灌漿充實調節(jié)劑對大穗型水稻弱勢籽粒灌漿的調控效應

靜莉麗，彭 廷，趙亞帆，趙帥兵，王童童，李 源，程 遠，杜彥修，張 靜，孫紅正，趙全志

(河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南省水稻生物學重點實驗室，水稻河南省工程實驗室，河南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，河南 鄭州 450046)

大穗型水稻品種弱勢籽粒灌漿充實度差是制約其產(chǎn)量和品質進一步提高的瓶頸[1]。水稻籽粒灌漿是受多種因素調控的復雜有序的生化過程。已有研究證明，水稻籽粒灌漿過程中差異表達的miRNA通過調控其靶基因在灌漿充實中發(fā)揮重要作用[2]，其中miR167和miR1432分別通過調節(jié)其下游靶基因OsARF12和OsACOT的表達，進而負調控水稻籽粒的灌漿充實[3-4]。Zhang等[5-6]研究發(fā)現(xiàn)，類萌發(fā)素蛋白(GLP)和14-3-3蛋白是弱勢籽粒灌漿啟動的關鍵信號蛋白，灌漿早期弱勢籽粒中GLP蛋白的表達豐度低、14-3-3蛋白的冗余是造成弱勢籽粒灌漿差的主要原因，在胚乳中特異性低表達14-3-3蛋白家族成員GF14f可顯著增加籽粒的粒長和粒質量。在籽粒灌漿過程中，蔗糖到淀粉的復雜合成途徑受到多種酶的調控[7-9]，這些蔗糖-淀粉代謝關鍵酶活性及基因表達量低是限制弱勢籽粒灌漿的重要原因[10-11]，研究表明，通過灌漿期外源涂抹R18顯著增強水稻弱勢籽粒蔗糖-淀粉代謝關鍵酶的活性，提高弱勢籽粒千粒質量及結實率，促進弱勢籽粒灌漿[12]。大穗型水稻強弱勢籽粒內各激素含量與其灌漿速率密切相關[13-14]，籽粒中低的玉米素和玉米素核苷和吲哚乙酸含量是弱勢籽粒胚乳細胞數(shù)量少、灌漿慢、粒質量低的主要原因[15-16]，外源施加低濃度生長素可增強淀粉酶活性，促進同化物的運輸，而高濃度可增加弱勢籽粒實粒數(shù)[17]。

灌漿充實調節(jié)劑因其用量少、效果好等優(yōu)點被廣泛應用于改善水稻籽粒品質和產(chǎn)量上[18-20]。研究表明，噴施灌漿充實調節(jié)劑通過提高水稻弱勢籽粒的灌漿起始勢、最大及平均灌漿速率，進而提高弱勢籽粒的千粒質量，且蔗糖-淀粉代謝關鍵酶基因的表達量顯著增加[21]。目前，市場已有多種灌漿充實調節(jié)劑，但各灌漿充實調節(jié)劑效果如何，其調節(jié)水稻籽粒灌漿充實，尤其是弱勢籽粒灌漿充實的生理和分子機制尚無相關報道。

本研究通過探究市售灌漿充實調節(jié)劑對大穗型水稻產(chǎn)量及其構成因素、強弱勢籽粒灌漿動態(tài)、籽粒灌漿充實相關miRNA及其靶基因的表達量、激素含量、編碼灌漿充實相關蛋白基因及蔗糖-淀粉代謝關鍵酶基因表達量等方面的影響，旨在明確市售灌漿充實調節(jié)劑對大穗型水稻品種灌漿充實的調節(jié)作用，提升大穗型水稻的產(chǎn)量和品質。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為大穗型雜交稻品種交源優(yōu)216(由上海交通大學張大兵教授提供)；供試灌漿充實調節(jié)劑為禾立豐(由鄭州鄭氏化工產(chǎn)品有限公司提供)和新美洲星(由安徽神農(nóng)農(nóng)業(yè)技術開發(fā)有限公司提供)。

