RP-HPLC-ELSD同時(shí)測(cè)定滇女金丸中5個(gè)皂苷類成分的含量△

仲侃，張紫佳*，饒正云，馮寶文，王朝軍

1.上海中醫(yī)藥大學(xué) 中藥研究所，上海 201203；

2.紅云制藥（昆明）有限公司，云南 昆明 650033

滇女金丸是由熟三七、香附（醋）、炙黃芪、酒續(xù)斷等36 味中藥制成的丸劑，具有補(bǔ)腎止血、調(diào)經(jīng)止帶的功效，臨床主要用于由腎虧血虛引起的月經(jīng)不調(diào)、帶下量多、腰腿酸軟、小腹疼痛等。目前，滇女金丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅以芍藥苷為含量測(cè)定指標(biāo)成分。該方成分復(fù)雜多樣，單一指標(biāo)難以有效控制制劑質(zhì)量，因此，需對(duì)其質(zhì)量控制方法進(jìn)行提升。酒續(xù)斷在滇女金丸方中為君藥，熟三七、炙黃芪為臣藥。酒續(xù)斷具有補(bǔ)肝腎、止崩漏的功效，其中的川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量較高，具有抗骨質(zhì)疏松等作用[1-3]；三七能夠化瘀止血、活血定痛，熟三七中的皂苷類成分具有活血化瘀、通脈活絡(luò)的作用[4-8]；黃芪甲苷為黃芪的指標(biāo)成分之一，在方中可起到補(bǔ)氣健脾、培土治水以治其本的功效[9-11]。由此可見，皂苷類成分為酒續(xù)斷、熟三七、炙黃芪三者的主要活性成分。為了更好地控制滇女金丸的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)選擇三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ和黃芪甲苷為指標(biāo)成分，建立了同時(shí)測(cè)定滇女金丸中這5 個(gè)成分含量的反相高效液相-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（RP-HPLC-ELSD）。該方法穩(wěn)定可靠，為更好地提升滇女金丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260Ⅱ型系列高效液相色譜儀、1200 型系列高效液相色譜儀、色譜工作站（安捷倫科技有限公司）；BSA124S-CW 型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］、KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品三七皂苷R1（批號(hào)：110745-201619，純度：90.4%）、人參皂苷Rg1（批號(hào)：110703-201832，純度：94.0%）、人參皂苷Rb1（批號(hào)：110704-201625，純度：94.3%）、川續(xù)斷皂苷Ⅵ（批號(hào)：111685-201707，純度：94.3%）、黃芪甲苷（批號(hào)：110781-201492，純度：95.2%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；滇女金丸為市售（昆明生達(dá)制藥有限公司，批號(hào)：180609）；乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

AgilentZORBAXSB-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～20 min，20%A；20～30 min，20%～21%A；30～35 min，21%～31%A；35～50 min，31%A；50～58 min，31%～40%A）；流速為1 mL·min-1；柱溫為25 ℃；載氣為氮?dú)猓惑w積流量為1.6 L·min-1；漂移管溫度為50 ℃；增益5.0；進(jìn)樣量為10 μL；理論板數(shù)按三七皂苷R1峰計(jì)算應(yīng)不低于7000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取對(duì)照品三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、黃芪甲苷10.92、12.77、13.87、30.64、11.47 mg 分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別制成質(zhì)量濃度為1.092、1.277、1.387、3.064、1.147 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為三七皂苷R10.1 mg·mL-1，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb10.3 mg·mL-1，川續(xù)斷皂苷Ⅵ0.5 mg·mL-1，黃芪甲苷0.1 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，供定量測(cè)定使用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取滇女金丸適量，研細(xì)，過三號(hào)篩，取約4.0 g，精密稱定，精密量取甲醇100 mL，冷浸過夜，超聲（750 W，40 kHz）提取2 h，放冷，濾過，濾液濃縮至干，少量多次加入水13 mL 溶解，水飽和正丁醇振搖萃取3 次，每次40 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性供試溶液的制備 按處方比例分別配制不含三七、續(xù)斷、黃芪的陰性樣品，按2.2.2 項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，分別制成熟三七、酒續(xù)斷、炙黃芪的陰性供試溶液。

2.2.4 陰性對(duì)照試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性供試溶液、空白溶劑按，2.1 項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、黃芪甲苷與相鄰成分達(dá)基線分離，且陰性對(duì)照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 滇女金丸專屬性考察色譜圖

