基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的丹紅化瘀口服液治療視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥的作用機(jī)制研究

林 娟，韓彥琪，武 琦，許 浚，劉耀晨，張傳平，李楚源*，張鐵軍

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的丹紅化瘀口服液治療視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥的作用機(jī)制研究

林 娟1，韓彥琪2, 3#，武 琦4，許 浚2, 3, 5，劉耀晨6，張傳平1，李楚源1*，張鐵軍2, 3*

1. 廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東 廣州 510515 2. 天津藥物研究院 天津市中藥質(zhì)量標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462 3. 天津藥物研究院 釋藥技術(shù)與藥物代謝動(dòng)力學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462 4. 康龍化成（北京）生物技術(shù)有限公司，北京 100176 5. 天津藥物研究院 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物代謝新技術(shù)創(chuàng)新單元，天津 300462 6. 天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究丹紅化瘀口服液治療視網(wǎng)膜靜脈中央阻塞癥的作用機(jī)制。選取丹紅化瘀口服液中的21個(gè)入血成分為研究對(duì)象，借助TCMSP和CTD數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)化合物的作用靶點(diǎn)，利用MAS 3.0生物分子功能軟件獲取相關(guān)通路，通過(guò)FUNRICH軟件對(duì)獲得靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析，最后利用Cytoscape軟件構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。21個(gè)成分可作用于104個(gè)蛋白靶點(diǎn)和45條通路，其中多個(gè)靶點(diǎn)和通路與視網(wǎng)膜靜脈中央阻塞癥相關(guān)。丹紅化瘀口服液通過(guò)作用于與凝血過(guò)程、新血管生成、血管舒張、免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)等相關(guān)的靶點(diǎn)，起到活血化瘀、行氣通絡(luò)的功效，從而治療視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥。

丹紅化瘀口服液；視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；活血化瘀；行氣通絡(luò)

視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥（central retinal vein occlusion，CRVO）是視網(wǎng)膜中央靜脈的主干或其分支發(fā)生血栓或阻塞的視網(wǎng)膜血管病，臨床以視力驟降、視網(wǎng)膜靜脈紆曲擴(kuò)張、視網(wǎng)膜出血為特征。丹紅化瘀口服液以丹參、川芎、當(dāng)歸、桃仁、紅花、柴胡、枳殼組方入藥，可活血化瘀、行氣通絡(luò)，用于氣滯血瘀引起的視物不清、突然不見(jiàn)癥和CRVO的吸收期[1-2]。孫建國(guó)等[3]在研究丹紅化瘀口服液治療非增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變絡(luò)脈瘀阻證患者時(shí)，發(fā)現(xiàn)其能提高患者視力，減輕黃斑水腫，改善眼底循環(huán)障礙，并能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素蛋白-3（angiopoietin protein-3，ANGPT-3）、ANGPT-4、促血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）、Ang-2等血管生成調(diào)節(jié)因子，抑制新生血管生成，延緩病情發(fā)展。符郁等[4]發(fā)現(xiàn)，丹紅化瘀口服液能下調(diào)房水中VEGF和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平，下調(diào)血清VEGF、TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）和可溶性細(xì)胞間黏附分子-1（soluble intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）水平，從而抑制新生血管形成、減輕炎癥損傷及黃斑水腫，起到改善CRVO患者視力的作用。雖然已有臨床應(yīng)用表明丹紅化瘀口服液對(duì)CRVO治療效果良好，但目前對(duì)于其系統(tǒng)的作用機(jī)制研究較為匱乏，且口服液物質(zhì)體系復(fù)雜，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用靶點(diǎn)之間存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，單靠傳統(tǒng)單靶點(diǎn)的研究思路具有一定的局限性，因此本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[5]的思路從多靶點(diǎn)的研究策略出發(fā)，探索其治療CRVO的作用機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)及多向藥理學(xué)等學(xué)科理論，運(yùn)用組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)可視化等技術(shù)[6]，超越單靶點(diǎn)思想的束縛，從藥物、靶點(diǎn)與疾病相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā)，分析藥物在網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點(diǎn)或網(wǎng)絡(luò)模塊的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)藥物作用的綜合網(wǎng)絡(luò)分析[7]。因此，本研究以丹紅化瘀口服液的入血活性成分為研究對(duì)象，從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度，闡釋丹紅化瘀口服液多成分、多靶點(diǎn)、多途徑治療CRVO的科學(xué)內(nèi)涵，為進(jìn)一步作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)

