缺氧誘導(dǎo)因子-1/自噬在硫化氫預(yù)處理大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用與機(jī)制研究

毛忠文 鄧秋芳 李靜 王新云 甘金城 駱福秀

心肌缺血再灌注是引起冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)心肌損傷的重要病理機(jī)制，其常見于冠心病溶栓等治療中，有研究表明，在心肌缺血再灌注過程中會(huì)產(chǎn)生的大量ROS，是導(dǎo)致再灌注損傷的重要機(jī)制[1]。心肌缺血再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致治療效益低下，且有多種機(jī)制能夠參與心肌缺血再灌注損傷，主要包括自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、血管皮內(nèi)細(xì)胞功能障礙等。自噬是真核細(xì)胞中代謝調(diào)節(jié)的主要機(jī)制，能夠在缺氧、缺血再灌注等情況下，誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生，尤其是在缺血再灌注后會(huì)大量產(chǎn)生自噬小體。HIF-1α屬于一種轉(zhuǎn)錄因子，多存在于線粒體中[2]。硫化氫被認(rèn)為是一種新型的神經(jīng)調(diào)節(jié)因子和信號(hào)傳遞因子，且在多個(gè)器官及組織中均有所發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體在病理情況下，其能夠發(fā)揮抗炎、抗氧化作用且對(duì)神經(jīng)起著保護(hù)作用[3]。本文中，建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子-1/自噬在心肌缺血再灌注損傷大鼠中的作用，為治療心肌缺血再灌注損傷提供了新的循證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究動(dòng)物：選取SPF級(jí)SD健康大鼠40只，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，鼠齡(3.8±0.3)個(gè)月，體重(229.6±11.8)g。大鼠均養(yǎng)殖在干凈籠子里，室溫(22.1±1.8)℃，相對(duì)濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時(shí)間1周。本研究所做實(shí)驗(yàn)均獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑：人抗大鼠LDH抗體(圣克魯斯生物技術(shù)有限公司)；大鼠抗小鼠HIF-1α抗體(上海優(yōu)寧維生物科技有限公司)；小鼠抗大鼠LC3Ⅰ抗體、人抗大鼠LC3Ⅱ抗體(北京泰澤瑞達(dá)科技有限公司)；兔抗大鼠P62抗體(艾美捷科技有限公司)；兔抗小鼠Beclinl-1抗體(上海信裕生物工程有限公司)；SOD ELISA試劑盒、cTnT ELISA試劑盒、CK-MB ELISA試劑盒(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司)；MDA ELISA試劑盒(上海紀(jì)寧生物科技有限公司)；T-AOC ELISA試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)。

1.2 方法 隨機(jī)選取40只大鼠中10只作為對(duì)照組(C組)，10只作為預(yù)處理組(H組)，注射5 μmol/kg的硫化氫于大鼠左側(cè)腎動(dòng)脈，剩余20只大鼠采用覃琴等[4]誘導(dǎo)建立體內(nèi)心肌缺血再灌注(I/R)模型，使用50 mg/kg的戊巴比妥鈉將大鼠進(jìn)行麻醉處理，將導(dǎo)管插入右側(cè)頸內(nèi)靜脈以及頸內(nèi)動(dòng)脈以便靜脈給藥和血?dú)夥治?、血壓檢測(cè)。切開氣管后行氣管插管，連接呼吸機(jī)行呼氣末正壓通氣，恒溫控制儀維持大鼠體溫36～37℃，行左胸切開術(shù)打開心包，在左心耳下緣對(duì)冠狀動(dòng)脈左前降支進(jìn)行結(jié)扎，縫線末端套入自制圈套管，靜止平衡30 min，使用止血鉗阻斷冠狀動(dòng)脈左前降支供血，當(dāng)心外膜發(fā)紺蒼白則表示缺血模型建立成功，松開圈套管進(jìn)行灌注，可見心外膜重新充血，表明心肌缺血再灌注(I/R)模型建立成功。后經(jīng)大鼠左側(cè)腎動(dòng)脈給予5 μmol/kg的硫化氫，分為HI組，對(duì)照組和模型組不作任何處理。所有大鼠給硫化氫1周，靜脈采血后處死，以半徑為5 cm、轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心處理10 min，分離上層血清，-80℃保存，待用。取心臟組織，在4%多聚甲醛進(jìn)行固定、脫水透明，浸蠟包埋，脫蠟、HE染色，之后脫水、透明，切片厚度4 μm，待封片晾干后顯微鏡下觀察大鼠心臟組織病理學(xué)表現(xiàn)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 心電圖檢測(cè):將針形電極按紅、綠、黑分別插入四肢皮下，采用XD-7100單導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)記錄大鼠造模前后心電圖變化。

