山羊CIDE家族基因克隆分析及互作蛋白預(yù)測(cè)鑒定

李 琪，楊昌恒，王 永，林亞秋，，向 華，朱江江，

(1.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南民族大學(xué)，四川 成都 610041；2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南民族大學(xué)，四川 成都 610041)

動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育及繁殖過程皆會(huì)受到脂代謝的影響。簡(jiǎn)州大耳羊是我國(guó)培育的第2個(gè)肉用山羊品種，作為我國(guó)重要的山羊品種資源，有關(guān)其脂質(zhì)代謝的相關(guān)基因的克隆、功能分析、生物學(xué)特性方面的研究可以為改良其遺傳特性提供理論依據(jù)。最初發(fā)現(xiàn)CIDE蛋白家族具有前凋亡蛋白的功能，后逐漸被發(fā)現(xiàn)是一類脂滴相關(guān)蛋白，在機(jī)體脂質(zhì)平衡中也起到了重要的作用，且該家族基因還是人類肥胖的候選基因之一。探索CIDE家族基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其在山羊脂代謝過程中的作用具有重要意義。CIDE(Cell death-inducing DFF45-like effectors)家族剛開始被發(fā)現(xiàn)時(shí)，被認(rèn)為與細(xì)胞凋亡相關(guān)，并且因?yàn)榕cDFF45(DNA fragmentation factor，DFF45)的 N 端結(jié)構(gòu)域高度同源而得名[1-3]。隨著人們不斷地研究發(fā)現(xiàn)，CIDE 家族蛋白主要參與調(diào)控細(xì)胞的脂代謝，是一類和脂類代謝密切相關(guān)的蛋白。CIDE家族共有3個(gè)成員，在小鼠中為 CIDEA、CIDEB、FSP27(Fat-specific protein 27)[4]，在人體中為 CIDEA、CIDEB、CIDEC[5]。CIDE 家族蛋白的氨基酸序列十分保守，其 N 端(CIDE-N)為一段保守的堿性序列，后面緊跟著一段酸性序列，CIDE蛋白的N 端序列之間可以形成相互作用，也可以通過該結(jié)構(gòu)與其他蛋白形成相互作用。CIDE 蛋白的 C 端可以介導(dǎo)脂滴的融合，且其疏水區(qū)具有脂滴定位功能[6-9]。脂肪組織是機(jī)體儲(chǔ)存能量的主要部位，包括白色和棕色脂肪組織。白色脂肪組織細(xì)胞的大部分空間被一個(gè)大脂滴所占據(jù)，棕色脂肪組織細(xì)胞中的脂滴比較小，但通常數(shù)量較多[10]。脂滴(Lipid droplet，LD)是細(xì)胞內(nèi)存儲(chǔ)脂質(zhì)的主要亞細(xì)胞器，其核心由中性脂質(zhì)構(gòu)成，外圍為單層磷脂膜，對(duì)體內(nèi)的脂質(zhì)平衡起重要的調(diào)控作用[11-13]。脂滴的膜上分布有多種蛋白質(zhì)，能夠合成或分解脂滴中的磷脂及中性脂，從而調(diào)節(jié)脂滴的大小及功能[14]。CIDE家族的蛋白均定位于脂滴表面，能夠在脂滴與脂滴之間的接觸位點(diǎn)上形成脂滴融合復(fù)合物(Lipid droplet fusion complex，LDFC)，連通2個(gè)脂滴，促進(jìn)脂滴間的融合[10]，從而調(diào)控脂滴的大小。當(dāng)過表達(dá)CIDE家族基因時(shí)，可使細(xì)胞內(nèi)脂滴增大，而在細(xì)胞或組織中敲除或是沉默CIDE家族基因時(shí)，會(huì)導(dǎo)致脂滴變小[15-16]。然而，目前有關(guān)脂滴形成的精確機(jī)制以及CIDE家族在其中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還尚不清楚。本研究以簡(jiǎn)州大耳羊?yàn)檠芯繉?duì)象，通過基因克隆及生物信息學(xué)分析，分析了CIDE家族基因的生物學(xué)特性，為其功能研究奠定了基礎(chǔ)。并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測(cè)了CIDE家族基因在山羊不同組織中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)了與CIDE家族基因表達(dá)量具有相關(guān)性的基因，可為進(jìn)一步研究精確的脂滴形成機(jī)制以及進(jìn)一步揭示CIDE基因在脂代謝中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供參考和理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 隨機(jī)選取成年(1周歲)健康的簡(jiǎn)州大耳羊10只為試驗(yàn)動(dòng)物(購自四川省簡(jiǎn)陽市大哥大牧業(yè)有限公司)。屠宰后采集其心、肝、脾、肺、腎、瘤胃、背最長(zhǎng)肌、股二頭肌等組織樣品，將采集的各組織分割成黃豆大小，用DEPC水清洗干凈后迅速裝入無RNase的凍存管中，置于液氮中保存，用于后續(xù)組織RNA的提取。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 DNA回收試劑盒、DNA聚合酶、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技有限，TRIzol、SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)試劑盒、pMD-19T Vector購自TaKaRa公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組織總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 用 TRIzol 法提取簡(jiǎn)州大耳羊的心、肝、脾、肺、腎、瘤胃等組織的總RNA，測(cè)定總RNA的OD260/280值，當(dāng)該值在 1.8～2.0說明可正常使用，然后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，反應(yīng)體系及條件：總 RNA 1 μg，Oligo(dT)Primer 1 μL，加 DEPC 水至 12 μL，65 ℃ 5 min；然后加入 dNTP mix 2 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，RiboLock RNase Inhibitor 1 μL，Revert Aid RT 1 μL，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。-20 ℃保存，用于后期基因克隆及qPCR。