ChemBioOffice 2010；TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）；CTD數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ctdbase.org/）；UNIPROT數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www. uniprot.org/）；生物分子功能注釋系統(tǒng)（molecule annotation system，MAS 3.0）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bioinfo. capitalbio.com/mas3/analysis/）；String 10數(shù)據(jù)庫(kù)（http://string-db.org/）；Cytoscape 3.6.1軟件；FUNRICH（function enrichment analysis tool）3.1.3軟件。

1.2 方法

1.2.1 目標(biāo)化合物的選取 本課題組前期鑒定出丹紅化瘀口服液中55個(gè)化學(xué)成分，并篩選出血中移行的原型藥物成分26個(gè)、代謝物11個(gè)[8]。在此實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)的挖掘、整理，選取了包括丹參酮類、丹酚酸類、有機(jī)酸類、苯酞類、生物堿類、黃酮類、皂苷類、萜類等結(jié)構(gòu)類型在內(nèi)的21個(gè)成分為研究對(duì)象，通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取其口服生物利用度（oral bioavailability，OB），具體化合物信息見(jiàn)表1。

1.2.2 潛在靶點(diǎn)篩選分析 將21個(gè)化合物輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)、CTD數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取化合物的相關(guān)靶點(diǎn)信息。然后，使用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中UniProtKB搜索功能，通過(guò)輸入蛋白名稱并限定物種為“human”，將檢索得到的所有蛋白校正為其官方名稱。整合CTD和TCMSP靶點(diǎn)結(jié)果，得到化合物潛在作用靶點(diǎn)庫(kù)。通過(guò)數(shù)據(jù)分析及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，篩選與CRVO相關(guān)的蛋白靶點(diǎn)。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 運(yùn)用FUNRICH軟件對(duì)整合的蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行生物過(guò)程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組分（cellular component，CC）的基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析。同時(shí)，運(yùn)用Cytoscape 3.6.1軟件的ClueGO插件，對(duì)篩選到的蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行GO的BP分析。

表1 21個(gè)化合物信息

Table 1 Information of 21 compounds

編號(hào)中文名結(jié)構(gòu)類型OB/%分子式來(lái)源 1隱丹參酮丹參酮類52.34C19H20O3丹參丹參丹參丹參丹參 2丹參酮IIA49.89C19H18O3 3丹酚酸D丹酚酸類1.57C20H18O10 4丹參素有機(jī)酸類36.91C9H10O5 5原兒茶醛38.35C7H6O3 6藁本內(nèi)酯苯酞類53.72C12H14O2川芎、當(dāng)歸川芎、當(dāng)歸 7洋川芎內(nèi)酯I46.80C12H16O4 8川芎嗪生物堿類20.01C8H12N2川芎 9綠原酸有機(jī)酸類13.61C16H18O9川芎、當(dāng)歸 10阿魏酸40.43C10H10O4川芎、當(dāng)歸、柴胡 11苦杏仁苷氰苷4.42C20H27NO11桃仁 12紅花黃色素A查耳酮類22.75C27H30O16紅花 13槲皮素黃酮類46.43C15H10O7紅花、柴胡 14柴胡皂苷A皂苷類32.39C42H68O13柴胡柴胡 15丁香酚單萜類56.24C10H12O2 17檸檬烯39.84C10H16枳殼、柴胡 16柚皮苷黃酮類6.92C27H32O14枳殼枳殼枳殼枳殼枳殼 18芳樟醇揮發(fā)油類58.18C10H18O 19辛弗林生物堿類79.00C9H13NO2 20馬爾敏香豆素類38.23C19H24O5 21檸檬苦素三萜皂苷類21.30C26H30O8

1.2.4 信號(hào)通路分析 將整合的蛋白靶點(diǎn)編號(hào)導(dǎo)入MAS 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)，得到與靶點(diǎn)相關(guān)的通路過(guò)程，再利用京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)得到的通路進(jìn)行深入分析。

