海菜花結(jié)合酚的組成、抗氧化活性及其對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用

劉 青，張?zhí)礻?yáng)，洪 玥，李媛麗，李 望，高春燕,2，盧躍紅,2,

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；2.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川 750021）

海菜花（Ottelia acuminata（Gagnep.）Dandy，O.acuminata），又稱異葉水車前、小海帶、龍爪菜等，系水鱉科，水車前屬[1]，沉水植物，生長(zhǎng)在池塘和淡水湖泊內(nèi)，喜溫暖；是云貴高原和中國(guó)西南地區(qū)特有的水生植物[2-3]，云南為海菜花的主要分布區(qū)。海菜花營(yíng)養(yǎng)豐富且齊全[4]，含多種礦物質(zhì)元素[5]，全株蛋白質(zhì)含量24.12%、脂肪含量7.14%、粗纖維含量8.43%[6]，游離酚提取物總酚含量為257.62～388.19 mg/g Extract[7]。在云南，海菜花是一種美味的食用蔬菜；同時(shí)也是一味傳統(tǒng)白族中藥，用于治小便不利、便秘、熱咳、咯血、哮喘、淋癥、水腫等多種疾病[8]；另外，海菜花還具有凈化水質(zhì)的作用[9]。海菜花是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的植物資源[10]。

植物多酚是植物中分布最廣的次生代謝產(chǎn)物之一，主要以結(jié)合酚和游離酚的形態(tài)存在，具有抗氧化活性[11]、抗炎活性[12-13]、抗菌活性[14]、抗腫瘤活性[15]、保護(hù)DNA損傷[16]、延緩衰老[17]、調(diào)節(jié)腸道微生物[18]等作用及功效。近幾年來(lái)，植物多酚的組成與功效引起了廣大科研工作者的極大興趣。

目前，海菜花在云南主要作為一種食用蔬菜大面積栽培[19]，對(duì)其研究大多集中在其生物學(xué)特性[20-24]、生態(tài)學(xué)保護(hù)利用方面[25-26]，而對(duì)其營(yíng)養(yǎng)組成、多酚的組成與功效方面的報(bào)道還比較少。本課題組2019年報(bào)道了海菜花游離酚提取物的多酚組成及部分功能活性[7]。本研究擬對(duì)海菜結(jié)合酚的組成、抗氧化活性以及對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用進(jìn)行研究，為海菜花的合理食用、藥用提供理論依據(jù)，對(duì)于海菜花的保護(hù)、利用、開(kāi)發(fā)以及促進(jìn)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海菜花 于2020年10月在云南省大理白族自治州大理市洱源縣鄧川鎮(zhèn)采集，將采集的海菜花分為花、莖、葉三部分，各部分樣品分別進(jìn)行除雜、清洗、冷凍干燥、粉粹，并密封儲(chǔ)存于4 ℃冰箱備用；福林-酚試劑、標(biāo)準(zhǔn)品（綠原酸、咖啡酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、木犀草素、阿魏酸）、pBR322質(zhì)粒DNA（0.5 μg/L）、DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）、Trolox 標(biāo)準(zhǔn)品（6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸）、ABTS（2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽） 美國(guó) Sigma試劑公司；沒(méi)食子酸（GaLLic-Acid） 成都市科龍化工試劑廠；乙腈和色譜甲醇美國(guó)Fisher公司；乙酸乙酯、濃鹽酸、乙醇等 為國(guó)產(chǎn)分析純。

RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；水浴震蕩（HZS-HA） 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；真空冷凍干燥機(jī)（Scientz-ND系列） 寧波新芝生物科技有限公司；722N可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；AgiLent 1260高相液相色譜儀（帶紫外檢測(cè)器）、色譜柱（ZORAAX SA-C18，5 μm，250 mm×4.6 mm） 美國(guó)AgiLent公司；DYY-6C型電泳儀北京市六一儀器廠；G:AOX-F3凝膠成像系統(tǒng) 基因有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 結(jié)合酚的提取與純化 參照郭琦等[27]的方法稍作修改，分別稱取花、莖、葉不同部位樣品5 g左右，用80%的甲醇提取3次后，殘?jiān)煤蠩DTA和抗壞血酸的NaOH溶液避光水解4 h，水解結(jié)束后調(diào)pH至1，抽濾，乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯后得結(jié)合酚粗提取液。粗提液用95%乙醇激活的X-5大孔樹(shù)脂水浴振蕩吸附24 h（25 ℃，120 r/min）后抽濾，收集大孔樹(shù)脂，加入70%乙醇，相同條件下水浴振蕩解析24 h，抽濾，收集濾液，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，真空冷凍干燥，得純化的結(jié)合酚提取物，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總酚含量測(cè)定 參照文獻(xiàn)[28]的方法稍作修改，分別吸取不同體積（80～320 μL）的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）加 100 μL 福林-酚試劑（1 mg/mL），混勻，3 min后，加2 mL 7.5% Na2CO3，純水定容至5 mL，避光反應(yīng)40 min后，于760 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度值。得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.0729C+0.062（R2=0.9916）。分別測(cè)定花、莖、葉結(jié)合酚提取物吸光度值，代入標(biāo)曲計(jì)算得到樣品中的總酚含量。樣品中的總酚含量以每克海菜花結(jié)合酚提取物中沒(méi)食子酸相當(dāng)?shù)馁|(zhì)量表示（mg GAE/g Extract）。

1.2.3 總黃酮含量測(cè)定 參照烏仁格格[29]的方法稍加修改。分別吸取不同體積（0.5～2.5 mL）的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）加甲醇補(bǔ)足至 2.5 mL，加 0.15 mL NaNO3（5%），搖勻靜置 6 min，加 0.15 mL AlCl3（10%），搖勻避光靜置 6 min，加 2 mL NaOH（4%），純水定容至5 mL，靜置15 min后，于510 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度值。得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=7.3829C+0.0161（R2=0.9978）。準(zhǔn)確吸取 100 μL海菜花結(jié)合酚（10 mg/mL），測(cè)定總黃酮含量。樣品中的總黃酮含量以每克海菜花提取物中兒茶素相當(dāng)?shù)馁|(zhì)量表示（mg CAE/g Extract）。

1.2.4 酚類化合物單體分析 采用高效液相色譜（HPLC）對(duì)結(jié)合酚的組成進(jìn)行分析。液相色譜條件：流速 0.8 mL/min，柱溫 37 ℃，進(jìn)樣量 10 μL，波長(zhǎng)280 nm；流動(dòng)相A為100%色譜乙腈，流動(dòng)相B為1%乙酸超純水溶液（乙酸/H2O，1/100，v/v）。梯度洗脫程序：0～11 min：A由 2%升至 17%，B由 98%降至 83%；11～17 min：A由 17%升至 24%，B由 83%降至76%；17～22 min：A由24%升至26%，B由76%降至 74%；22～28 min：A由 26%升至 28%，B由74%降至 72%；28～33 min：A由 28%降至 18%，B由72%升至82%；33～35 min：A由18%降至10%，B由82%升至90%；35～38 min：A由10%降至2%，B由90%升至98%。以綠原酸、咖啡酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、木犀草素、阿魏酸為標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)5個(gè)不同的濃度梯度（20.0、40.00、60.00、80.00、100.00 μg/mL），分別進(jìn)行HPLC分析，確定出峰時(shí)間及峰面積值。以標(biāo)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品用色譜甲醇稀釋成2.0 mg/mL，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，進(jìn)樣分析。將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別計(jì)算樣品中各單體酚的含量。

1.2.5 抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力 參照Tan等[30]的方法，稍加修改。將結(jié)合酚提取物用甲醇配制成35 μg/mL的溶液，吸取 0.5 mL與3.5 mL DPPH甲醇溶液（60 μmol/L）混勻，暗室反應(yīng) 30 min 后，于517 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光值，并計(jì)算清除率。