1.2.2 山羊CIDEB、CIDEC基因克隆 根據(jù)GenBank上山羊的CIDEB(XM_005685207.3)、CIDEC(XM_018038446.1)基因預(yù)測(cè)序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物(表1)。RT-PCR反應(yīng)總體系：2×Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板cDNA 1 μL，加水補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性(98 ℃，3 min)；變性(98 ℃，30 s)，退火(CIDEB56 ℃/CIDEC59 ℃，30 s)，延伸(72 ℃，1 min)，共35個(gè)循環(huán)；延伸(72 ℃，10 min)，最后12 ℃保存。1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)后利用膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收和純化，將純化后的產(chǎn)物連接到pMD-19T載體上，并通過熱激轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)中，然后接種于涂有IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基(含Amp)上，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取白色陽性菌落，進(jìn)行菌液PCR鑒定后送至成都擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 克隆引物Tab.1 Primers for cloning

1.2.3 山羊CIDEs基因生物學(xué)特性分析 使用ProtParam在線工具對(duì)CIDE家族蛋白序列進(jìn)行分析，使用Prot Scale(http：//web.expasy.org/protscale)預(yù)測(cè)CIDE蛋白的親疏水性，利用ExPASy(https：//embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)預(yù)測(cè)CIDE家族蛋白的跨膜區(qū)域。利用EMBL-EBI(https://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobius/)及TargetP-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP-2.0/)進(jìn)行CIDE家族蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)。使用SOPMA分析該家族蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過SWISS-MODEL預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，利用STRING分析與其相互作用的蛋白。

1.2.4 山羊CIDE基因組織表達(dá)差異分析 根據(jù)NCBI上的序列設(shè)計(jì)CIDEA(KP120985)基因的RT-qPCR引物，根據(jù)克隆獲得的CIDEB、CIDEC基因序列設(shè)計(jì)其RT-qPCR引物(表2)。

利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)CIDEs在各個(gè)組織中的表達(dá)差異，以UXT為內(nèi)參基因矯正目的基因的相對(duì)表達(dá)水平，每個(gè)組織樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。RT-qPCR結(jié)果采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.2.5 CIDE與其互作蛋白相對(duì)表達(dá)量相關(guān)性分析 利用STRING分析得到與CIDE家族基因相互作用的蛋白質(zhì)，分別設(shè)計(jì)各互作蛋白的定量引物(表2)。RT-qPCR檢測(cè)以山羊心臟組織的Ct值為對(duì)照，結(jié)果用2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)得到CIDEs基因在山羊中表達(dá)量最高的組織，并檢測(cè)該組織中與其相互作用的基因的表達(dá)量，用SPSS軟件分析CIDE基因的表達(dá)量與其相互作用的基因的表達(dá)量的相關(guān)性，P<0.05時(shí)為差異顯著，P<0.01時(shí)為差異極顯著。

