氯胺酮麻醉對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響及作用機(jī)制

李峰 甘建輝 董文岳 王藝 劉鋒 李永強(qiáng)

術(shù)后認(rèn)知障礙是臨床上常見的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，研究表明術(shù)后并發(fā)癥與麻醉藥品的使用、引發(fā)神經(jīng)功能的損傷有關(guān)[1,2]。老年人群神經(jīng)系統(tǒng)較為脆弱，嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)較為敏感，均為術(shù)后認(rèn)知功能的易發(fā)人群[3]。氯胺酮是臨床上常見的靜脈麻醉類藥物，具有良好的鎮(zhèn)靜、麻醉效果，但對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)可能造成一定的損傷，對(duì)認(rèn)知功能造成一定的損傷，使用方面存在一定的爭(zhēng)議[4,5]。目前對(duì)于麻醉藥對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用機(jī)制尚不明確，目前主要認(rèn)為的機(jī)制為細(xì)胞啟動(dòng)自殺式程序，改變神經(jīng)遞質(zhì)傳到，引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)等[6,7]。為進(jìn)一步探討氯胺酮對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響及其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以40只大鼠為研究對(duì)象，主要通過Morris 水迷宮、TUNEL法考察氯胺酮對(duì)認(rèn)知功能的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究，進(jìn)而為臨床麻醉合理用藥提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取鼠齡1周的健康大鼠40只(SPF級(jí)雄性，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK2019-0008)，體重約為15 g，由山東動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，均通過了認(rèn)知功能及運(yùn)動(dòng)功能測(cè)試，將大鼠至于自然晝夜光照，溫度25℃，濕度40.0%～50.0%條件下飼養(yǎng)1周，消除周圍環(huán)境影響，將大鼠隨機(jī)分為A、B、C、D組，每組10只。A組為對(duì)照組，注射同等劑量的等滲0.9%氯化鈉溶液，B組注射50 mg/kg的氯胺酮，C組注射75 mg/kg的氯胺酮，D組注射100 mg/kg的氯胺酮[8]，以后每小時(shí)追加一半的劑量進(jìn)行麻醉維持，所有操作符合動(dòng)物倫理學(xué)會(huì)要求，善待動(dòng)物，降低對(duì)動(dòng)物的傷害。大鼠的鼻唇、趾端膚色保持紅潤，4組體重、呼吸頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 4組大鼠的基本信息

1.2 方法

1.2.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)：以高0.5 m、寬1.2 m的水池建立水迷宮，按順時(shí)針方向分為4個(gè)象限，將水池及平臺(tái)及水均染成黑色，平臺(tái)固定于第3象限水下1 cm處，水溫控制為25℃左右，麻醉前1 d使大鼠置于水迷宮中試游5 min，以適應(yīng)周圍環(huán)境，氯胺酮麻醉后的10 h進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，歷時(shí)5 d，分別記錄為D1～D5，每天上下午各訓(xùn)練2次，將大鼠面向池壁從不同象限滑入水池，記錄大鼠尋找到平臺(tái)的時(shí)間，若2 min內(nèi)未找到平臺(tái)，則對(duì)大鼠進(jìn)行指引，于平臺(tái)處休息20 s，進(jìn)行下一輪的訓(xùn)練。第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺(tái)，選一任意點(diǎn)作為入水點(diǎn)，記錄2 min內(nèi)大鼠在平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，保持整體環(huán)境一致，以排除外界干擾。

1.2.2 海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞元凋亡測(cè)定：采用TUNEL法進(jìn)行神經(jīng)元凋亡的測(cè)定，主要通過試劑盒進(jìn)行測(cè)定，使用并與標(biāo)準(zhǔn)圖像及逆行對(duì)比分析，以細(xì)胞核中出現(xiàn)黃色顆粒為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 Fas蛋白測(cè)定：使用試劑盒對(duì)Fas蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，嚴(yán)格按照說明及逆行操作，以海馬神經(jīng)元細(xì)胞是否出現(xiàn)黃色作為判斷依據(jù)，使用圖像分析儀進(jìn)行觀測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮測(cè)試 對(duì)4組大鼠進(jìn)行了水迷宮測(cè)試，進(jìn)而對(duì)大鼠的空間學(xué)習(xí)能力及空間記憶能力及逆行考察。對(duì)小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行研究分析。見圖1。

2.1.1 空間學(xué)習(xí)能力：本次實(shí)驗(yàn)通過定位航行實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠的空間學(xué)習(xí)能力進(jìn)行了考察。4組小鼠逃逸時(shí)間均隨著時(shí)間的延長而縮短，C、D組大鼠的逃逸時(shí)間均明顯長于A組(P<0.05)；B組與A組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B、C、D組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中、高劑量的氯胺酮會(huì)對(duì)大鼠學(xué)習(xí)能力造成一定的影響。見表2，圖2。

