山藥DoIPTs基因克隆及珠芽發(fā)芽期表達(dá)分析

唐文芳，徐升勝，段延碧，龍雯虹，楊榮萍，張雪梅，孟金貴

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)科教學(xué)實驗中心，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

山藥(DioscoreaoppositaThunb)為薯蕷科植物，地下塊莖可作為藥食同源性材料[1]。細(xì)胞分裂素(Cytokinins，CTK)是重要的植物激素，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。異戊二烯基是細(xì)胞分裂素生物合成的前體[3]，異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(Isopentenyl transferase，IPT)是細(xì)胞分裂素生物合成的限速酶[4]，控制細(xì)胞分裂素生物合成時第一步的速度。在玉米籽粒發(fā)育中，IPT基因表達(dá)對細(xì)胞分裂素合成起主要作用，從而影響籽粒的發(fā)育[5]。MdIPT5a過量表達(dá)時煙草組培苗不定芽增多，即IPT基因表達(dá)上調(diào)時煙草組培苗發(fā)芽數(shù)增加[6]。擬南芥IPT基因啟動子序列中MGSA基序與CaMV35S啟動子元素融合，促使報告基因在精子細(xì)胞中表達(dá)，選擇性活化可能是開花植物精細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控的共同機(jī)制，IPT基因啟動子序列在精細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮作用[7]。因此，克隆植物的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因，獲取基因信息及其表達(dá)情況對研究植物的生長發(fā)育至關(guān)重要。本研究將克隆山藥異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因，并研究該基因在珠芽發(fā)芽期的表達(dá)規(guī)律，為今后研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料準(zhǔn)備

采集牛尾山藥嫩葉存于-80 ℃冰箱，用以基因克隆。

將生長成熟的珠芽置于22 ℃、相對濕度50%、光照強(qiáng)度2 500 lx、光照時間為12 h/d的光照培養(yǎng)箱中。分別在珠芽剛采收時、半休眠時(采收后30 d)以及萌芽(第2年春天頂芽達(dá)0.5 cm)時，隨機(jī)取5粒珠芽，切取珠芽近發(fā)芽端的表皮混合，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存，研究珠芽在利用內(nèi)部含水量發(fā)芽時基因表達(dá)量的變化。

珠芽收獲60 d后，分別用5，25，45，65，85 mg/L的多效唑(Paclobutrazol，PP333)(配制PP333溶液時為便于多效唑溶解，先用2 mL甲醇溶解多效唑干粉，再用蒸餾水定容)浸泡珠芽24 h，然后用清水洗干凈，置于潮濕的含水量約20%蛭石基質(zhì)中，放到22 ℃、光照強(qiáng)度2 500 lx、光照時間為12 h/d的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。清水處理為對照。多效唑處理前第1次取樣，以后分別在處理后第14，28，42，56天取樣。每次隨機(jī)取5粒珠芽，切取珠芽近發(fā)芽端的表皮混合，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存以備研究多效唑處理后基因表達(dá)的變化。

1.2 山藥總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

用快速通用植物RNA提取試劑盒提取山藥總RNA，用無RNA酶消化殘余的DNA后迅速冷凍保存于-80 ℃環(huán)境；通過無RNA酶的瓊脂糖凝膠電泳檢查核酸樣本的完整性；采用Nanodrop微量分光光度計測定樣品A260和A280值，計算RNA濃度(A260/280)。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一條鏈，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.3 山藥DoIPTs克隆與測序

根據(jù)山藥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計RT-PCR與RACE引物(表1)，RACE克隆參照SMARTer?RACE 5′/3′Kit User Manual方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增。中間片段以葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體系和反應(yīng)程序參照試劑盒參數(shù)設(shè)置。對分子量合格的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，連入pMD18-T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，將獲得帶有目的產(chǎn)物的陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序。引物合成及核酸測序由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司完成。目的片段用DNAMAN 2.0軟件進(jìn)行拼接，從而獲得基因序列全長。

表1 PCR引物Tab.1 Primers used for PCR

1.4 DoIPTs生物信息學(xué)分析

用NCBI-Blast核酸比對基因序列的同源性，目的基因序列多重比較分析基因間的相似性；用NCBI的ORF Finder和Conserved Domains在線網(wǎng)站分別進(jìn)行開放閱讀框(Open reading frame，ORF)和保守結(jié)構(gòu)域分析；用ExPASy服務(wù)器上的Protparam、ProtScale 進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及親疏水性預(yù)測；使用在線工具TMHMM Serverv 2.0分析蛋白的跨膜區(qū)；使用SignalP軟件對蛋白的信號肽進(jìn)行分析；利用SOPMA和SWISS-MODEL網(wǎng)站程序預(yù)測分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)；下載與目標(biāo)序列相似性較高的氨基酸序列進(jìn)行多重比較分析，用ClustalX和MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 珠芽發(fā)芽期DoIPTs基因的表達(dá)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 獲得總RNA和cDNA序列分析