表2 定量引物Tab.2 Primers for quantitative real-time PCR(qPCR)

表2(續(xù))

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊CIDEB、CIDEC基因克隆

本試驗(yàn)以山羊的肝臟組織cDNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增獲得山羊CIDEB基因序列923 bp(圖1)，其中5′UTR為 146 bp，CDS區(qū)660 bp，3′UTR為117 bp，編碼219個(gè)氨基酸。CIDEC基因1 043 bp(圖1)，其中5′UTR 為23 bp，CDS區(qū)714 bp，3′UTR 為306 bp，編碼237個(gè)氨基酸。

A.克隆所得山羊CIDEB 923 bp；B.克隆所得山羊CIDEC 1 043 bp。A.Cloned goat CIDEB 923 bp；B.Cloned goat CIDEC 1 043 bp.

2.2 山羊CIDE基因生物學(xué)特性分析

2.2.1 蛋白理化性質(zhì)分析 對(duì)山羊CIDEB蛋白序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其蛋白分子式為C1090H1759N311O322S8，分子質(zhì)量為24.629 33 ku；理論等電點(diǎn)(Theoretical pI)為9.30，不穩(wěn)定指數(shù)為64.96，親水性總平均值為-0.372，推測(cè)該蛋白為堿性親水性不穩(wěn)定蛋白。山羊CIDEC蛋白分子式為C1190H1905N321O350S11，分子質(zhì)量為26.661 82 ku；理論等電點(diǎn)為9.27，不穩(wěn)定指數(shù)為40.44，親水性總平均值為-0.258，推測(cè)該蛋白為堿性親水性不穩(wěn)定蛋白(圖2)。CIDE家族蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果如圖2及表3。

表3 CIDE蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Tab.3 Signal peptide of CIDE protein

圖2 CIDE蛋白的親疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)以及信號(hào)肽的預(yù)測(cè)Fig.2 Hydrophobic，transmembrane structure and signal peptide of CIDE protein

2.2.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 山羊CIDE家族蛋白均具有 2 個(gè)絲氨酸(Serine)磷酸化位點(diǎn)、1 個(gè)蘇氨酸(Threonine)磷酸化位點(diǎn)和 3 個(gè)酪氨酸(Tyrosine)磷酸化位點(diǎn)。

CIDEA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，79(39.11%)個(gè)氨基酸殘基可能形成 α-螺旋(h)，34(16.83%)個(gè)氨基酸殘基可能形成β-折疊(e)，76(37.62%)個(gè)氨基酸殘基可能形成無規(guī)則卷曲(c)，13(16.83%)個(gè)氨基酸殘基可能形成β-轉(zhuǎn)角(t)(圖3-A)。CIDEB二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，102(46.58%)個(gè)氨基酸殘基可能形成 α-螺旋(h)，34(15.53%)個(gè)氨基酸殘基可能形成β-折疊(e)，71(32.42%)個(gè)氨基酸殘基可能形成無規(guī)則卷曲(c)，12(5.48%)個(gè)氨基酸殘基可能形成β-轉(zhuǎn)角(t)(圖3-B)。CIDEC二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，102(46.58%)個(gè)氨基酸殘基可能形成 α-螺旋(h)，34(15.53%)個(gè)氨基酸殘基可能形成β-折疊(e)，71(32.42%)個(gè)氨基酸殘基可能形成無規(guī)則卷曲(c)，12(5.48%)個(gè)氨基酸殘基可能形成β-轉(zhuǎn)角(圖3-C)。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，山羊和綿羊的CIDE家族蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，與牛的CIDE家族蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)略有不同。山羊CIDEB和CIDEC的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，但其CIDEA的三級(jí)結(jié)構(gòu)與CIDEB和CIDEC差別較大，而牛的CIDEC的三級(jí)結(jié)構(gòu)與CIDEA和CIDEC差別較大，猜測(cè)可能與其功能的差別有關(guān)，但CIDEB蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)在不同物種中都很保守(圖4)。采用STRING 交互式數(shù)據(jù)庫搜索可能與CIDE家族蛋白各成員相互作用的蛋白，結(jié)果如圖5。