式中：A1為0.5 mL甲醇+3.5 mL DPPH溶液的吸光度值；A2為0.5 mL樣品+3.5 mL甲醇溶液的吸光度值；A3為0.5 mL樣品+3.5 mL DPPH溶液的吸光度值。

以 Trolox（10～100 μmol/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=0.6172C-4.1529（R2=0.9965），A 為清除率，C為濃度。樣品對(duì)DPPH自由基清除能力的結(jié)果以毫摩爾Trolox等量每克海菜花結(jié)合酚提取物表示（mmol TE/g Extract）。

1.2.5.2 鐵還原抗氧化能力 參照Song等[31]的方法，分別吸取100 μL不同濃度梯度的FeSO4·7H2O（100～1000 μmol/L）標(biāo)準(zhǔn)液加 1.4 mL FRAP 工作液[30 mmol/L TPTZ:0.3 mol/L pH 3.6乙酸鈉緩液:20 mmol/L FeCl3，1:10:1（v:v:v）]和 2 mL 純水，混勻，在37 ℃下水浴30 min，于593 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光值。得回歸方程：A=0.0006C+0.0034（R2=0.9937），A為吸光度值，C為FeSO4·7H2O濃度。將結(jié)合酚提取物用甲醇配制成250 μg/mL的溶液進(jìn)行測(cè)定。樣品的FRAP結(jié)果以mmol Fe2+每克海菜花結(jié)合酚提取物表示（mmoL Fe2+/g Extract）。

1.2.5.3 Trolox等量抗氧化活性 參考張?zhí)礻?yáng)等[32]的方法稍作修改。分別吸取不同濃度梯度的Trolox 25 μL（100～1000 μmol/L），加 2 mL ABTS+·工作液反應(yīng)6 min后，于734 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度值，以純甲醇為空白對(duì)照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=-0.0004C+0.6679（R2=0.9995），A 為吸光度值，C 為T(mén)rolox濃度。將海菜花提取物用甲醇配制成1.0 mg/mL的溶液進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果以毫摩爾Trolox等量每克海菜花結(jié)合酚提取物表示（mmol TE/g Extract）。

1.2.5.4 羥基自由基清除活性 參照盧躍紅等[33]的方法稍加修改。以Trolox為陽(yáng)性對(duì)照，100 μL不同濃度的結(jié)合酚溶液（0.25～4.0 mg/mL）或Trolox溶液（0.5～8.0 μg/mL）與 1.5 mL PBS 緩沖液（10 mmol/L）、150 μL 脫 氧核糖（25 mmol/L） 、150 μL 的 FeCl3（1 mmol/L）、150 μL EDTA（1.04 mmol/L）、150 μL H2O2（15 mmol/L）和 150 μL 抗壞血酸（1 mmol/L），充分混勻，在37 ℃下水浴30 min后，加1 mL三氯乙酸（2.8%）和1 mL硫代巴比妥酸（0.5%），沸水浴15 min，于532 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值。對(duì)照管用PBS溶液代替樣品或Trolox。

式中：A樣表示樣品的吸光度值；A對(duì)表示對(duì)照管的吸光度值。

1.2.5.5 DNA損傷的保護(hù)作用 參照林琳等[34]的方法稍加修改。反應(yīng)體系：1 μL DNA、11 μL PBS 溶液、5 μL海菜花結(jié)合酚提取物或VC與3 μL AAPH溶液充分混勻后，37 ℃水浴避光反應(yīng)45 min。反應(yīng)結(jié)束后，吸取 4 μL 反應(yīng)液與 2 μL loading buffer（含0.15%溴酚藍(lán)、10 mmol/L EDTA 和40%蔗糖）混勻，吸取4 μL混合液置于1.0%瓊脂糖凝膠中，電泳（60 V、50 min）。待電泳結(jié)束后，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，計(jì)算雙螺旋百分比。

式中：A0為雙螺旋構(gòu)象的灰度值；A1為開(kāi)環(huán)型構(gòu)象的灰度值；A2為線性構(gòu)象的灰度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel和SPSS 19.0進(jìn)行分析，采用方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，組間差異采用Tukey多重檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚和總黃酮含量

