R）-二苯乙二胺與2-羥基-1，3，5-均苯三甲醛合成了羥基官能團化的多孔有機籠，并將其制成開管色譜柱。成功拆分了o，m，p-硝基苯酚、o，m，p-硝基苯胺兩個位置異構(gòu)體。并通過改變工作電壓、緩沖溶液的濃度及pH值獲得了二氫黃酮和酮洛芬在POC手性毛細管柱上的最佳分離條件。POC毛細管柱拆分手性化合物具有一定的可行性，重現(xiàn)性與穩(wěn)定性較好，可以作為毛細管電色譜固定相。