1.2 試驗方法

試驗于2020年5月在河南農(nóng)業(yè)大學原陽科教園區(qū)開展。采用大田試驗，隨機區(qū)組設計，各小區(qū)面積均為40 m2。采用機插秧專用秧盤育秧，株距14 cm，行距30 cm。設置抽穗開花期噴施2種灌漿充實調節(jié)劑處理，禾立豐噴施量為0.9 L/hm2，新美洲星噴施量為1.0 L/hm2，分別記作T1和T2；以噴施清水為對照(CK)。于抽穗期對各處理選擇同一天抽穗開花、生長狀態(tài)一致的穗子進行紅繩標記，每小區(qū)標記500穗。其他管理同一般高產(chǎn)田。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 強弱勢籽粒粒質量變化動態(tài)及灌漿速率的測定 分別于花后5，10，15，21，27，35，42 d在各小區(qū)中選取紅繩標記的代表性穗子10個，參照Peng等[22]的方法分強弱勢籽粒，105 ℃殺青0.5 h，80 ℃烘干至恒質量，計算強弱勢籽粒千粒質量。參照朱慶森等[23]的方法，以Richards方程擬合強弱勢籽粒的灌漿過程，并對各處理水稻強弱勢籽粒灌漿進行分析。

Richards方程：W=A(1+Be-k t)- 1 / N

式中，W為各時期生長量，即千粒質量(g)；t為花后天數(shù)(d)；A為生長終值量(g)；B、k、N為方程參數(shù)。

根據(jù)Richards方程推導出下列灌漿特征參數(shù)：灌漿起始勢R0= k/N；平均灌漿速率V=Ak/(2(N+2))；活躍灌漿期AGP= 2(N+2)/k；將灌漿速率為最大時的日期tmax=(lnB-lnN)/k代入kW(1-(W/A)N)/N中求出最大灌漿速率Vmax。

1.3.2 miRNA和相關基因的相對表達量測定

1.3.2.1 水稻籽粒總RNA的提取 分別于花后6，12，21 d選取對照、禾立豐和新美洲星處理的弱勢籽粒，立即置于液氮中，隨后保存于-80 ℃低溫冰箱。將去除穎殼的強弱勢籽粒樣品置于裝有液氮的研缽中充分研磨至粉末狀，使用RNA提取試劑盒(TransGen Biotech ET121 Transzol Plant)進行籽粒RNA提取。

1.3.2.2 反轉錄 使用反轉錄試劑盒(TIANGEN FastKing RT Kit with gDNase：KR116)將模板RNA反轉錄為cDNA。采用Stem-loop qRT-PCR中的方法對需測定miRNA表達量的RNA進行反轉錄，其中所用引物為 miRNA 特異反向引物和內參反向引物(Stem-loop_U)，引物序列見表1；用于其他基因反轉錄的引物為試劑盒中的FQ-RT PrimerMix。根據(jù)RNA的濃度進行稀釋后反轉錄，最終體系為20 μL。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3.2.3 熒光定量PCR 使用熒光定量PCR試劑盒(Vazyme ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix Q711-02/03)進行熒光定量PCR。將cDNA按照1∶20稀釋，20 μL反應體系：10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，1 μL正向引物，1 μL反向引物和3 μL RNase-Free ddH2O，5 μL模板cDNA；以β-actin為內參基因，引物序列詳見表1。miRNA 定量采用 Stem-loop 方法進行，所用引物為miRNA 正向引物與通用反向引物(Stem-loop_U)；其他基因定量引物為該基因對應的正向和反向引物。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。實時熒光定量PCR在CFX 96 Real Time System上進行，所有樣品均設置 3次重復，相對表達量用2-ΔΔCt方法計算。

1.3.3 籽粒激素含量測定 設置RIGOL L3000高效液相色譜儀波長為254 nm，色譜柱為RIGOL C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min，進樣體積10 μL，1%乙酸水溶液與甲醇(流動相)的體積比為 6∶4。稱取約0.15 g籽粒，經(jīng)前處理后，取適量溶液用針頭式過濾器過濾于帶有內襯管的樣品瓶內，進行籽粒中吲哚乙酸(IAA)和玉米素+玉米素核苷(Z+ZR)含量的測定。精確稱取IAA、ZA和ZR標準品，分別用甲醇溶解配制1 mg/mL的貯備液，逐級稀釋配制出6個不同質量濃度(0.01～2.00 μg/mL)的標準溶液，按上述色譜條件依次檢測各標準溶液的峰面積，以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線計算得到籽粒中IAA和Z+ZR的含量。

1.3.4 考種及測產(chǎn) 于成熟期在每小區(qū)隨機選取具有平均有效穗數(shù)的5株稻株，放在室內自然風干。考種內容包括強弱勢籽粒千粒質量、穗數(shù)、結實率、穗粒數(shù)。另每小區(qū)隨機選取3 m2用于測產(chǎn)，3次重復。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均采用Excel 2016和IBM SPSS Statistics 25.0進行整理及分析。