藍(lán)色線條.α-螺旋；紅色線條.β-折疊；紫色線條.無規(guī)則卷曲；綠色線條.β-轉(zhuǎn)角。Blue line.α-helix；Red line.β-sheet；Purple line.Random curl；Green line.β-turn.

A2、B2、C2分別為牛的CIDEA、CIDEB、CIDEC三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；A3、B3、C3分別為綿羊的CIDEA、CIDEB、CIDEC三級(jí)結(jié)構(gòu)。A2(CIDEA)，B2(CIDEB)and C2(CIDEC)are predicted tertiary structure of the cattle；and A3(CIDEA)，B3(CIDEB)and C3(CIDEC)are predicted tertiary structure of the sheep.

圖5 山羊CIDEA(A)、CIDEB(B)和CIDEC(C)蛋白相互作用蛋白預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of proteins interacting with goat CIDEA(A)，CIDEB(B)and CIDEC(C)protein

2.2.3 氨基酸序列同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 利用NCBI對(duì)不同物種CIDEA的氨基酸同源性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)簡(jiǎn)州大耳羊與綿羊、牛、豬的同源性分別為99.01%，96.04%，83.17%。CIDEB與綿羊、牛、豬、人的同源性分別為100%，96.80%，87.67%，83.56%。CIDEC與綿羊、牛、人的同源性分別為99.16%，93.25%，84.87%。利用MEGA 5.0分別構(gòu)建山羊CIDEA、CIDEB和CIDEC氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖6所示，山羊CIDEA、CIDEB、CIDEC均與綿羊親緣關(guān)系最近。

圖6 山羊 CIDEA(A)、CIDEB(B)、CIDEC(C)氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic trees of goat CIDEA(A)，CIDEB(B)and CIDEC(C)amino acid sequence

2.3 山羊CIDE基因組織表達(dá)差異分析

以山羊心臟組織為對(duì)照，UXT為內(nèi)參，分析qPCR定量結(jié)果可知CIDE家族基因在山羊各組織中均有表達(dá)，其中CIDEA在山羊瘤胃中高表達(dá)(圖7-A)；CIDEB在肝臟中高表達(dá)(圖7-B)；CIDEC在小腸中有較高水平的表達(dá)(圖7-C)。

差異顯著(P<0.05)用不同小寫字母表示；差異不顯著(P>0.05)用相同小寫字母表示。The significant difference(P<0.05)was indicated in different lowercase letters；and the insignificant difference(P > 0.05)was indicated in the same lowercase letters.

2.4 山羊CIDE與其互作蛋白表達(dá)量相關(guān)性分析

本研究利用RT-qPCR檢測(cè)了CIDEs在山羊不同組織中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)CIDEA、CIDEB、CIDEC分別在山羊瘤胃、肝臟、小腸中表達(dá)量最高，進(jìn)而檢測(cè)了在這些組織中與其相互作用的基因的表達(dá)量，通過SPSS軟件來分析CIDE基因的表達(dá)量與其相互作用的基因的表達(dá)量的相關(guān)性。由數(shù)據(jù)分析可以看出，CIDEA與DFFB(R=0.723，P=0.009)和ELOVL3(R=0.724，P=0.009)在瘤胃中的表達(dá)量具有極顯著正相關(guān)性(P<0.01)，與DIO2(R=0.560，P=0.046)、TMEM26(R=0.660，P=0.019)、PRDM16(R=0.694，P=0.013)、PLIN1(R=0.640，P=0.023)具有顯著正相關(guān)性(P<0.05)(表4)。CIDEB與DFFA(R=0.694，P=0.013)和SDR39U1(R=0.655，P=0.020)在肝臟中的表達(dá)量具有顯著正相關(guān)性(P<0.05)(表5)。CIDEC與PLIN2(R=0.596，P=0.034)、GPLD1(R=0.554，P=0.048)、ADIPOQ(R=0.578，P=0.040)在小腸中的表達(dá)量具有顯著正相關(guān)性(P<0.05)(表6)。