1.2.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)丹紅化瘀口服液化合物靶點(diǎn)及通路的分析結(jié)果，在Excel表格中建立化合物-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)-通路、靶點(diǎn)-藥理作用、藥理作用-功效的相互對(duì)應(yīng)關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，構(gòu)建丹紅化瘀口服液網(wǎng)絡(luò)圖，然后應(yīng)用其Network Analyzer插件計(jì)算分析網(wǎng)絡(luò)特征。

2 結(jié)果

2.1 化合物潛在靶點(diǎn)及通路分析結(jié)果

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)的查閱，對(duì)得到的蛋白靶點(diǎn)和通路進(jìn)行綜合分析，共得到蛋白作用靶點(diǎn)104個(gè)（表2），作用通路45條（表3）。其中大量靶點(diǎn)與丹紅化瘀口服液治療CRVO有密切關(guān)系，分類如下。

（1）與血栓形成相關(guān)的蛋白：凝血因子Ⅹa（coagulation factor Ⅹa，F(xiàn)10）、凝血酶（thrombin，F(xiàn)2）、凝血因子VII（coagulation factor VII，F(xiàn)7）、血栓素A合酶（thromboxane A synthase，TBXAS1）、前列腺素G/H合酶1（prostaglandin G/H synthase 1，PTGS1）、PTGS2、磷酸二酯酶3A（phosphodiesterase 3A，PDE3A）等。

表2 104個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)蛋白信息

Table 2 Information of 104 related protein targets

UniProtKB靶點(diǎn)UniProtKB靶點(diǎn) Q92887ABCC2P05112IL4 P22303ACHEP05231IL6 P35348ADRA1AP10145IL8 P35368ADRA1BP08514ITGA2B P25100ADRA1DP05106ITGB3 P08913ADRA2AP05412JUN P18089ADRA2BQ12809KCNH2 P18825ADRA2CP09960LTA4H P08588ADRB1P21397MAOA P07550ADRB2P27338MAOB P02768ALBP28482MAPK1 P09917ALOX5P14780MMP9 Q07812BAXP05164MPO P06276BCHEP15941MUC1 Q07817BCL2Q15596NCOA2 Q07817BCL2L1P21359NF1 P00915CA1P25963NFKBIA P00918CA2Q9GZQ4NMUR2 Q16602CALCRLP35228NOS2 P0DP23CALM1P29474NOS3 P42574CASP3P01160NPPA P51671CCL11Q9UKK6NXT1 P42081CD86P41143OPRD1 P46527CDKN1BP35372OPRM1 P11229CHRM1Q14432PDE3A P08172CHRM2P48736PIK3CG P20309CHRM3P00750PLAT P08173CHRM4P00749PLAU P08912CHRM5P37231PPARG P08684CYP3A4P17612PRKACA P27487DPP4P10644PRKAR1A P21728DRD1P07477PRSS1 P42892ECE1P43115PTGER3 P05305EDN1P23219PTGS1 P15692EGFP35354PTGS2 P00533EGFRP04049RAF1 P34913EPHX2Q13972RASGRF1 P00742F10P06400RB1 P00734F2Q04206RELA P08709F7Q14524SCN5A P14867GABRA1P05121SERPINE1 P47869GABRA2P23975SLC6A2 P34903GABRA3Q01959SLC6A3 P31644GABRA5P31645SLC6A4 Q16445GABRA6P00441SOD1 P08238HSP90AB1P24557TBXAS1 P04792HSPB1P07204THBD P01579IFNGP01033TIMP1 P01876IGHA1P01375TNF P22301IL10Q8NET8TRPV3 P01584IL1BP19320VCAM1 P60568IL2P15692VEGFA