2 結果與分析

2.1 灌漿充實調節(jié)劑對水稻產(chǎn)量構成因素和產(chǎn)量的影響

由表2可知，T1和T2處理的產(chǎn)量分別比對照高0.56，0.51 t/hm2，分別顯著增產(chǎn)5.03%,4.58%(P<0.05)。分析產(chǎn)量構成因素可知，T1和T2處理的結實率分別比對照顯著高6.96,4.06百分點(P<0.05)；T1處理的強勢籽粒千粒質量比對照高出1.50%，而T2處理的強勢籽粒千粒質量比對照降低1.20%，但差異均未達到顯著水平；T1和T2處理的弱勢籽粒千粒質量分別比對照顯著高出16.07%，15.89%(P<0.05)。

表2 灌漿充實調節(jié)劑對水稻產(chǎn)量構成因素和產(chǎn)量的影響Tab.2 Effects of the grain filling regulators on rice yield components and yield

2.2 灌漿充實調節(jié)劑對水稻強弱勢籽粒灌漿動態(tài)的影響

由圖1可知，各處理強勢籽粒千粒質量快速增加，隨后逐漸趨于穩(wěn)定，T1和T2處理基本在花后15 d達到最大值，均比對照先達到最大值?；ê? d T2處理的強勢籽粒千粒質量比對照顯著高17.58%(P<0.05)。T1和T2處理強勢籽粒的最大灌漿速率分別比對照顯著高105.77%，97.60%(P<0.05)。弱勢籽粒千粒質量隨籽粒灌漿進程基本呈逐漸增加的變化趨勢，在花后42 d T1和T2處理的弱勢籽粒千粒質量分別比對照高2.05，1.75 g，分別顯著增加了12.76%,10.92%(P<0.05)。隨著籽粒灌漿進程，弱勢籽粒灌漿速率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

圖1 灌漿充實調節(jié)劑對水稻強、弱勢籽粒千粒質量及灌漿速率的影響Fig.1 The effects of the grain filling regulators on the 1000-grain weight and the grain filling rate of superior and inferior spikelets of rice

由表3可知，T1和T2處理顯著提高了弱勢籽粒的灌漿起始勢；T1處理的弱勢籽粒最大灌漿速率和平均灌漿速率均高于T2處理，且2個處理均顯著高于對照(P<0.05)；T1和T2處理顯著縮短了弱勢籽粒活躍灌漿期(P<0.05)，表現(xiàn)為T1、T2、CK依次延長。

表3 灌漿充實調節(jié)劑處理下水稻弱勢籽粒灌漿過程的Richards方程特征參數(shù)Tab.3 Grain-filling Richards equation parameters for inferior spikelets of rice under the grain filling regulators

2.3 灌漿充實調節(jié)劑對水稻弱勢籽粒中miRNA及其靶基因相對表達量的影響

由圖2可知，T1處理顯著抑制花后6 d弱勢籽粒中miR167a-c、miR167d-j和miR1432的表達，分別比對照下調46.65%，44.28%和74.89%，顯著促進靶基因OsARF12和OsACOT的表達(P<0.05)，分別比對照上調51.85%，45.39%；T1處理顯著抑制花后12 d弱勢籽粒中miR167a-c的表達，比對照顯著下調46.12%(P<0.05)；T1處理顯著抑制花后21 d弱勢籽粒中miR167a-c、miR167d-j、miR1432的表達，分別比對照顯著下調36.15%，49.50%，62.85%(P<0.05)，促進miR1432靶基因OsACOT的表達。T2處理顯著抑制花后6 d弱勢籽粒中miR167a-c、miR167d-j、miR1432的表達，分別比對照顯著下調30.66%，46.89%，49.12%(P<0.05)，促進其靶基因OsARF12、OsACOT的表達，且OsACOT上調顯著，比對照顯著上調56.33%(P<0.05)；T2處理抑制花后12 d弱勢籽粒中miR167a-c的表達，促進miR167a-c靶基因OsARF12的表達；T2處理抑制花后21 d弱勢籽粒中miR167a-c、miR167d-j和miR1432的表達，且miR167a-c和miR1432下調顯著，分別比對照下調25.59%，46.33%，顯著促進miR1432靶基因OsACOT的表達(P<0.05)，比對照上調65.11%。

不同字母代表同一開花后時間不同處理間的差異顯著(P<0.05)。圖3—5同。The different letters represent the significant difference among different treatments in the same days after flowering(P<0.05).The same as Fig.3—5.

