藥物中N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

孔 璇

（天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070）

1991 年 Ashby 等［1］首次提出了基因毒性的概念，將其定義為經(jīng)過(guò)適當(dāng)遺傳毒性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，例如?xì)菌基因突變實(shí)驗(yàn)（Ames），證實(shí)其具有遺傳毒性的雜質(zhì)。痕量水平的基因毒性雜質(zhì)即可使細(xì)胞產(chǎn)生體內(nèi)誘變或基因突變，對(duì)人體遺傳物質(zhì)造成直接或間接的損傷，進(jìn)而引起癌變、畸變等遺傳毒性［2-3］。自纈沙坦事件發(fā)生以來(lái)，N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)受到了各國(guó)藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)的高度關(guān)注。本文對(duì)N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行了概述介紹，同時(shí)整理了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)藥物中該類雜質(zhì)的檢測(cè)方法的研究進(jìn)展。

1 N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)概述

1.1 N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu) N-亞硝胺類化合物的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式為A2-N-N=O，其中A 為烷基、芳香基或氫原子。亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)是公認(rèn)強(qiáng)致癌物之一［4-7］，并且隨著脂肪鏈的縮短，其致癌風(fēng)險(xiǎn)呈增大趨勢(shì)［8］。經(jīng)查詢世界衛(wèi)生組織官網(wǎng)，癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布了致癌物質(zhì)清單，其中N-亞硝胺類化合物包括N-亞硝基二甲胺、N-亞硝基二乙胺、N-亞硝基二丙胺、N-亞硝基甲基乙基胺、N-亞硝基二丁胺、N-亞硝基二苯胺、N-亞硝基哌啶、N-亞硝基嗎啉等多種該類物質(zhì)［9］。

1.2 N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的毒理作用 N-亞硝胺類化合物的致癌性強(qiáng)，致突變性高，即使在痕量水平，也能造成 DNA 和染色體損傷［10-11］。N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)一旦被人體攝入，即通過(guò)細(xì)胞色素P450 酶迅速發(fā)生代謝活化，生成了具有活性的小分子醛和烷基，進(jìn)而與DNA 和蛋白質(zhì)結(jié)合［12-13］，而后經(jīng)過(guò)一系列生化反應(yīng)，生成的產(chǎn)物烷基鳥(niǎo)嘌呤，會(huì)引起細(xì)胞遺傳突變［14］，可能會(huì)導(dǎo)致人體發(fā)生胃癌、肝癌等癌癥［15］，該類物質(zhì)的作用機(jī)理是破壞DNA 的復(fù)制和損傷機(jī)體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

1.3 國(guó)內(nèi)外對(duì)N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的規(guī)定及控制情況 《歐洲藥典》［16］及美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）［17］均明確規(guī)定了部分基因毒性雜質(zhì)的限度。我國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì)于2019 年1 月23 日發(fā)布了《關(guān)于＜中國(guó)藥典＞2020 年版四部通則增修訂內(nèi)容的公示》，新增內(nèi)容“遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則審核稿”，指導(dǎo)藥物基因毒性雜質(zhì)的分類和控制，該指導(dǎo)原則現(xiàn)已新增至《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則 9306［18］。

自2018 年7 月纈沙坦事件發(fā)生后，N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)在全球受到廣泛關(guān)注，多個(gè)國(guó)家的藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)發(fā)布了血管緊張素受體拮抗劑（ARB）類藥物中N-亞硝胺類雜質(zhì)通用檢查方法。隨后在雷尼替丁、二甲雙胍中均檢測(cè)到微量的N-亞硝基二甲胺（NDMA），更加引起人們對(duì)N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的關(guān)注［1］。歐洲藥品質(zhì)量管理局（EDQM）于 2020 年4 月7 日在其官網(wǎng)對(duì)外發(fā)布了N-亞硝胺分析通則的征求意見(jiàn)稿，并提供了3 種測(cè)定N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的方法［12］。

我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心于2020 年5 月8 日發(fā)布了《化學(xué)藥物中亞硝胺類雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》的通告（2020 年1 號(hào)）。