表3 45條相關(guān)通路信息

Table 3 Information of 45 related pathways

通路基因數(shù)P值通路基因數(shù)P值 neuroactive ligand-receptor interaction266.37×10?36mTOR signaling pathway32.19×10?4 calcium signaling pathway151.65×10?19adipocytokine signaling pathway34.63×10?4 apoptosis111.21×10?16p53 signaling pathway35.05×10?4 T cell receptor signaling pathway111.23×10?15drug metabolism-cytochrome P45035.72×10?4 regulation of actin cytoskeleton132.89×10?15long-term potentiation36.44×10?4 Toll-like receptor signaling pathway103.43×10?14TGF-β signaling pathway39.92×10?4 MAPK signaling pathway135.76×10?14phenylalanine metabolism20.001 102 cytokine-cytokine receptor interaction128.15×10?13nitrogen metabolism20.001 313 focal adhesion111.37×10?12urea cycle and metabolism of amino groups20.001 787 complement and coagulation cascades72.12×10?10linoleic acid metabolism20.002 051 VEGF signaling pathway74.24×10?10histidine metabolism20.002 189 ErbB signaling pathway71.11×10?9leukocyte transendothelial migration30.002 552 gap junction71.78×10?9arginine and proline metabolism20.002 944 epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection61.23×10?8glycine, serine and threonine metabolism20.004 178 B cell receptor signaling pathway61.87×10?8tryptophan metabolism20.004 178 hematopoietic cell lineage64.58×10?8tyrosine metabolism20.004 972 Jak-STAT signaling pathway76.25×10?8cell cycle20.029 120 arachidonic acid metabolism51.89×10?7cell adhesion molecules (CAMs)20.036 177 insulin signaling pathway67.12×10?7ABC transporters-General10.093 472 natural killer cell mediated cytotoxicity67.12×10?7glycerophospholipid metabolism10.142 671 Fc epsilon RI signaling pathway59.81×10?7PPAR signaling pathway10.144 583 GnRH signaling pathway54.40×10?6antigen processing and presentation10.180 119 long-term depression42.01×10?5

（2）與新血管生成相關(guān)的蛋白：VEGFA、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等。

（3）與舒張血管相關(guān)的蛋白：內(nèi)皮型一氧化氮合酶3（endothelial nitric-oxide synthase 3，NOS3）、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶1（endothelin-converting enzyme 1，ECE1）、電壓門控鉀通道亞族H2蛋白（potassium voltage-gated channel subfamily H member 2，KCNH2）、α1A腎上腺素受體（α1A adrenergic receptor，ADRA1A）、ADRA1B、β2腎上腺素受體（β2 adrenergic receptor，ADRB2）等。

（4）與免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白：花生四烯酸5-脂氧合酶（arachidonate 5-lipoxygenase，ALOX5）、前列腺素受體3（prostaglandin E2 receptor EP3 subtype，PTGER3）、T-淋巴細(xì)胞活化抗原CD86（T-lymphocyte activation antigen CD86，CD86）、γ干擾素（interferon γ，IFNG）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、白三烯A-4水解酶（leukotriene A-4 hydrolase，LTA4H）等。

2.2 生物信息學(xué)分析結(jié)果

利用FUNRICH軟件對(duì)104個(gè)蛋白靶點(diǎn)在CC、MF和BP 3方面進(jìn)行GO功能富集分析。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)（比例分布見(jiàn)圖1～3），這些靶點(diǎn)在CC方面主要參與血小板α顆粒內(nèi)腔、IL-6受體復(fù)合物、電壓門控鉀通道復(fù)合物等過(guò)程；在MF方面主要參與G蛋白偶連受體活性、過(guò)氧物酶活性、生長(zhǎng)因子活性等過(guò)程；在BP方面主要參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答、神經(jīng)遞質(zhì)代謝、離子通道等過(guò)程。進(jìn)一步運(yùn)用Cytoscape 3.6.1的ClueGO插件，構(gòu)建生物過(guò)程的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要富集在正向調(diào)節(jié)血管直徑、凝血調(diào)節(jié)、VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮增長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路、正向調(diào)節(jié)IL-6的生物合成、激活T細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)血管平滑肌收縮等BP中，涉及與血栓形成、新血管生成、舒張血管、免疫炎癥反應(yīng)等方面，推測(cè)丹紅化瘀口服液治療CRVO可能與以上過(guò)程相關(guān)。