1.3.2 SOD、MDA水平及T-AOC含量檢測(cè):采用比色法對(duì)超氧化物歧化酶SOD、丙二醛MDA水平及總抗氧化能力(T-AOC)含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 心功能指標(biāo):采用二維超聲對(duì)左心室收縮末期壓力(LVESP)、左心室舒張末期壓力(LVEDP)進(jìn)行檢測(cè)；使用AisualSonic Vevo 2100型彩色超聲診斷儀，電子探頭，14 mHz，對(duì)左心室射血分?jǐn)?shù)(FS)、短軸縮短率(EF)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 心肌酶水平檢測(cè):采用酶聯(lián)免疫法對(duì)肌酸激酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌鈣蛋白(cTnT)水平進(jìn)行檢測(cè)，取50 mmol/L碳酸鹽包緩沖液對(duì)CK-MB、LDH、cTnT進(jìn)行稀釋，且加入聚苯乙烯的反應(yīng)孔中，加蓋處理后，在4℃下置留24 h，次日洗滌3次后，拋干，在每孔中均加入稀釋液(pH值為7.4，0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液)稀釋待測(cè)標(biāo)本0.1 ml，加入陽性、陰性對(duì)照標(biāo)本，在42℃下置留60 min，將液體移除并洗滌3次后，拋干，在每孔中加入CK-MB、LDH、cTnT抗體0.1 ml，再次置留60 min，將液體移除并洗滌3次，拋干，并在每孔中加入低物液(0.1 mol/L的Na2HPO4,0.05 mol/L的枸櫞酸)混勻，且加入0.1 ml鄰苯二胺，遮光20 min，再次加入2 mol/L H2SO40.05 ml放置各孔內(nèi)，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450，分析CK-MB、LDH、cTnT水平。

1.3.5 心肌缺血面積、心肌梗死面積、梗死區(qū)占心室比比較:再灌注結(jié)束后，將前降支重新結(jié)扎，采用TTC法對(duì)心肌梗死面積進(jìn)行檢測(cè)，采用Image Pro-Plus軟件分析心肌梗死面積和心肌缺血面積。

1.3.6 HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62蛋白檢測(cè):采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)對(duì)HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62蛋白進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照定量PCR儀的操作說明書進(jìn)行。分別加入稀釋10倍的PCR緩沖液2.5 μl，MgCl2溶液1.5 μl，上游引物和下游引物0.5 μl，然后加水制成25 μl的反應(yīng)體系。在94℃環(huán)境中反應(yīng)1 min，55℃環(huán)境中反應(yīng)1 min，72℃環(huán)境中反應(yīng)1 min，循環(huán)35次，72℃環(huán)境中反應(yīng)延長(zhǎng)5 min，最少重復(fù)3次。采用2-△△Ct方法計(jì)算出需要檢測(cè)的HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62表達(dá)水平。HIF-1α引物序列：上游:5’-ATGCTTATATCTGGAAGGTATGTGG’；下游：5’-AAAGAGCAAGGGAACGAAAA-3’；LC3Ⅰ引物序列：上游:5’-TCCTGGATAAGACCAAGTTTCTG’；下游：5’-ATAGATGTCAGCGATGGGTGTG-3’；LC3Ⅱ引物序列：上游:5’-GATGTCCGACTTATTCGAGAGC-3’；下游：5’-TTGAGCTGTAAGCGCCTTCTA-3’；P62引物序列：上游:5’-AGCTGCCCTCAGCCCTCTA’；下游：5’-GGCTTCTCTTCCCTCCATGTT-3’；GAPDH引物序列：上游:5’-GATTTGGCATTGTTGAGGG-3’；下游：5’-TGCTATCGCCTATGAAGTCC-3’。

1.3.7 HIF-1α/Autophagy通路蛋白檢測(cè):使用Western blot檢測(cè)3組大鼠HIF-1α/Autophagy信號(hào)通路蛋白表達(dá)量，提取小鼠肺組織中樣品總蛋白，加入5×SDS上樣緩沖液，每孔劑量為20 μg。進(jìn)行電泳，電壓為120 V，進(jìn)行1.5 h后，轉(zhuǎn)至形成PVDF膜，轉(zhuǎn)膜完成后，使用5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉，室內(nèi)進(jìn)行，加入一抗溶液TBST(HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1按照1∶2 000稀釋)或在溫室下孵育12 h。在4℃條件下進(jìn)行震蕩過夜，再次洗滌，放入二抗溶液TBST(HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1按照1∶5 000稀釋)，室內(nèi)震蕩120 min后，洗滌，顯色成像，使用軟件分析蛋白條帶灰度值。內(nèi)參蛋白是GAPDH。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)觀察 C組大鼠心肌纖維排列緊密有序，肌段清晰，線粒體豐富；H組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，部分細(xì)胞水腫；I/R組大鼠心肌纖維排列紊亂，細(xì)胞水腫、壞死明顯，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；HI組大鼠損傷減弱，纖維外觀較紊亂，脂肪和空泡變性豐富。見圖1。