山藥葉片總RNA提取后，總RNA無降解完整性好(圖1-A)，總RNA濃度為486.759 ng/μL，A260/230=1.873，A260/280=2.016，說明樣本RNA符合要求可用于后續(xù)試驗。

RNA逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增拼接，最終獲得3條核酸長依次為：1 398，1 044，1 349 bp，拼接后的3個基因經(jīng)凝膠電泳驗證合格(圖 1-B)，依次命名為：DoIPT1、DoIPT5a和DoIPT5b。

對目的基因進(jìn)行Blast比較，發(fā)現(xiàn)3個基因的核酸序列相似性為38.33%。DoIPT1、DoIPT5a和DoIPT5b的ORF全長依次為1 137，861，1 011 bp，對應(yīng)編碼378，286，336 aa(圖1-C)。DoIPT1s的GenBank登錄號依次為：MW353160、MW353016、MW353017。

圖1 RNA、DoIPTs全長凝膠電泳圖及DoIPTs基因的ORF編碼區(qū)域Fig.1 Gel electrophoresis map of RNA，DoIPTs full-length，and ORF encoding region of DoIPTs gene

本研究得到的DoIPT1、DoIPT5a和DoIPT5b核苷酸序列與岡比亞白山藥(D.rotundata)基因組的3條序列(序列登錄號分別是BDML01001166.1、BLBR01000012.1和BLBR01000019.1)的一致性分別為92.00%，96.00%和93.00%。DoIPT5a的核苷酸序列與岡比亞白山藥DcIPT3基因mRNA序列(登錄號：XM_039280767.1)和基因組序列(登錄號：BLBR01000012.1)的同源性最高，達(dá)96.09%。DoIPT1和DoIPT5a與擬南芥AtIPT5基因的mRNA序列(登錄號：NM_001343585.1)同源性分別為75.00%，70.00%；DoIPT5b與擬南芥AtIPT7基因的mRNA序列(登錄號：AB062613.1)同源性達(dá)73.61%。

2.2 DoIPTs氨基酸信息預(yù)測結(jié)果

ExPASy在線分析DoIPTs氨基酸序列，可知DoIPT1、DoIPT5a和DoIPT5b的蛋白分子質(zhì)量為 41.593 94，31.479 24，37.269 81 ku，理論等電點為8.53，5.13，5.11，(Asp + Glu)負(fù)電荷殘基總數(shù)47，42，47，(Arg + Lys)正電荷殘基總數(shù) 51，34，35；蛋白的脂肪指數(shù)是81.38，97.80，93.15，不穩(wěn)定指數(shù)依次為34.92，36.43，37.29，脂肪指數(shù)高于不穩(wěn)定指數(shù)，表明DoIPT1蛋白為不穩(wěn)定堿性蛋白，DoIPT5a和DoIPT5b蛋白為不穩(wěn)定酸性蛋白。DoIPTs蛋白的總體平均親水性GRAVY值依次為：-0.398，-0.077，-0.089，表明DoIPTs蛋白為親水性蛋白；DoIPTs蛋白均位于膜外，為外在膜蛋白；DoIPT1和DoIPT5a不存在信號肽，DoIPT5b存在2個信號肽(圖2)。

圖2 DoIPTs氨基酸的信號肽Fig.2 Signal peptide of DoIPTs amino acids

SOPMA預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，DoIPTs蛋白結(jié)構(gòu)具有相同的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)卷曲元件，DoIPT1、DoIPT5a和DoIPT5b的α-螺旋所占百分比依次為50.00%，43.45%，48.94%，延伸鏈所占百分比依次為13.99%，13.10%，10.58%，β-轉(zhuǎn)角所占百分比依次為9.09%，10.12%，7.41%，無規(guī)卷曲所占百分比依次為26.92%，33.33%，33.07%，具體結(jié)構(gòu)信息見圖3-A。SWISS-MODEL預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)顯示，結(jié)構(gòu)組成主要以α-螺旋為主，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致(圖3-B)。DoIPTs蛋白三級結(jié)構(gòu)殘基模型為3a8t.1.A模型，DoIPT1、DoIPT5a和DoIPT5b建模殘基序列與IPT蛋白序列模型的同源性分別為52.30%(同源蛋白276 aa)，43.08%(同源蛋白261 aa)和44.49%(同源蛋白243 aa)。

A：藍(lán)色.α-螺旋;紅色.延伸鏈;綠色.β-轉(zhuǎn)角;橘色.無規(guī)卷曲。A：Blue.α-helix;Red.Extended chain;Green.β-turn;Orange.Random curl.