2.4 灌漿充實調節(jié)劑對水稻弱勢籽粒灌漿啟動關鍵信號蛋白基因表達量的影響

由圖3可知，T1處理弱勢籽粒中OsGLP3的表達量在花后6，21 d顯著上調，分別比對照顯著上調了26.94%，70.46%(P<0.05)；OsGF14f和OsGF14b的表達量在花后12 d與對照相比顯著下調了19.54%，30.48%(P<0.05)。T2處理弱勢籽粒中OsGLP3的表達量在花后6，12，21 d顯著上調(P<0.05)，分別比對照上調了175.69%，14.91%，98.71%；OsGF14b的表達量在花后6，12 d顯著下調，分別比對照下調了45.22%，23.82%(P<0.05)；OsGF14f的表達量在花后12 d與對照相比顯著下調了11.88%(P<0.05)。

圖3 灌漿充實調節(jié)劑對水稻弱勢籽粒灌漿啟動關鍵信號蛋白基因表達量的影響Fig.3 Effects of the grain filling regulators on the gene expression level of key signal proteins of filling initiation in inferior spikelets of rice

2.5 灌漿充實調節(jié)劑對水稻弱勢籽粒中蔗糖-淀粉代謝關鍵酶基因表達量的影響

由圖4可知，T1處理顯著提高了花后6，12 d弱勢籽粒中OsSUS3和OsGBSSⅠ的表達量，OsSUS3的表達量分別比對照顯著上調了619.92%,45.40%(P<0.05)，OsGBSSⅠ的表達量分別比對照顯著上調了818.28%,27.18%(P<0.05)；OsAGPS2的表達量在花后6，12，21 d上調，其中在花后6 d比對照顯著上調了87.08%(P<0.05)。T2處理顯著提高了花后6，12，21 d弱勢籽粒中OsAGPS2和OsGBSSⅠ的表達量，OsAGPS2的表達量分別比對照顯著上調了256.04%，27.20%，473.08%(P<0.05)，OsGBSSⅠ的表達量分別比對照顯著上調了133.39%，14.36%，567.16%(P<0.05)；OsSUS3在花后6，12 d上調，且在花后6 d比對照顯著上調了1 565.51%(P<0.05)。

圖4 灌漿充實調節(jié)劑對水稻弱勢籽粒中蔗糖-淀粉代謝關鍵酶基因表達量的影響Fig.4 Effects of the grain filling regulators on the gene expression level of key enzymes of sucrose-starch metabolism in inferior spikelets of rice

2.6 灌漿充實調節(jié)劑對水稻弱勢籽粒中IAA和Z+ZR含量的影響

由圖5可知，T1和T2處理顯著提高花后9，21 d弱勢籽粒中Z+ZR含量(P<0.05)，增加的幅度分別為29.55%和7.47%，4.34%和26.54%。T1和T2處理IAA含量在花后9，15，21 d均顯著高于對照(P<0.05)，增加幅度分別為126.19%和222.20%，9.70%和1.90%，34.62%和101.19%。

圖5 灌漿充實調節(jié)劑對水稻弱勢籽粒中Z+ZR和IAA含量的影響Fig.5 Effects of the grain filling regulators on the contents of Z+ZR and IAA in inferior spikelets of rice

2.7 相關性分析

由圖6可知，弱勢籽粒的灌漿速率與其中的miR1432(R2=0.463 2，P<0.01)和OsGF14f(R2=0.157 2，P<0.05)表達量呈顯著負相關關系，而與其中的IAA含量(R2=0.268 1，P<0.05)呈顯著正相關關系。

圖6 水稻弱勢籽粒灌漿速率與miR1432、OsGF14f表達量及IAA含量的相關性Fig.6 Correlation between the filling rate and the expressions of miR1432，OsGF14f，and the content of IAA in inferior spikelets of rice