2 藥物中N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)

自纈沙坦事件發(fā)生以及后續(xù)發(fā)酵以來(lái)，國(guó)內(nèi)外各藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)紛紛積極應(yīng)對(duì)，出臺(tái)了許多官方的N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)的相關(guān)規(guī)定和指導(dǎo)原則等。目前也有文獻(xiàn)報(bào)道了原料藥或藥物制劑中N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)方法。

2.1 高效液相色譜法（HPLC） HPLC 法具有高壓、高效分離、高靈敏度分析速度和載液流速較快的特點(diǎn)，70%以上的有機(jī)化合物都可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析［19］。HPLC 法是藥物分析中最普遍、最常用的方法［20］。

范婷婷等［21］建立HPLC 法測(cè)定纈沙坦中NDMA的含量，該方法以20%甲醇為溶劑，色譜柱為資生堂（現(xiàn)為大曹色譜）C18型，流動(dòng)相為甲醇與水梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為228 nm，線性關(guān)系在0.003～1 μg/ml 濃度范圍內(nèi)良好（R2=1），檢出限（LOD）為 0.001 μg/ml，定量限（LOQ）為 0.003 μg/ml，6 次重復(fù)進(jìn)樣精密度為 0.3%，纈沙坦樣品的加樣回收率為95.1%（n=3），相對(duì)平均偏差（RSD）為0.1%，12 h 內(nèi)對(duì)照品溶液穩(wěn)定。該方法試樣前處理簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度和精密度較高，普適性好，可應(yīng)用于纈沙坦中NDMA 的檢測(cè)。

Sayaka 等［22］建立 HPLC 法測(cè)定纈沙坦中的 NDMA，采用光電二極管陣列檢測(cè)器（PDAD），在濃度0.011～7.4 μg/ml 范圍內(nèi)線性良好（R2＞0.999），LOD 為 0.008 5 μg/ml，LOQ 為 0.028 5 μg/ml，在測(cè)定纈沙坦的同時(shí)，也在西尼地平中檢測(cè)出了NDMA。該方法準(zhǔn)確度和精密度高，可用于纈沙坦原料藥及制劑中NDMA 的快速篩查和定量檢測(cè)。

2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS） 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）廣泛應(yīng)用于藥物、食品、環(huán)境、法醫(yī)、臨床等各個(gè)領(lǐng)域［23-24］，樣品進(jìn)樣后首先經(jīng)流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱分離，然后進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。質(zhì)譜根據(jù)被測(cè)物的質(zhì)荷比（m/z）進(jìn)行檢測(cè)，被測(cè)物在離子源轉(zhuǎn)換成氣相離子進(jìn)入質(zhì)譜，在三重四級(jí)桿中，一級(jí)質(zhì)譜掃描特定范圍離子或允許特定離子進(jìn)入碰撞室，在碰撞室內(nèi)分子離子碰撞裂解，形成子離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜，二級(jí)質(zhì)譜掃描特定范圍離子或允許特定離子進(jìn)入檢測(cè)器。LC-MS/MS 法可實(shí)現(xiàn)質(zhì)量分離、結(jié)構(gòu)鑒定、定性定量分析，具有自動(dòng)化程度高、準(zhǔn)確度高、選擇性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)［25］。

S?rgel 等［26］建立 LC-MS/MS 法測(cè)定沙坦類原料藥中的NDMA 和N-亞硝基二乙胺（NDEA），采用大氣壓化學(xué)電離（APCI）源，該方法靈敏度高，可同時(shí)定量檢測(cè)8 種沙坦類原料藥中的NDMA 和NDEA，NDMA 的LOQ為 0.000 26 μg/ml，NDEA 的 LOQ 為 0.000 13 μg/ml，除了原料藥樣品，另外在坎地沙坦制劑中也檢出了NDEA的存在。