海菜花不同部位結(jié)合酚提取物的總酚含量和黃酮含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表可知，花、莖、葉的總酚含量依次為 366.35±6.37、259.60±2.60、209.72±3.14 mg GAE/g Extract，總酚含量花＞莖＞葉，三者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；總黃酮含量依次為466.08±4.05、305.72±7.92、156.69±2.34 mg CAE/g Extract，其花＞莖＞葉，三者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本研究中，海菜花不同部位結(jié)合酚提取物的總酚含量與黃酮含量總體趨勢(shì)一致，即花含量最高，其次為莖，葉最低。本研究測(cè)定的海菜花結(jié)合酚總酚含量略低于Lu等[7]報(bào)道的海菜花游離酚總酚含量（257.62～388.19 mg/g Extract），不同部位游離酚總酚含量與本研究測(cè)定的不同部位結(jié)合酚含量總體趨勢(shì)一致，均是花的高于莖的，莖的高于葉的。這表明海菜花不同部位的結(jié)合酚含量有差異。

表1 海菜花結(jié)合酚提取物總酚和總黃酮含量Table 1 Total phenolic content and flavonoid content of bound phenolics from O.acuminata extract

2.2 海菜花結(jié)合酚組成與含量

綠原酸、咖啡酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、阿魏酸和木犀草素5種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：y=20.19x+52.38，y=21.07x+58.205，y=5.4105x+17.274，y=34.816x+105，y=21.049x+42.551，R2均大于 0.998，標(biāo)準(zhǔn)品在測(cè)定的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。不同部位結(jié)合酚的組成及含量見(jiàn)表2。由表2可知，含量最高的是咖啡酸（86.51～102.28 mg/g Extract）；含量第二的是槲皮素-3-O-葡萄糖苷（5.50～28.01 mg/g Extract）；其余三種酚類物質(zhì)的含量為0.31～3.09 mg/g Extract。同一種酚類物質(zhì)在不同部位的分布具有顯著差異（P＜0.05）。其中，咖啡酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和阿魏酸均是葉含量最高，其次是花，莖最低；對(duì)于綠原酸，莖含量最高，其次是花，葉最低；木犀草素只在花中檢出。本課題組的另一篇文獻(xiàn)報(bào)道了海菜花游離酚提取物中主要含有木犀草素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、咖啡酰蘋(píng)果酸、綠原酸等酚類化合物[8]，部分酚類化合物與本研究鑒定的一致，但在含量上差異較大，這可能是由于同種原料中游離酚和結(jié)合酚的種類和含量不同造成的[35]。三個(gè)不同部位總單體酚含量范圍為95.22～134.82 mg/g Extract，葉最高，其次為花，莖最低，三者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 海菜花結(jié)合酚提取物的組成及含量Table 2 Composition and content of bound phenolics extracts from O.acuminata

2.3 抗氧化活性

海菜花不同部位結(jié)合酚的抗氧化活性見(jiàn)表3。由表3可知，海菜花花、莖、葉的Trolox等量抗氧化活性（TEAC）依次為 1.25±0.06、1.20±0.12、1.19±0.26 μmol TE/g Extract，不同部位之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；DPPH自由基清除能力依次是0.74±0.13、0.94±0.01、0.84±0.10 mmol/g Extract，三個(gè)部位之間無(wú)顯著性差異（P＜0.05）；鐵離子還原能力（FRAP）依次為 3.61±0.05、4.39±0.03、4.75±0.35 mmol Fe2+/g Extract，葉和莖的FRAP顯著高于花（P＜0.05）；對(duì)羥基自由基（·OH）的清除活性 IC50值分別為0.70、1.26、0.34 mg/mL，抑制作用葉強(qiáng)于花，花強(qiáng)于莖，三者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。三者的抑制作用弱于陽(yáng)性對(duì)照Trolox（IC50值2.81×10-3mg/mL）。植物多酚的抗氧化活性與酚的含量和酚類物質(zhì)的種類有關(guān)[36]，本研究中，4種不同的抗氧化體系研究表明，葉的抗氧化活性最強(qiáng)，這一結(jié)果與上述研究結(jié)果“葉中總單體酚含量最高”相一致。