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“化合物-靶點(diǎn)”“靶點(diǎn)-通路”對(duì)應(yīng)關(guān)系表導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件中構(gòu)建得到丹紅化瘀口服液的“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖（圖5）。對(duì)丹紅化瘀口服液藥物-靶蛋白-通路網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)屬性分析發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)度分布服從冪分布，說(shuō)明丹紅化瘀口服液網(wǎng)絡(luò)屬于無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)。特征路徑長(zhǎng)度3.406，即網(wǎng)絡(luò)路徑長(zhǎng)度為3步，表明大多數(shù)蛋白聯(lián)系非常密切，該網(wǎng)絡(luò)具有較快的傳播速度和較小的反應(yīng)時(shí)間，具有小世界性質(zhì)。網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為0.035，平均相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)目為5.892，網(wǎng)絡(luò)中心度為0.202，提示丹紅化瘀口服液網(wǎng)絡(luò)具有無(wú)標(biāo)度、小范圍的體系結(jié)構(gòu)。

圖1 CC比例分布圖

圖2 MF比例分布圖

圖3 BP比例分布圖

進(jìn)一步將“化合物-靶點(diǎn)”“靶點(diǎn)-藥理作用”“藥理作用-疾病”對(duì)應(yīng)關(guān)系表導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件中得到丹紅化瘀口服液治療CRVO的“化合物-靶點(diǎn)-藥理作用-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖（圖6）。

圖4 丹紅化瘀口服液潛在靶點(diǎn)的BP網(wǎng)絡(luò)

黃色：通路；藍(lán)色：靶點(diǎn)；紅色：化學(xué)成分

圖6 丹紅化瘀口服液“化合物-靶點(diǎn)-藥理作用-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

CRVO為機(jī)體的血液流變學(xué)水平異常引起眼底微循環(huán)障礙，管內(nèi)形成血栓和血管增生，進(jìn)而發(fā)展為視網(wǎng)膜出血、黃斑水腫[9]。目前認(rèn)為，血液黏稠度增高、纖維蛋白原水平升高等是CRVO發(fā)病的最直接因素。中醫(yī)認(rèn)為，“氣滯血瘀”為本病的病理病機(jī)?？傊?，活血化瘀主導(dǎo)了CRVO的整個(gè)病理過(guò)程，是該病的治療關(guān)鍵。因此，在網(wǎng)絡(luò)藥理研究中，重點(diǎn)關(guān)注了與血栓形成（凝血過(guò)程、血小板聚集、纖溶系統(tǒng)）及新血管生成、舒張血管、免疫炎癥等相關(guān)過(guò)程進(jìn)行研究。

3.1 丹紅化瘀口服液抑制血栓形成過(guò)程

CRVO的病理過(guò)程為眼底微循環(huán)障礙，進(jìn)而視網(wǎng)膜靜脈迂曲擴(kuò)張，血流變慢甚至停滯，纖維蛋白原、血小板、紅細(xì)胞不斷沉積，形成管內(nèi)血栓。凝血過(guò)程為凝血因子X(jué)激活凝血酶原激活物[Ⅹa、V、Ca2+和PF3（血小板第3因子）復(fù)合物]，然后Ⅹa將凝血酶原水解為凝血酶，在凝血酶的作用下，溶于血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白單體，形成血栓[10]。通過(guò)分析網(wǎng)絡(luò)藥理結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹紅化瘀口服液中槲皮素、丹參酮IIA、丹酚酸D、紅花黃色素A、川芎嗪等化合物可作用于與血栓形成相關(guān)的蛋白如：F10、F7（輔助促凝血酶原激酶）、F2、TBXAS1、PTGS1、PTGS2、纖溶酶原激活物抑制劑1、組織型纖溶酶原激活物、尿激酶型纖溶酶原激活物等。研究表明，丹參酮IIA能抑制F2的活化，促進(jìn)纖維蛋白降解，抑制血栓形成[10]；紅花黃色素能顯著抑制家兔血小板聚集，并對(duì)血小板聚集有解聚作用[11]；川芎嗪可通過(guò)抑制血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）合成酶以及增強(qiáng)前列環(huán)素（prostacyclin，PGI2，血栓素的對(duì)抗劑）樣物質(zhì)來(lái)抑制血小板聚集和抗血栓[12]。因此，丹紅化瘀口服液可能是通過(guò)抑制凝血過(guò)程和血小板活化及影響纖溶系統(tǒng)，從而減少血瘀生成，起到治療作用。