表2 4組大鼠的逃逸時(shí)間比較

2.1.2 空間探索能力：本次實(shí)驗(yàn)通過空間探索實(shí)驗(yàn)，對(duì)大鼠的空間探索能力進(jìn)行了考察。A、B、C、D組在原平臺(tái)象限停留時(shí)間依次減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。氯胺酮對(duì)大鼠的空間探索能力具有一定的影響，且與劑量呈依賴關(guān)系，劑量越大，對(duì)大鼠空間探索能力的損傷越大。見表3。

2.2 海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡 對(duì)4組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡情況，進(jìn)行研究分析。A、B、C、D組神經(jīng)元凋亡率依次增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

圖2 4組大鼠的逃逸時(shí)間比較

表3 4組小鼠的平臺(tái)所在象限停留時(shí)間

表4 4組大鼠的神經(jīng)元凋亡情況

2.3 Fas蛋白表達(dá) 對(duì)4組大鼠的Fas蛋白表達(dá)情況進(jìn)行研究分析。A、B、C、D組Fas蛋白表達(dá)量依次增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3，表5。

表5 4組大鼠Fas蛋白表達(dá)情況

3 討論

氯胺酮是常見的一種鎮(zhèn)靜麻醉藥，已被普遍運(yùn)用于內(nèi)外科手術(shù)治療之中，具有良好的鎮(zhèn)靜、麻醉效果，但容易對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成一定的傷害，對(duì)記憶及認(rèn)知造成一定的影響[8,9]。氯胺酮對(duì)神經(jīng)功能的傷害尚不明確，可能與氯胺酮在一定程度上會(huì)引起神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡有關(guān)，進(jìn)而影響大鼠的認(rèn)知功能。氯胺酮的神經(jīng)功能損傷副作用成為阻礙該類藥品應(yīng)用的重要原因，是麻醉科急需解決的問題之一[10]。在對(duì)大鼠的認(rèn)知及學(xué)習(xí)能力研究中，主要采用經(jīng)典的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，通過測(cè)定逃避潛伏期，測(cè)定大鼠的認(rèn)知及記憶保持能力。本次研究中，氯胺酮注射劑量越少，潛逃時(shí)間越短，說明氯胺酮對(duì)大鼠的認(rèn)知功能造成一定影響，且濃度越高影響越大。Schumacher等[11]對(duì)氯胺酮對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響進(jìn)行了分析研究，結(jié)果表明氯胺酮會(huì)對(duì)大鼠的認(rèn)知功能造成一定的損害，且與劑量密切相關(guān)，劑量越大，所造成的損傷往往越嚴(yán)重。李桂婷等[12]對(duì)氯胺酮對(duì)幼年小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能進(jìn)行了研究分析，將小鼠隨機(jī)分為了對(duì)照組及氯胺酮組，結(jié)果表明氯胺酮組小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能衰退，小鼠的神經(jīng)元存在一定的損傷。黃丹等[13]對(duì)氯胺酮在老齡大鼠認(rèn)知功能損傷的作用與機(jī)制進(jìn)行了研究分析，將42只大鼠分為不同的組別，給予不同劑量的氯胺酮進(jìn)行研究分析，結(jié)果表明氯胺酮會(huì)損傷大鼠的認(rèn)知功能，且呈濃度依賴性。以上研究均提示氯胺酮會(huì)對(duì)大鼠的認(rèn)知功能造成一定的損傷且與劑量密切相關(guān)，在氯胺酮的使用中應(yīng)嚴(yán)格把控用藥劑量，在保證治療效果的前體下盡量減少用藥，進(jìn)而降低對(duì)認(rèn)知功能的損傷。

Fas蛋白又稱為細(xì)胞表面蛋白，主要參與細(xì)胞的凋亡過程。研究表明，F(xiàn)as蛋白所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是海馬神經(jīng)元損傷的重要機(jī)制之一，往往神經(jīng)元損傷較為嚴(yán)重的部位，該蛋白表達(dá)含量較高[14]。氯胺酮不僅會(huì)對(duì)大鼠認(rèn)知功能造成一定的影響，影響海馬區(qū)域相關(guān)蛋白的表達(dá)[15]。馬飛等[16]對(duì)腦損傷大鼠Fas的含量水平進(jìn)行了研究分析，結(jié)果表明Fas蛋白表達(dá)水平與神經(jīng)元的損傷密切相關(guān)，神經(jīng)損傷越嚴(yán)重，F(xiàn)as表達(dá)水平往往越高。曹進(jìn)麗[17]對(duì)Fas與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡間的聯(lián)系進(jìn)行了研究分析，結(jié)果表明Fas的過量表達(dá)是促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡重要原因之一。在本次研究中對(duì)大鼠Fas蛋白表達(dá)情況進(jìn)行研究分析，注射氯胺酮后，大鼠的Fas蛋白表達(dá)水平明顯升高。Fas蛋白升高可能是神經(jīng)元受損，進(jìn)而影響認(rèn)知功能的重要原因[18-23]。

綜上可知，氯胺酮對(duì)大鼠的認(rèn)知功能具有一定的損傷作用，這可能與海馬區(qū)的Fas蛋白分泌增高，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)[24-27]，在今后氯胺酮的使用過程中，應(yīng)嚴(yán)格控制使用劑量，降低對(duì)認(rèn)知功能的影響。