表4 CIDEA與其互作蛋白相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis of CIDEA and its interacting proteins

表5 CIDEB與其互作蛋白相關(guān)性分析Tab.5 Correlation analysis of CIDEB and its interacting proteins

表6 CIDEC與其互作蛋白相關(guān)性分析Tab.6 Correlation analysis of CIDEC and its interacting proteins

3 結(jié)論與討論

影響機(jī)體脂代謝平衡的最主要細(xì)胞器是脂滴。Richard在1890年發(fā)現(xiàn)了脂滴的存在，但直到1991年，脂滴表面蛋白Plin1被發(fā)現(xiàn)后，才真正開始了有關(guān)脂滴的研究[17]。脂滴的外部是一層磷脂膜，內(nèi)部為中性脂，但不同類型的細(xì)胞，其脂滴內(nèi)部所含有的中性脂也會(huì)有所不同[18]，脂滴表面分布有許多功能蛋白。隨著越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，脂滴的功能不僅僅局限于貯存脂質(zhì)，還能夠參與脂質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞之間、細(xì)胞內(nèi)以及細(xì)胞膜與細(xì)胞器之間的信號(hào)傳遞過程等[19]。脂滴發(fā)生的異常[13]及CIDEs表達(dá)的異常[20]都會(huì)引發(fā)脂肪肝[21]、肥胖[22]等脂代謝疾病。而CIDEs在脂滴的形成及調(diào)控中起到了重要作用，該家族蛋白能在脂滴之間形成脂滴融合復(fù)合物(LDFC)，將中性脂從供體脂滴轉(zhuǎn)運(yùn)到受體脂滴中，介導(dǎo)脂滴的融合[23-24]，促進(jìn)大脂滴的形成。且其對(duì)脂滴的調(diào)控能力也不同，有研究發(fā)現(xiàn)CIDEA 和 CIDEC 融合脂滴的能力相同，CIDEB的能力較弱[25-26]，可能不同成員通過不同的調(diào)控通路來調(diào)節(jié)脂滴大小。

利用該試驗(yàn)獲得CIDEB和CIDEC基因序列，可以為后續(xù)研究CIDEs調(diào)控山羊脂質(zhì)代謝及在脂滴形成中的作用奠定基礎(chǔ)。并通過相關(guān)性分析，檢測(cè)到了不少與CIDEs表達(dá)量相關(guān)的基因，且大多與脂代謝或脂滴相關(guān)。如CIDEA與ELOVL3(R=0.724，P=0.009)的表達(dá)量具有極顯著正相關(guān)性，而ELOVL3 為極長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶3，屬于脂肪酸延長(zhǎng)酶(ELOVLs)家族，可以催化 C16、C18、C20 等極長(zhǎng)鏈脂肪酸的伸長(zhǎng)[27-28]。且在分化的牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞(MDSCs)中 ELOVL3 與脂滴的亞細(xì)胞定位具有一致性，ELOVL3 可能通過催化脂肪酸的延伸來調(diào)節(jié) TAG 的形成，從而促進(jìn)脂滴的積累[29]。PLIN1 是分布于脂滴表面含量最多的脂滴包被蛋白，該基因的表達(dá)量也與CIDEA呈顯著正相關(guān)性(P<0.05)，該基因的過表達(dá)可在mRNA和蛋白水平促進(jìn)脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)，促使脂肪細(xì)胞中的脂滴數(shù)量、體積和甘油三酯含量增加[30]。CIDEC與PLIN2(R=0.596，P=0.034)的表達(dá)量具有顯著正相關(guān)性，PLIN2是脂滴包被蛋白2，是胞內(nèi)脂滴表面相關(guān)蛋白之一，對(duì)脂滴的合成和降解具有重要作用[31]，且其可以上調(diào)SREBP2的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累[32]。由此可以推測(cè)，CIDE家族不同成員可以通過調(diào)控不同的基因或者受到不同基因的調(diào)控來調(diào)節(jié)生物體脂質(zhì)代謝和脂滴的形成，通過檢測(cè)與其表達(dá)量相關(guān)的蛋白可以從側(cè)面驗(yàn)證與其存在相互作用的脂代謝相關(guān)蛋白，并可能由此發(fā)現(xiàn)其調(diào)控通路。