3.2 丹紅化瘀口服液抑制新血管生成

缺血型CRVO患者的視網(wǎng)膜發(fā)生缺血時(shí)，會(huì)產(chǎn)生VEGF，形成新生血管。VEGF是CRVO患者形成新生血管的最強(qiáng)因子，它能通過(guò)與受體結(jié)合而增加血管通透性，引起視網(wǎng)膜滲出、出血，誘導(dǎo)血管生成素增加；并刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，這些因素都可促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管的形成[13]。網(wǎng)絡(luò)藥理結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹紅化瘀口服液中的隱丹參酮、丹參酮IIA、川芎嗪、丹酚酸D、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯、綠原酸、阿魏酸、苦杏仁苷可作用于VEGFA、EGFR等與血管生成有關(guān)的蛋白，參與調(diào)節(jié)VEGF信號(hào)通路等。文獻(xiàn)報(bào)道[14]，丹參酮IIA、隱丹參酮能抑制VEGF或其受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）的表達(dá)，降低視網(wǎng)膜血管通透性，保護(hù)血-視網(wǎng)膜屏障，從而抑制新血管生成；川芎嗪能直接抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，抑制VEGF在視網(wǎng)膜組織中的過(guò)度表達(dá)[15]。推測(cè)丹紅化瘀口服液可通過(guò)抑制新生血管生成來(lái)抑制CRVO的病情發(fā)展。

3.3 丹紅化瘀口服液舒張血管作用

中醫(yī)理論認(rèn)為，氣滯為臟腑、經(jīng)絡(luò)之氣阻滯不暢，氣為血帥，一般由氣的運(yùn)行不暢，然后引起血液的運(yùn)行瘀滯，由氣滯而導(dǎo)致血瘀[16]。舒張血管平滑肌而使氣運(yùn)行暢達(dá)，則血流通暢。因此，在使用活血祛瘀藥時(shí)，常與理氣藥配伍，以增強(qiáng)行血散瘀的作用。內(nèi)皮素是迄今為止已知最強(qiáng)的血管收縮活性物質(zhì)，一氧化氮可通過(guò)舒張眼部微血管調(diào)節(jié)眼部血流量[17]，α受體拮抗劑可選擇性地阻斷與血管收縮有關(guān)的受體效應(yīng)，該類藥物在臨床上可用于改善微循環(huán)。網(wǎng)絡(luò)藥理預(yù)測(cè)表明，隱丹參酮、丹參酮IIA、原兒茶醛、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯、槲皮素、丁香酚、檸檬烯可干預(yù)KCNH2、內(nèi)皮素-1受體、ECE1、NOS3、ADRA1A、ADRA1B、ADRB2、M3乙酰膽堿受體等與血管平滑肌相關(guān)的蛋白。推測(cè)丹紅化瘀口服液可能是通過(guò)作用于血管平滑肌上的相關(guān)受體而舒張血管，行氣以行血來(lái)發(fā)揮治療目的。

3.4 丹紅化瘀口服液對(duì)炎癥免疫過(guò)程的影響

CRVO患者的視網(wǎng)膜會(huì)發(fā)生大面積缺血缺氧，低氧環(huán)境下視網(wǎng)膜毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)異常；同時(shí)由于管內(nèi)血栓形成，毛細(xì)血管內(nèi)壓力升高，血管通透性增加，毛細(xì)血管內(nèi)液體、蛋白質(zhì)和白細(xì)胞等滲出到組織間隙，造成視網(wǎng)膜滲出水腫，導(dǎo)致黃斑水腫的發(fā)生。花生四烯酸是許多二十烷酸衍生物的生物活性物質(zhì)，如前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、PGI2、TXA2和白三烯C4（leukotrienes，LTC4）的直接前體。PGE2是活性很強(qiáng)的炎癥因子，可擴(kuò)張小血管、增加微血管的通透性、致熱[18]。IL是指在白細(xì)胞或免疫細(xì)胞間相互作用的淋巴因子，在傳遞信息、激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞及在炎癥反應(yīng)中起重要作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹參素、丹參酮IIA、阿魏酸、綠原酸、槲皮素、苦杏仁苷、紅花黃色素A等通過(guò)作用于與免疫、炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白和通路，如ALOX5、PTGS2、CD86、IFNG、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、LTA4H，調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)傳導(dǎo)、花生四烯酸代謝、抗原的處理和表達(dá)等。研究發(fā)現(xiàn)[19]，槲皮素可間接抑制組胺、白三烯、前列腺素D等炎癥介質(zhì)釋放，抑制環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase-2，）mRNA和蛋白表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用；阿魏酸鈉通過(guò)調(diào)控p38 MAPKs通路，抑制細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β分泌和炎性介質(zhì)一氧化氮、PGE2合成來(lái)起抗炎作用[20]；丹參酮IIA可顯著減少細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8水平[21]。因此，推測(cè)丹紅化瘀口服液可能是通過(guò)干預(yù)花生四烯酸代謝等過(guò)程抑制炎癥因子釋放，促進(jìn)免疫應(yīng)答，從而發(fā)揮治療作用。