對比DoIPT5a氨基酸序列與DcIPT3氨基酸序列(登錄號為XM_039280767.1)得知，兩者長度一致，但DoIPT5a在保守域前端少15個氨基酸殘基，后端多15個氨基酸殘基，兩者后30個氨基酸殘基差異較大；保守域中共15個氨基酸殘基發(fā)生突變，包括Q60P、R70S、P83R、Y120A、A143V、A155D、S263C等。

2.3 DoIPTs氨基酸多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析

應(yīng)用ClustalX氨基酸比對發(fā)現(xiàn)(圖4)，DoIPTs氨基酸序列N端有ATP/GTP結(jié)合位點P-loop NTPase結(jié)構(gòu)域GXXGXGKS(T)(X代表任意氨基酸)。利用NCBI的BlastP程序以DoIPTs序列為目標(biāo)序列搜索數(shù)據(jù)庫中的同源序列，把同源序列與DoIPTs構(gòu)建進(jìn)化樹(圖5)得知，DoIPTs與其他物種IPTs序列具有較很高的相似性。首先山藥DoIPT5s與單子葉植物鳳梨 AcIPT5、深圳擬蘭 AsIPT5、油棕EgIPT5、海棗PdIPT5、野生二粒小麥TdIPT5屬于一大分支，親緣關(guān)系最近；其次與擬南芥AtIPT2為旁系枝，相比擬南芥其余8個基因親緣關(guān)系更近(圖5)。

粉色顯示同源級別為100%，藍(lán)色同源級別為100%～75%，綠色高于75%～50%，白色低于33%；紅色橫線標(biāo)識ATP/GTP結(jié)合位點GXXGXGK(X代表任意氨基酸)。Similarity of 100%，100%—75%，75%—50%，and 0—33% was displayed with pink，blue，green and white，respectively；The binding site GXXGXGK(X standed for any amino acid)of ATP/GTP was displayed with red horizontal line.

進(jìn)化樹枝葉由蛋白名及登錄號代表，蛋白名前2個字母由物種拉丁名縮寫得到。鳳梨.AcIPT5；擬南芥.AtIPT(1—9)9個蛋白；深圳擬蘭.AsIPT5；蕪青.BrIPT3；油棕.EgIPT5；向日葵.HaIPT3；橡膠樹.HbIPT3；木薯.MeIPT3；楊梅.MrIPT3；海棗.PdIPT5；可可.TcIPT3；野生二粒小麥.TdIPT5。本研究獲得的蛋白用四菱形標(biāo)出。

2.4 山藥不同時間DoIPTs 基因表達(dá)分析

2.4.1 山藥珠芽發(fā)芽時的基因表達(dá)分析 實時熒光定量PCR結(jié)果顯示(圖6)，珠芽采收后放置于22 ℃下，DoIPT1基因表達(dá)量在珠芽剛進(jìn)入休眠和開始發(fā)芽2個時期，差異不顯著(P>0.05)，2個時期都顯著(P<0.05)高于半休眠時；DoIPT5a基因從珠芽剛進(jìn)入休眠到發(fā)芽表達(dá)量升高，3個時期的表達(dá)量差異顯著(P<0.05)；DoIPT5b基因表達(dá)量則在剛進(jìn)入休眠最高，顯著(P<0.05)高于后2個時期，后2個時期差異不顯著(P>0.05)；在半休眠時和發(fā)芽時DoIPT5a基因表達(dá)高于DoIPT1和DoIPT5b基因(圖6-A)。

圖A為珠芽運用本體水分調(diào)節(jié)發(fā)芽時，珠芽表皮中基因的表達(dá)量；圖B為珠芽采收60 d后，施加水后珠芽表皮中基因的表達(dá)量。圖中不同小寫字母表示差異顯著(Duncan′s法，P<0.05)。圖7同。

