丹參酮ⅡA 注射液聯(lián)合大黃制劑對(duì)急性腎損傷小鼠氧化應(yīng)激凋亡的影響

王 敏，邢竹蘭

（南京市高淳中醫(yī)院，江蘇 211300）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是重癥醫(yī)學(xué)科較為常見的一種嚴(yán)重性疾病，患者死亡率高達(dá)70%。其中感染、創(chuàng)傷、腎灌注不足以及藥物中毒等均可能導(dǎo)致AKI 的發(fā)生［1-2］。AKI 的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，全身的炎癥反應(yīng)綜合征是誘發(fā)休克和機(jī)體多功能器官損害的重要病理生理過程［3］。但是目前有關(guān)AKI 的治療仍無有效措施，因此，積極尋求AKI 有效防治途徑顯得尤為迫切。本研究通過采用盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and perforation，CLP）方法制備膿毒癥誘導(dǎo)的小鼠AKI 模型，探究丹參酮ⅡA 注射液聯(lián)合大黃制劑對(duì)小鼠AKI 損傷的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性，周齡6～8 周，體質(zhì)量18～20 g，C57 BL/6 小鼠由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK（冀）2019-0006］，該實(shí)驗(yàn)通過河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 丹參酮ⅡA 磺酸鈉注射液（上海第一生化藥業(yè)公司,規(guī)格：2 ml∶10 mg，批號(hào)H31022558）；大黃制劑（大黃 1.5 g、黃芪 2.0 g、菊花1.5 g、丹參 1.0 g、甘草 1.5 g、茯苓 1.5 g、川芎 1.0 g）水煮至 20～30 ml，含藥濃度：0.5 g/ml，放置于 4 ℃，低溫保存4 周；HE 染色試劑盒（江蘇碧云天公司）；TUNEL 染色試劑盒（江蘇碧云天公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成有限公司）。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼庫爾特，型號(hào)：AU5800）；酶標(biāo)儀（賽默飛世爾，型號(hào)：SAF-680T）；高速離心機(jī)［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，型號(hào)：Micro17R］。

1.4 急性腎損傷模型制備 利用盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）構(gòu)建膿毒癥誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷模型。沿小鼠腹部正中線做1 cm 左右的切口，找到盲腸并在盲腸根部采用4 號(hào)線結(jié)扎盲腸，18 號(hào)靜脈穿刺針貫穿盲腸并擠出腸內(nèi)少許內(nèi)容物，操作完成后將盲腸還納入腹腔，縫合手術(shù)切口，之后腹腔注射氯化鈉注射液抗休克。假手術(shù)組小鼠除去對(duì)盲腸結(jié)扎和穿刺針穿孔，其余操作均與模型組小鼠操作一致。小鼠手術(shù)后3 d，造模成功標(biāo)志：小鼠精神倦怠、腹脹，剖腹后可見腹腔有血性或者膿性分泌物并且出現(xiàn)盲腸腫脹發(fā)黑等。以上現(xiàn)象表明小鼠造模成功［4］。并于造模成功后1 d 進(jìn)行分組給藥處理。

1.5 給藥處理 按照隨機(jī)數(shù)字表法分為：假手術(shù)組（Sham）、模型組（Model）和丹參酮ⅡA 注射液聯(lián)合大黃制劑治療組（TM）。Sham 小鼠自由飲水飲食；Model組小鼠腹腔注射給予10 ml/kg 氯化鈉注射液3 d，2次/d；丹參酮ⅡA 注射液聯(lián)合大黃制劑治療組小鼠給予丹參酮ⅡA 注射液10 ml/kg 腹腔注射和2 ml/kg的大黃制劑灌腸處理3 d，2 次/d，每次間隔12 h。以上各組小鼠每組各10 只，隨機(jī)選取6 只進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 標(biāo)本收集 Sham 組小鼠麻醉后取血液樣本2～3 ml。CLP 誘導(dǎo)小鼠AKI 成功3 d 后取小鼠血液樣本2～3 ml。丹參酮ⅡA 注射液聯(lián)合大黃制劑治療組小鼠治療3 d后于最后一次給藥12 h 后，取小鼠血液樣本2～3 ml。3 000 r/min 離心 10 min，取上清，并放置于-20 ℃冰箱保存。試劑盒和全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清BUN和Cr 含量。

1.7 蘇木素-伊紅（HE）染色 給予丹參酮ⅡA 注射液聯(lián)合大黃制劑治療3 d 后將各組小鼠處死，并分離腎臟組織，并按照試劑盒說明書進(jìn)行HE 染色觀察小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)變化。

1.8 TUNEL 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按照TUNEL 染色檢測(cè)試劑盒說明書對(duì)各組小鼠腎臟腎臟組織細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)。以腎臟組織出現(xiàn)綠色熒光顆粒判定為陽性。

1.9 腎臟組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 取同等質(zhì)量的各組小鼠腎臟組織研磨成組織勻漿，BCA 法測(cè)定各組蛋白質(zhì)總濃度后分別通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 檢 測(cè)SOD 和 MDA 含量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行試驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)采用表示，多組之間比較采用ANOVA 分析方法，兩組間差異的比較采用t 檢驗(yàn)方法，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA 注射液聯(lián)合大黃制劑對(duì)小鼠腎組織形態(tài)及功能的影響 Sham 組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞完整，腎間質(zhì)無充血以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無明顯損傷。Model 組小鼠腎小管上皮細(xì)胞腫脹、管腔狹窄、腎間質(zhì)水腫并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。TM 組小鼠腎臟組織上述現(xiàn)象明顯減輕（圖1）。與Sham 組比較，Model 組小鼠 BUN 和 Cr 含量顯著增加（P＜0.01）。與Model 組比較，TM 組小鼠BUN 和Cr 含量顯著降低（P＜0.05 或 P＜0.01），見表 1。