C組H組I/R組HI組

2.2 4組大鼠心電圖ST段變化 缺血前4組大鼠心電圖ST段比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；缺血后I/R組、HI組大鼠心電圖ST段高于H組，且HI組大鼠心電圖ST段低于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；再灌注后I/R組、HI組大鼠心電圖ST段高于H組，且HI組大鼠心電圖ST段低于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠心電圖ST段變化

2.3 4組大鼠心肌組織中SOD、MDA水平以及T-AOC含量比較 H組大鼠心肌組織SOD、T-AOC水平低于C組大鼠，且MDA水平高于C組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；I/R組、HI組大鼠心肌組織SOD、T-AOC水平均低于C組、H組、且MDA水平高于C組、H組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HI組大鼠心肌組織SOD、T-AOC水平高于I/R組，且MDA水平低于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠心肌組織中SOD、MDA水平以及T-AOC含量比較

2.4 4組大鼠心功能指標(biāo)比較 H組大鼠LVESP、FS、EF低于C組大鼠，且LVEDP高于C組大鼠，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；I/R組、HI組大鼠LVESP、FS、EF低于C組、H組大鼠，且LVEDP高于C組、H組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HI組大鼠LVESP、FS、EF高于I/R組，且LVEDP低于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠心功能指標(biāo)比較

2.5 4組大鼠心肌酶水平比較 H組大鼠CK-MB、LDH、cTnT水平均高于C組大鼠，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；I/R組、HI組大鼠CK-MB、LDH、cTnT水平均高于C組、H組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HI組大鼠CK-MB、LDH、cTnT水平均低于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 4組大鼠心肌酶水平比較

2.6 4組大鼠心肌缺血面積、心肌梗死面積、梗死區(qū)占心室比比較 I/R組、HI組大鼠心肌缺血面積、心肌梗死面積、梗死區(qū)占心室比高于C組、H組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HI組大鼠心肌缺血面積、心肌梗死面積、梗死區(qū)占心室比低于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

2.7 4組大鼠心臟組織中HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62蛋白表達(dá)量比較 H組大鼠心肌組織中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62蛋白表達(dá)量均高于C組，且LC3Ⅰ低于C組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；I/R組、HI組大鼠心肌組織中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62蛋白表達(dá)量均高于H組、C組大鼠，且LC3Ⅰ低于H組、C組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HI組大鼠心肌組織中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62蛋白表達(dá)量均低于I/R組，且LC3Ⅰ高于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，表6。

表5 4組大鼠心肌缺血面積、心肌梗死面積、梗死區(qū)占心室比比較

圖2 4組大鼠HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62熒光定量RT-PCR圖

表6 4組大鼠心臟組織中HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62蛋白表達(dá)量比較

2.8 4組大鼠HIF-1α/Autophagy通路蛋白表達(dá)量比較 H組大鼠心肌組織中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白表達(dá)量均高于C組，且LC3Ⅰ低于C組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；I/R組、HI組大鼠心肌組織中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白表達(dá)量均高于H組、C組大鼠，且LC3Ⅰ低于H組、C組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HI組大鼠心肌組織中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白表達(dá)量均低于I/R組，且LC3Ⅰ高于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表7，圖3。

表7 4組大鼠HIF-1α/Autophagy通路蛋白表達(dá)量比較

圖3 心肌組織HIF-1α/Autophagy通路蛋白HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白Western blot圖

3 討論

心肌缺血再灌注是由于多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路的參與的復(fù)雜病理過程，對(duì)心肌缺血再灌注患者的預(yù)后和治療帶來了嚴(yán)重的影響[5]。心肌缺血再灌注損傷是指心肌長(zhǎng)時(shí)間缺血后恢復(fù)供血后心肌損傷更加嚴(yán)重的一種病理現(xiàn)象。有研究表明，恢復(fù)組織灌注是減少心肌缺血后損傷的最有效辦法[6]。但缺血心肌恢復(fù)血液再灌注后可能會(huì)導(dǎo)致心肌能量代謝障礙、心律失常、心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化等，進(jìn)一步加重各方面的損傷，即心肌缺血/再灌注損傷，成為缺血性心肌病治療的障礙之一，臨床治療應(yīng)盡量減少甚至避免心肌缺血再灌注所帶來的損傷[7,8]。