表3 海菜花結(jié)合酚提取物的抗氧化活性Table 3 Antioxidant activity of bound phenolics extracts from O.acuminata

2.4 對(duì)ROO·介導(dǎo)的DNA損傷的保護(hù)作用

海菜花結(jié)合酚提取物對(duì)ROO·介導(dǎo)的DNA損傷的保護(hù)作用見(jiàn)圖1。由圖1（左側(cè)）電泳結(jié)果可知，第1泳道正常DNA主要以正常的雙螺旋分子為主，第2泳道添加了自由基后，由于受到自由基的攻擊，雙螺旋DNA轉(zhuǎn)變?yōu)殚_(kāi)環(huán)或線性構(gòu)象，第3～10泳道，添加了不同濃度的海菜花結(jié)合酚或VC溶液后，與第2泳道相比，雙螺旋構(gòu)象的DNA分子條帶隨結(jié)合酚或VC溶液濃度的增加逐漸增多。表明海菜花結(jié)合酚或VC對(duì)ROO·介導(dǎo)的DNA損傷具有明顯的保護(hù)作用。圖1（右側(cè)）的半定量分析可知，在濃度12.5～500 μg/mL 范圍內(nèi)，VC、花、莖、葉結(jié)合酚的DNA雙螺旋百分比范圍依次為22.00%～48.25%、22.74%～50.07%、18.25%～53.28%、25.93%～53.60%，且大體上在12.5～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，保護(hù)作用均逐漸增強(qiáng)，即保護(hù)作用呈現(xiàn)濃度劑量依賴關(guān)系。當(dāng)葉、莖、花結(jié)合酚濃度分別為200、500、300 μg/mL時(shí)，其 DNA雙螺旋百分比分別達(dá)到最大（53.60%、53.28%、50.07%），均高于陽(yáng)性對(duì)照VC的最大雙螺旋百分比48.25%。由此可見(jiàn)，對(duì)ROO·介導(dǎo)的DNA氧化損傷的保護(hù)作用葉＞莖＞花＞VC。葉結(jié)合酚對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用最強(qiáng)與本文上述的研究結(jié)果“葉的抗氧化活性最強(qiáng)、總單體酚含量最高”一致。植物多酚對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用不但與其酚類物質(zhì)的含量有關(guān)，而且與酚類物質(zhì)的種類有關(guān)[37-38]，葉結(jié)合酚較強(qiáng)的DNA損傷保護(hù)作用可能與其含有較高的咖啡酸和槲皮素素-3-O-葡萄糖苷含量也有關(guān)系。咖啡酸具有3，4-二羥基結(jié)構(gòu)，可通過(guò)遞氫的方式清除被氧化DNA所形成的過(guò)氧自由基，穩(wěn)定氧原子上的單電子，易生成穩(wěn)定的半醌式自由基[39]，使得咖啡酸具有較強(qiáng)的清除過(guò)氧自由基的能力。據(jù)報(bào)道咖啡酸[40]、槲皮素素-3-O-葡萄糖苷[41]能有效抑制過(guò)氧自由基引起的DNA氧化損傷。

圖1 海菜花結(jié)合酚提取物對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用Fig.1 DNA damage protective effect of bound phenolics extracts from O.acuminata

3 結(jié)論

海菜花結(jié)合酚酚類化合物含量豐富，主要含咖啡酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、阿魏酸、綠原酸和木犀草素5種。不同部位的酚類化合物含量和組成不同。海菜花結(jié)合酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性以及對(duì)ROO·介導(dǎo)的DNA損傷的保護(hù)作用。其中，葉結(jié)合酚的抗氧化活性及對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用最強(qiáng)。本研究可為海菜花的保護(hù)、開(kāi)發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。