RT-qPCR數(shù)據(jù)檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)CIDE家族蛋白與其他蛋白表達(dá)量的相關(guān)性，且利用軟件也只分析到了部分與其相互作用的蛋白質(zhì)，但越來越多的蛋白、轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)節(jié)CIDE家族蛋白，從而調(diào)控脂滴的發(fā)生和大小，影響機(jī)體的脂質(zhì)代謝。CIDEA的表達(dá)會(huì)受到轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，該基因的啟動(dòng)子含有PPARα和 PPARγ 的應(yīng)答元件，可被PPARs 的激動(dòng)劑激活[33]。CIDEA可以調(diào)控棕色脂肪組織中的UCP1(解偶聯(lián)蛋白)，從而影響機(jī)體的脂代謝[34]。CIDEA還可與AMPK 的β亞基發(fā)生相互作用。CIDEA敲除小鼠的AMPK 蛋白表達(dá)水平及酶活性都有所升高，能夠促進(jìn)脂肪酸的β氧化[35]。CIDEB能夠促進(jìn)TAG 從脂滴向極低密度脂蛋白(VLDL)轉(zhuǎn)運(yùn)，該蛋白C端的結(jié)構(gòu)可以和位于VLDL 上的 ApoB-100相互作用，提高了VLDL的脂肪組裝、成熟及分泌過程[36]。PGC1β 能夠促進(jìn)CIDEB轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而調(diào)控 VLDL 的分泌[37]，影響脂滴的大小。對(duì)脂肪細(xì)胞中內(nèi)源性的 Plin 和 Fsp27進(jìn)行免疫共沉淀，發(fā)現(xiàn)Plin 中心結(jié)構(gòu)域中的氨基酸 291—321部分介導(dǎo)了 Plin 與 Fsp27 的相互作用[38]，Plin1 可以與 CIDEC相互作用促進(jìn)脂滴的融合[39]。由此可見，無論是軟件分析還是RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果，只能發(fā)現(xiàn)部分與CIDE家族蛋白相互作用的蛋白，探索CIDE家族完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還需要更進(jìn)一步的研究。

越來越多的蛋白被發(fā)現(xiàn)能夠與CIDE家族蛋白發(fā)生相互作用，參與脂滴的發(fā)生，通過研究與其相互作用的蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子等，可進(jìn)一步了解CIDE家族調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其在脂質(zhì)沉積、脂質(zhì)代謝中的作用，也有助于更進(jìn)一步地掌握脂滴形成的精確機(jī)制。且通過研究影響脂滴生長(zhǎng)的相關(guān)基因，可以為肥胖、脂肪肝等脂代謝相關(guān)疾病的治療提供了理論信息。

本研究成功克隆獲得山羊CIDEB基因CDS序列660 bp，編碼219個(gè)氨基酸，CIDEC基因CDS區(qū)714 bp，編碼237個(gè)氨基酸。CIDEA、CIDEB、CIDEC基因分別在山羊瘤胃、肝臟、小腸中表達(dá)量最高。CIDEA與DFFB和ELOVL3在瘤胃中的表達(dá)量具有極顯著正相關(guān)性，與DIO2、TMEM26、PRDM16、PLIN1具有顯著正相關(guān)性。CIDEB與DFFA和SDR39U1在肝臟中的表達(dá)量具有顯著正相關(guān)性。CIDEC與PLIN2、GPLD1、ADIPOQ在小腸中的表達(dá)量具有顯著正相關(guān)性。該結(jié)果為進(jìn)一步闡明CIDEs在脂質(zhì)代謝及脂滴形成中的作用以及CIDE家族調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論基礎(chǔ)。