3 結論與討論

miRNA是一類長度為18～24個堿基的非編碼小RNA[24]，已有研究證明，水稻籽粒灌漿過程中差異表達的miRNA通過調控其靶基因在灌漿充實中發(fā)揮重要作用。Peng等[3]采用 STTM 技術在水稻中低表達 miR167，其下游靶基因OsARFs的表達量顯著上調，轉基因水稻籽粒的粒長、粒寬和粒質量分別增加6.94%，6.46%和26.31%。Zhao等[4]研究結果表明，miR1432負調控靶基因OsACOT，低表達 miR1432和過量表達抗 miR1432 切割版本靶基因OXmACOT，轉基因植株籽粒的千粒質量分別增加18.88%～20.28%和38.92%～46.70%，粒長分別增加8.03%～10.54%和15.87%～19.24%，粒寬分別增加4.76%～6.72%和6.89%～7.30%。本研究發(fā)現(xiàn)，禾立豐和新美洲星處理顯著提高大穗型水稻交源優(yōu)216弱勢籽粒的千粒質量和結實率，抑制花后6 d弱勢籽粒中miR167a-c、miR167d-j和花后6，21 d弱勢籽粒中miR1432的表達，促進其靶基因OsARF12和OsACOT的表達，且相關分析結果表明，弱勢籽粒的灌漿速率與miR1432的表達量呈極顯著負相關關系。因此，灌漿充實調節(jié)劑禾立豐和新美洲星可能通過抑制灌漿前中期弱勢籽粒中miR167、miR1432的表達，進而調節(jié)灌漿充實，增加弱勢籽粒千粒質量和結實率。

弱勢籽粒胚乳細胞分裂停滯與灌漿早期低豐度表達的GLP有關[6]，本研究發(fā)現(xiàn)，禾立豐和新美洲星處理顯著促進花后6 d弱勢籽粒中編碼GLP基因OsGLP3的表達。You等[25]去除穗頂部的強勢籽粒后，發(fā)現(xiàn)弱勢籽粒中14-3-3蛋白表達量顯著下調，進而提高弱勢籽粒的千粒質量和結實率。張志興等[5，26]通過構建胚乳特異性轉基因水稻植株發(fā)現(xiàn)，在灌漿期特異減少胚乳中14-3-3蛋白亞型GF14f的表達，顯著促進弱勢籽粒灌漿；灌漿期分別噴施外源植物激素(ABA、IAA、GA、ZT和BR)后發(fā)現(xiàn)，籽粒中14-3-3蛋白家族成員GF14b上調表達，而GF14b通過蛋白互作的形式負調控淀粉合成代謝相關基因的表達。本研究發(fā)現(xiàn)，禾立豐和新美洲星處理顯著抑制花后12 d弱勢籽粒中編碼14-3-3蛋白的基因OsGF14b和OsGF14f的表達，且相關分析結果表明，弱勢籽粒的灌漿速率與籽粒中OsGF14f的表達量呈顯著負相關關系。因此，灌漿充實調節(jié)劑禾立豐和新美洲星可能通過促進GLP蛋白、抑制14-3-3蛋白的表達，進而提高弱勢籽粒灌漿起始勢，促進大穗型水稻弱勢籽粒的灌漿充實。

已有研究證明，水稻籽粒中蔗糖合成酶(SuSase)、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)和淀粉合成酶(StSase)等的活性與灌漿速率呈極顯著正相關關系[27]，較高水平的IAA和Z+ZR含量可能促進維持灌漿進程，促進弱勢籽粒灌漿充實[13，28]。本研究發(fā)現(xiàn)，禾立豐和新美洲星處理促進花后6，12 d弱勢籽粒中蔗糖-淀粉代謝關鍵酶基因OsSUS3、OsAGPS2和OsGBSSⅠ的表達，顯著提高弱勢籽?；ê?，21 d的Z+ZR含量，花后9，15，21 d的IAA含量，且相關分析結果表明，弱勢籽粒的灌漿速率與籽粒中IAA的含量呈顯著正相關關系。因此，灌漿充實調節(jié)劑禾立豐和新美洲星可能通過調節(jié)灌漿前中期弱勢籽粒蔗糖-淀粉代謝關鍵酶基因和內源激素的含量，進而提高弱勢籽粒的灌漿速率和粒質量。

綜上，禾立豐和新美洲星這2種灌漿調節(jié)劑可能是通過調節(jié)灌漿前中期灌漿充實相關miRNA及靶基因、編碼灌漿充實相關蛋白和蔗糖-淀粉代謝關鍵酶基因表達量，提高激素IAA和Z+ZR含量，促進弱勢籽粒灌漿充實，增加水稻產(chǎn)量。