綜上，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析了來(lái)源于丹紅化瘀口服液的各類化合物可能的作用靶點(diǎn)及作用途徑，發(fā)現(xiàn)其廣泛作用于與血栓形成、新血管生成、舒張血管、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白及通路。其中既有1個(gè)分子與多個(gè)靶蛋白存在較強(qiáng)相互作用，也存在不同分子作用于同1個(gè)靶蛋白的現(xiàn)象，顯示了丹紅化瘀口服液的多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，初步闡釋了其治療CRVO的作用機(jī)制。但通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)得到的靶點(diǎn)及通路過(guò)程只是初步的預(yù)測(cè)結(jié)果且并不能反映量效關(guān)系，因此仍需后續(xù)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索和驗(yàn)證。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanisms of Danhong Huayu Oral Liquid in treatment of central retinal vein occlusion based on network pharmacology

LIN Juan1, HAN Yan-qi2, 3, WU Qi4, XU Jun2, 3, 5, LIU Yao-chen6, ZHANG Chuan-ping1, LI Chu-yuan1, ZHANG Tie-jun2, 3

1. Guangzhou Baiyunshan Hutchison Whampoa Chinese Medicine Co., Ltd., Guangzhou 510515, China 2. Tianjin Key Laboratory of Quality Marker of Traditional Chinese Medicine, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 3. State Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Pharmacokinetics, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 4. Pharmaron Beijing Co., Ltd., Beijing 100176, China 5. Research Unit for Drug Metabolism, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 6. Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China

To study the mechanisms of Danhong Huayu Oral Liquid (丹紅化瘀口服液) in the treatment of central retinal vein occlusion (CRVO) by network pharmacology.Twenty-one components absorbed into blood of Danhong Huayu Oral Liquid were selected as objects, targets were explored by TCMSP and CTD database and related pathways were obtained by MAS 3.0 software. The gene ontology (GO) functional analysis were explored by FUNRICH software. Finally, the network of “compound-target-pathway-disease” of Danhong Huayu Oral Liquid was constructed by Cytoscape software.Twenty-one components of Danhong Huayu Oral Liquid affected 45 pathways through 104 target proteins which were related to CRVO.Danhong Huayu Oral Liquid has the effect of promoting blood circulation and removing blood stasis, invigoratingand activating collaterals through acting on the targets related to coagulation process, neovascularization, vasodilation, immune regulation and inflammatory reaction, thereby treating CRVO.

Danhong Huayu Oral Liquid; central retinal vein occlusion; network pharmacology; promoting blood circulation to remove blood stasis; promotingcirculation to activate collaterals

R285.5

A

0253 - 2670(2022)06 - 1643 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.06.006

2021-09-15

廣州市珠江科技新星專項(xiàng)資助（201806010082）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目資助（2019-I2M-5-020）；廣州市科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)2019年“廣州市院士專家工作站”建設(shè)項(xiàng)目資助（600180）

林 娟（1986—），女，碩士，研究方向?yàn)橹谐伤幩幚砼c臨床研究。Tel: (020)66282359 E-mail: 578045600@qq.com

李楚源，正高級(jí)工程師，研究方向?yàn)橹兴幋笃贩N二次開(kāi)發(fā)。E-mail: 1226976234@qq.com

張鐵軍，研究員，研究方向?yàn)橹兴幮滤幯邪l(fā)及中藥大品種二次開(kāi)發(fā)。Tel: (022)23006848 E-mail: zhangtj@tjipr.com

#共同第一作者：韓彥琪（1989—），女，副研究員，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究。E-mail: hanyq@tjipr.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]