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配置成含三七皂苷R10.087、0.109、0.237、0.546、1.092 mg·mL-1，人參皂苷Rg10.126、0.253、0.451、0.789、1.011 mg·mL-1，人參皂苷Rb10.063、0.125、0.251、0.502、1.003 mg·mL-1，川續(xù)斷皂苷Ⅵ0.065、0.131、0.522、0.783、1.357 mg·mL-1，黃芪甲苷0.102、0.204、0.326、0.407、1.018 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。按2.1 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10、20 μL，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），以外標(biāo)兩點(diǎn)對(duì)數(shù)法進(jìn)行線性回歸。得三七皂苷R1回歸方程：Y=1.875 5X+1.920 8（r=0.999 7）；人參皂苷Rg1回歸方程：Y=1.868 5X+1.909 0（r=0.999 6）；人參皂苷Rb1回歸方程：Y=1.789 8X+2.167 7（r=0.999 9）；川續(xù)斷皂苷Ⅵ回歸方程：Y=1.8296X+2.2751（r=0.9997）；黃芪甲苷回歸方程：Y=1.8130X+2.1128（r=0.9998）。結(jié)果表明三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、黃芪甲苷分別在0.087～1.092、0.126～1.011、0.063～1.003、0.065～1.357、0.102～1.018 mg·mL-1呈良好線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件每天進(jìn)樣6針，共進(jìn)樣3 d，以峰面積分別計(jì)算日內(nèi)精密度及日間精密度。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、黃芪甲苷的日內(nèi)精密度分別為1.40%、0.38%、2.18%、1.39%、1.69%，日間精密度分別為1.54%、1.32%、2.96%、2.76%、3.59%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.2 項(xiàng)下滇女金丸供試品溶液，分別在0、4、8、10、12、24、48、72 h進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、黃芪甲苷的RSD 分別為3.37%、2.04%、2.38%、1.86%、1.85%。結(jié)果表明樣品在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批滇女金丸（批號(hào)：190401），按照2.2.2 項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，平行制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、黃芪甲苷的RSD 分別為1.88%、2.35%、3.02%、1.67%、1.84%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的滇女金丸樣品（批號(hào)：190401）2.0 g，精密稱定9份，每3份加入相同量（分別為已知含量的50%、100%、150%）的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、黃芪甲苷對(duì)照品，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)兩點(diǎn)對(duì)數(shù)法計(jì)算含量、回收率、RSD（表1）。均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版（四部）的相關(guān)規(guī)定。

表1 滇女金丸中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ及黃芪甲苷的加樣回收率試驗(yàn)

2.2.10 樣品測(cè)定 取3批樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以外標(biāo)兩點(diǎn)對(duì)數(shù)法計(jì)算含量，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、黃芪甲苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.123、0.541、0.437、1.427、0.135 mg·g-1，RSD＜4%，含量差異較小，均一度較高。結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 提取條件考察

本實(shí)驗(yàn)對(duì)熟三七、酒續(xù)斷、炙黃芪的提取條件進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)冷浸過夜后的效果明顯優(yōu)于未冷浸過夜的樣品；通過對(duì)75%甲醇、甲醇、無水乙醇3種提取溶劑進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)甲醇的提取效率顯著高于其他溶劑；進(jìn)一步試驗(yàn)，以甲醇為提取溶劑，考察超聲提?。?50 W，40 kHz）、索氏提取、回流提取等不同提取方法，發(fā)現(xiàn)超聲提取與索氏提取的提取效率相等，因此，選擇超聲提取；在提取溶劑體積、提取時(shí)間及提取次數(shù)方面，發(fā)現(xiàn)提取溶劑體積1∶25、提取2 h 和提取1 次最佳；鑒于經(jīng)過水飽和正丁醇萃取和氨試液處理后的色譜圖干擾峰明顯減少，本實(shí)驗(yàn)考察了萃取溶劑體積及萃取次數(shù)，結(jié)果表明，萃取3 次，每次40 mL 可萃取完全。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為提取溶劑，冷浸過夜，超聲（750 W，40 kHz）2 h，水飽和正丁醇萃取3 次，每次40 mL以制備供試品溶液。

3.2 檢測(cè)器選擇

本實(shí)驗(yàn)以熟三七、酒續(xù)斷、炙黃芪中的皂苷成分作為檢測(cè)對(duì)象，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)均為末端吸收，基線干擾大，且黃芪甲苷在紫外檢測(cè)下響應(yīng)小[12-14]，而在ELSD 下各個(gè)待測(cè)組分均顯示出了良好的響應(yīng)值，且基線干擾小，因此，選用ELSD進(jìn)行檢測(cè)。

3.3 系統(tǒng)適用性考察

通過檢測(cè)限與定量限試驗(yàn)，得出三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、黃芪甲苷檢測(cè)限分別為0.448、0.498、0.298、0.230、0.350 μg；定量限分別為0.897、0.996、0.596、0.460、0.700 μg，且RSD均小于3%。

本實(shí)驗(yàn)還對(duì)流速、柱溫及不同品牌的色譜柱進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)該方法在流速分別為0.9、1.0、1.1 mL·min-1時(shí)均有良好的適應(yīng)性，且RSD＜3%；在柱溫為20、25、30 ℃時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，RSD＜3%；通過對(duì)3 根不同品牌的色譜柱［Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Fortis Xi C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil?C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）］考察后發(fā)現(xiàn)其RSD＜5%，方法具有良好的適用性。

3.4 皂苷類成分的含量限度

按《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版（一部）中熟三七、酒續(xù)斷和炙黃芪的含量測(cè)定限度規(guī)定計(jì)算滇女金丸中相應(yīng)成分的含量，因滇女金丸為全粉入藥，根據(jù)藥材限度下浮10%計(jì)算，滇女金丸每1 g含熟三七以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1的總含量計(jì)，應(yīng)不得少于0.86 mg；含酒續(xù)斷以川續(xù)斷皂苷Ⅵ計(jì)，不得少于0.29 mg；含炙黃芪以黃芪甲苷計(jì)，不得少于0.01 mg。從測(cè)定結(jié)果可知，3批滇女金丸的含量均合格。