采收60 d后，在潮濕基質(zhì)中催芽，每隔14 d測定基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在催芽的56 d內(nèi)DOIPT1和DoIPT5b的表達(dá)量升高(圖6-B)，第56天表達(dá)量顯著高于其他時間段(P<0.05)；DoIPT5a基因的表達(dá)量則0～56 d呈現(xiàn)降-升-降-升的變化，最高表達(dá)量出現(xiàn)在第28天；在56 d內(nèi)DOIPT1和DoIPT5b比DoIPT5a的表達(dá)量高。由此推測，在無水條件下DoIPT5a調(diào)控珠芽發(fā)芽，在潮濕環(huán)境中DoIPT1和DoIPT5b起主要調(diào)控作用。

2.4.2 山藥珠芽多效唑處理后的基因表達(dá)分析 用不同濃度多效唑浸泡珠芽后，56 d內(nèi)DoIPTs基因的表達(dá)結(jié)果見圖7。0 mg/L的PP333處理珠芽第56天的DoIPT1基因表達(dá)量顯著高于其他時間；5 mg/L PP333處理DoIPT1基因的表達(dá)量第28天顯著高于其他時間(P<0.05)；25，45，65 mg/L的PP333處理后DoIPT1基因表達(dá)量最高值出現(xiàn)在第14天；85 mg/L PP333處理后第56天DoIPT1基因表達(dá)量最高；25，45 mg/L的PP333處理促進(jìn)DoIPT5a基因在第14天開始高水平表達(dá)，且持續(xù)到第28天，65，85 mg/L的PP333處理后DoIPT5a基因表達(dá)分別是高值出現(xiàn)較早、持續(xù)時間短和表達(dá)量最高值出現(xiàn)較晚、持續(xù)時間長，而對照(0 mg/L的PP333處理)的DoIPT5a基因則在第56天才出現(xiàn)最高值；多效唑處理后，DoIPT5b基因的表達(dá)量在第14天或第28天出現(xiàn)最高值?？傊?，25～65 mg/L的多效唑處理后，DoIPT1、DoIPT5a和DoIPT5b的最大表達(dá)量得到了提前。由此推測，多效唑處理能夠提高DoIPTs基因的表達(dá)量。

圖7 DoIPTs在不同濃度多效唑處理后的相對表達(dá)量Fig.7 Relative expression level of DoIPTs under different concentrations of PP333

3 討論

本試驗利用RT-PCR與RACE技術(shù)克隆DoIPTs基因，成功獲得相應(yīng)的3條mRNA全長。通過NCBI-Blast進(jìn)行比對，與擬南芥等其他物種IPT基因相比較，相似度達(dá)70%。生物信息學(xué)分析也顯示，DoIPTs蛋白屬于P-loop-NTPase超級家族，含P-loop NTPase結(jié)構(gòu)域(GXXGXGKS(T))，且與其他物種的保守結(jié)構(gòu)域、蛋白結(jié)構(gòu)[8]等均相似；這個基元序列(GXXGXGKS(或T))具有高度保守特征，能夠結(jié)合細(xì)胞分裂素的合成底物，具有催化形成細(xì)胞分裂素的能力[9]。山藥的IPT蛋白空間結(jié)構(gòu)模型與各物種相似，如與黃瓜[10]、桃[11]及大豆[12]的IPT蛋白極其相似，由此推測，山藥的3個IPT編碼區(qū)可能具有催化合成細(xì)胞分裂素的生化功能。另外，NCBI-Blast比對發(fā)現(xiàn)，本研究得到的DoIPT1、DoIPT5a和DoIPT5b核苷酸序列與岡比亞白山藥基因組的3條序列(序列登錄號分別是BDML01001166.1、BLBR01000012.1和BLBR01000019.1)的一致性分別為92.00%，96.00%和93.00%。所以，推測本研究得到了3條不同的IPT基因。

比對DoIPT5a核苷酸序列與岡比亞白山藥相關(guān)基因(登錄號為XM_039280767.1)得知，2條核苷酸序列同源性達(dá)96.09%；相應(yīng)的2條氨基酸序列長度一致，但C-末端和N-末端差異較大，保守域中共15個氨基酸殘基發(fā)生突變。在這2個薯蕷屬植物氨基酸的保守域中，變異較大的位點是：Q60P，谷氨酸(酸性)與脯氨酸(堿性)的突變；R70S，精氨酸(堿性)與絲氨酸(中性)的突變；P83R，脯氨酸與精氨酸突變，電荷變化；Y120A，絡(luò)氨酸與丙氨酸突變，DoIPT5a具有帶苯環(huán)、結(jié)構(gòu)更大的絡(luò)氨酸；A143V，基團(tuán)小的丙氨酸與基團(tuán)大的纈氨酸突變；A155D，丙氨酸(中性)與天門冬氨酸(酸性)突變；S263C，半胱氨酸與絲氨酸的突變，DoIPT5a氨基酸序列中出現(xiàn)半胱氨酸，半胱氨酸影響氨基酸三級結(jié)構(gòu)，是否形成四級結(jié)構(gòu)有待研究?？傊琁PT基因推導(dǎo)的氨基酸序列在薯蕷屬物種間總體上保守，但保守域內(nèi)已經(jīng)發(fā)生基團(tuán)大小、電荷、pH值及影響氨基酸結(jié)構(gòu)的位點突變，這些突變是否直接影響細(xì)胞分裂素合成，以及由此造成何種生理影響有待進(jìn)一步研究。