圖1 各組小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)變化（200×）

表1 各組小鼠 BUN 和 Cr 水平變化（，n=6）

表1 各組小鼠 BUN 和 Cr 水平變化（，n=6）

與 Sham 組比較，**P＜0.01；與 Model 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別BUN（mmol/L）Cr（μmol/L）Sham 組 6.70±1.06 86.60±12.50 Model 組 45.22±5.09** 730.44±78.66**TM 組 34.55±4.09## 640.35±54.88#

2.2 丹參酮ⅡA 注射液聯(lián)合大黃制劑對(duì)小鼠腎組織細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響 TUNEL 染色顯示，Model 組小鼠腎臟組織可見明顯的綠色熒光深顆粒，表明有大量的細(xì)胞凋亡。TM 組小鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡程度顯著降低（圖2）。與Sham 組小鼠比較，Model組 MDA 含量顯著增加（P＜0.01），SOD 水平顯著降低（P＜0.01）。與 Model 組比較，TM 組 MDA 含量顯著降低（P＜0.01），SOD 水平顯著升高（P＜0.01），見表 2。

圖2 各組小鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡情況（200×）

表2 各組小鼠 MDA 和 SOD 水平變化（，n=6）

表2 各組小鼠 MDA 和 SOD 水平變化（，n=6）

與 Sham 組比較，**P＜0.01；與 Model 組比較，##P＜0.01。

組別 MDA（U/mg·prot） SOD（U/mg prot）Sham 組 3.12±0.20 3.52±0.45 Model 組 7.01±0.80** 2.40±0.30**TM 組 5.44±0.49## 3.48±0.58##

3 討論

小鼠CLP 模型是膿毒癥的經(jīng)典模型，被廣泛應(yīng)用于膿毒癥的機(jī)制研究［5］。膿毒癥可以誘發(fā)機(jī)體的多功能臟器的損害，其中AKI 是膿毒癥誘發(fā)的最嚴(yán)重的并發(fā)癥，致死率極高［6］。盲腸穿孔導(dǎo)致腸道微生物滲出，釋放內(nèi)毒素，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子大量釋放，最終引起全身性的炎癥反應(yīng)。本研究首先通過CLP構(gòu)建小鼠AKI 模型。結(jié)果顯示，Sham 組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞完整，腎間質(zhì)無充血以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無明顯損傷。Model 組小鼠腎小管上皮細(xì)胞腫脹、管腔狹窄、腎間質(zhì)水腫并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。TM 組小鼠腎臟組織上述現(xiàn)象明顯減輕。以上研究證實(shí)丹參酮ⅡA 注射液聯(lián)合大黃制劑能夠?qū)LP 誘導(dǎo)的小鼠AKI 具有保護(hù)作用。以往研究證實(shí)丹參酮ⅡA 能夠通過抑制炎癥因子釋放和氧化應(yīng)激水平，從而減輕膿毒癥大鼠急性腎損傷［7］。另外，大黃制劑能夠通過調(diào)節(jié)免疫功能從而改善急性腎損傷患者臨床癥狀［8］。

血清中BUN 和Cr 是腎功能的重要檢測(cè)指標(biāo)，而血清中其水平主要是反映腎小球?yàn)V過功能［9］。AKI 時(shí)腎小球?yàn)V過率顯著降低，進(jìn)而導(dǎo)致血清中BUN 和Cr含量的升高。以往文獻(xiàn)報(bào)道，在CLP 誘導(dǎo)的AKI 模型中，降低BUN 和Cr 水平能夠有效減輕腎臟損傷［10］。本研究通過丹參酮ⅡA 注射液聯(lián)合大黃制劑治療組小鼠3 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Model 組小鼠比較，TM 組小鼠血清中BUN 和Cr 水平均顯著降低，表明丹參酮ⅡA注射液聯(lián)合大黃制劑能夠改善AKI 癥狀。氧化應(yīng)激性細(xì)胞凋亡是膿毒癥誘發(fā)AKI 的重要分子機(jī)制。在CLP 誘發(fā)的膿毒癥合并AKI 小鼠模型中活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平顯著升高，凋亡蛋白caspase3 表達(dá)顯著升高，Bcl-2 表達(dá)顯著降低。而通過抑制劑清除ROS 可以有效降低腎臟組織炎癥和細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善 AKI 腎臟損傷［11］。因此，通過降低腎臟組織細(xì)胞氧化應(yīng)激細(xì)胞凋亡能夠有效改善AKI 損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與Sham 組比較，Model 組MDA 含量顯著增加，SOD 水平顯著降低，小鼠腎臟組織可見明顯的綠色熒光深顆粒。與Model 組小鼠相比，給予丹參酮ⅡA 注射液聯(lián)合大黃制劑能夠增加腎臟組織SOD，降低MDA 含量，降低細(xì)胞凋亡。

綜上所述，丹參酮ⅡA 注射液聯(lián)合大黃制劑對(duì)CLP 誘導(dǎo)的AKI 具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過降低BUN 和Cr 水平，抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激凋亡。但是有關(guān)丹參酮ⅡA 注射液聯(lián)合大黃制劑對(duì)AKI 保護(hù)作用的具體分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。