硫化氫是一種具有臭雞蛋氣味的窒息性氣體，外源性硫化氫進(jìn)入人體將產(chǎn)生細(xì)胞毒理性作用，表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和窒息癥狀[9]。內(nèi)源性硫化氫具有多種生理功能，且與多種心血管疾病有關(guān)。大鼠心肌I/R損傷模型已被廣泛用于心肌I/R損傷實(shí)驗(yàn)中。有研究表明，當(dāng)心肌損傷時(shí)，心電圖ST段會(huì)有明顯抬高[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，再灌注后I/R組、HI組大鼠心電圖ST段高于H組，且HI組大鼠心電圖ST段低于I/R組，此結(jié)果說明，再灌注能夠降低大鼠的心電圖ST段抬高，有利于心肌I/R損傷大鼠的恢復(fù)。自由基蓄積過多會(huì)直接導(dǎo)致核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的過氧化，破壞膜結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致心肌的不可逆損傷，其主要表現(xiàn)為MDA含量增加以及SDO和T-AOC活力下降；同時(shí)還會(huì)出現(xiàn)大片的心肌梗死區(qū)域，導(dǎo)致心肌組織和結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)明顯的改變[11]。在本文中發(fā)現(xiàn)，HI組大鼠心肌組織SOD、T-AOC水平及心肌梗死面積高于I/R組，且MDA水平低于I/R組，此結(jié)果可得，硫化氫能夠降低大鼠心肌損傷程度，減少心肌梗死范圍，保護(hù)心功能。與杜靖等[12]研究結(jié)果一致。

HIF-1α是一種核轉(zhuǎn)錄因子，其主要存在于線粒體中，能夠抑制電子產(chǎn)物ROS的產(chǎn)生，還能夠通過Beclinl-1/Bcl-2途徑促進(jìn)線粒體的自噬[13]。HIF-1α的表達(dá)主要受其濃度的調(diào)節(jié)，是HIF-1發(fā)揮的重要亞基，在常氧條件下能夠別快速溶解，且在低氧狀態(tài)下降解受阻，表達(dá)增加，并能夠通過調(diào)控其下游蛋白發(fā)揮作用[14]。自噬被認(rèn)為在MIRI中發(fā)揮重要作用，在正常生理狀態(tài)下，其在心肌細(xì)胞中低量存在，當(dāng)機(jī)體處于缺氧、缺血等狀態(tài)下，其水平會(huì)顯著增加。自噬會(huì)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)重要功能的胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞器降解，從而為細(xì)胞的生存代謝過程中提供營(yíng)養(yǎng)[15]。高魯方等[16]研究表明，心肌缺血再灌注損傷過程中自噬起重要作用，小劑量衣霉素誘導(dǎo)ERS預(yù)處理可在缺血期引起適度的細(xì)胞自噬，有助于維持心肌細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，產(chǎn)生一定程度的心肌保護(hù)效果。LC3主要分為Ⅰ型和Ⅱ型，正常情況下，細(xì)胞內(nèi)合成的LC3經(jīng)過加工形成Ⅰ型，則呈常規(guī)表達(dá)；當(dāng)自噬發(fā)生后，LC3Ⅰ的表達(dá)急劇下降，LC3Ⅱ表達(dá)顯著升高，因此，通過LC3Ⅰ、LC3Ⅱ的比值，可以檢測(cè)細(xì)胞自噬水平[17]。P62是一種泛素結(jié)合蛋白，且與蛋白質(zhì)的泛素化密切相關(guān)，其能夠參與多種細(xì)胞自噬及調(diào)控過程[18]。自噬中，其能夠與蛋白質(zhì)泛素相結(jié)合，與自噬小體內(nèi)膜LC3Ⅱ形成復(fù)合物，并被自噬溶酶體一同降解。Beclinl-1是自噬調(diào)控的關(guān)鍵蛋白之一，能夠參與自噬體膜的形成，誘導(dǎo)自噬發(fā)生[19,20]。因此在本文中對(duì)4組大鼠心肌組織中HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，HI組大鼠心肌組織中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白表達(dá)量均低于I/R組，且LC3Ⅰ高于I/R組，此結(jié)果說明，硫化氫可有效改善心肌缺血再灌注大鼠心肌組織中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白表達(dá)量，效果顯著。

綜上所述，硫化氫對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，能夠縮小心肌梗死面積，其作用機(jī)制可能與HIF-1α/Autophagy通路有關(guān)，抑制再灌注期自噬的表達(dá)，從而減輕心肌缺血再灌注損傷。