Oneto等[13]研究表明，缺水條件可誘導(dǎo)IPT基因表達(dá)及提高細(xì)胞分裂素水平，從而延長綠葉持久性，并維持光合速率和氣孔導(dǎo)度正常，有助于提高缺水條件下C4植物的生產(chǎn)率。在缺水條件下，轉(zhuǎn)基因植株的光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率和產(chǎn)量均高于野生對照植株，其原因是IPT的表達(dá)可以延緩干旱誘導(dǎo)下葉片的衰老，提高轉(zhuǎn)基因作物對干旱的耐受性[14-15]。植物IPT基因的表達(dá)對水存在敏感度，在水有限的地區(qū)IPT基因?qū)χ参锞哂虚_發(fā)性能，對作物產(chǎn)量的研究具有巨大的潛力。本研究發(fā)現(xiàn)，山藥珠芽發(fā)芽時，IPT基因家族中不同成員的表達(dá)量因不同水分條件而異，DoIPT5a基因在無水處理時表達(dá)量最高，而在潮濕條件下卻是DoIPT1和DoIPT5b相對表達(dá)量高，表明DoIPTs基因?qū)λ置{迫產(chǎn)生應(yīng)激表達(dá)。本研發(fā)現(xiàn)的表達(dá)模式為今后山藥水分脅迫機(jī)理的研究提供參考。

在擬南芥中，AtIPT1、AtIPT2、AtIPT3、AtIPT8和AtIPT9不受生長素影響，但AtIPT5和AtIPT7受生長素誘導(dǎo)上調(diào)[16]。在蕪菁(Brassicarapa)中，生長素抑制了BrIPT3-2、BrIPT5-2和BrIPT7-1的表達(dá)[17]。大豆GmIPT1基因受植物激素和化學(xué)試劑誘導(dǎo)上調(diào)[12]。在番茄(Solanumlycopersicum)果實中，ABA含量調(diào)節(jié)IPT4的表達(dá)，從而通過影響胡蘿卜素異構(gòu)酶基因ZISO的表達(dá)來積極調(diào)節(jié)番茄紅素的生物合成[18]。海角旋果苣(Streptocarpusrexii)的SrTPT5和SrTPT92個基因中，萘乙酸(NAA)顯著降低SrTPT5表達(dá)量，極顯著降低SrIPT9表達(dá)量，6-苯甲氨基嘌呤(BAP)能降低2個基因的表達(dá)量，但沒達(dá)到顯著水平，赤霉酸(GA3)顯著降低SrIPT9表達(dá)量，卻不降低SrIPT5表達(dá)量[19]。以上研究表明，植物激素和化學(xué)試劑影響IPT基因的表達(dá)量。曾旭等[20]研究還表明，適當(dāng)質(zhì)量濃度的多效唑能夠有效地提高小麥產(chǎn)量，促進(jìn)半休眠的山藥珠芽發(fā)芽[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，多效唑使采收60 d后的山藥珠芽中的DoIPTs基因上調(diào)，這能夠解釋貯藏60 d后山藥珠芽的休眠解除啟動才開始[22]，從而多效唑處理使珠芽發(fā)芽提早。另外，山藥珠芽發(fā)芽前出現(xiàn)GA3含量下降，而多效唑處理加快GA3下降速度[23]，而GA3顯著降低SrIPT9表達(dá)[19]，所以多效唑處理還可能通過降低GA3含量促進(jìn)山藥DoIPTs基因的表達(dá)量，進(jìn)而促進(jìn)珠芽發(fā)芽。多效唑究竟是直接使DoIPTs基因表達(dá)上調(diào)，還是通過降低GA3含量從而引起DoIPTs基因表達(dá)上調(diào)，還有待進(jìn)一步研究。