袁松等［27］建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測(cè)定奧美沙坦酯中7 個(gè)N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)，采用APCI 離子源正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下，色譜柱為安捷倫poroshell PFP型（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），流動(dòng)相為 0.1%甲酸水溶液和甲醇梯度洗脫，流速0.4 ml/min，柱溫40 ℃；對(duì)7 個(gè)基因毒性雜質(zhì)：NDMA、NDEA、N-亞硝基二丙胺（NDPA）、N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）、N-亞硝基二丁胺（NDBA）、N-亞硝基乙基異丙基胺（NEIPA）、N-亞硝基-4-甲基-4-氨基丁酸（NMBA）同時(shí)測(cè)定。7 種雜質(zhì)濃度在 1～100 ng/ml 內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.995），LOD 范圍為 0.02～0.19 ng/ml，LOQ 為 0.06～0.65 ng/ml，平均加樣回收率為87%～106%。該方法靈敏度高，專屬性強(qiáng)，可用于同時(shí)對(duì)奧美沙坦酯原料藥中的7 種N-亞硝胺類雜質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)，可供該藥物的品控參考。

袁松等［28］還建立了 UPLC-MS/MS 法測(cè)定氯沙坦鉀和纈沙坦中的7 種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)，采用APCI 離子源正離子掃描，MRM 監(jiān)測(cè)模式，色譜柱為安捷倫Infinity Lab Poroshell 120 SB-AQ（3.0 mm×150 mm，2.7 μm），為了去除流動(dòng)相中對(duì)NDBA 檢測(cè)有干擾的雜質(zhì)，在液相色譜儀的進(jìn)樣器與泵混合器之間連接鬼峰捕集柱，安捷倫 Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×50 mm，2.7 μm），流動(dòng)相為 0.1%甲酸水溶液和甲醇梯度洗脫，流速0.5 ml/min，柱溫50 ℃；對(duì)7個(gè)雜質(zhì)：NDMA、NDEA 、NDPA、NDIPA、NDBA、NEIPA、NMBA 同時(shí)進(jìn)行定量檢測(cè)。氯沙坦為水溶系統(tǒng)，各雜質(zhì)濃度在 1～100 ng/ml 內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.995），LOD 范圍為 0.03～0.22 ng/ml，LOQ 為 0.09～0.76 ng/ml，平均加樣回收率為79.0%～108.8%；纈沙坦為甲醇溶系統(tǒng)，各雜質(zhì)濃度在1～100 ng/ml 內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.995），LOD 范圍為 0.05～0.29 ng/ml，LOQ 為 0.17～0.95 ng/ml，平均加樣回收率為81.0%～105.7%。該試驗(yàn)對(duì)3 批氯沙坦鉀原料藥和3 批纈沙坦原料藥進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出上述7 種N-亞硝胺類雜質(zhì)，12 h 內(nèi)對(duì)照品溶液穩(wěn)定，靈敏度高，精密度和重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，可以用來(lái)同時(shí)對(duì)氯沙坦鉀原料藥和纈沙坦原料藥中7 種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定，可供以上兩種化學(xué)藥品的品控參考。

徐艷梅等［29］建立 LC-MS/MS 法檢測(cè)厄貝沙坦原料藥及制劑中3 種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)。采用APCI 離子源正離子掃描，MRM 監(jiān)測(cè)模式下，色譜柱為菲羅門 Kinete F5（3.0 mm×100 mm，2.6 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液和甲醇梯度洗脫，流速0.3 ml/min，柱溫 40 ℃；對(duì) 3 個(gè)基因毒性雜質(zhì)：NDMA、NDEA 和NMBA 進(jìn)行定量檢測(cè)。3 個(gè)N-亞硝胺類雜質(zhì)濃度在0.26～32.0 ng/ml 內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.997 7），LOD范圍為 0.080～0.310 ng/ml，LOQ 為 0.268～1.033 ng/ml，NDMA、NDEA 和NMBA 加樣回收率分別為102.1%、98.1%和102.6%，對(duì)4 批厄貝沙坦原料藥及3 批厄貝沙坦分散片制劑進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出3 種雜質(zhì)，12 h 內(nèi)對(duì)照品溶液穩(wěn)定，日內(nèi)精密度和日間精密度、重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，可幫助該藥物的質(zhì)量控制。

劉博等［30］建立的液相-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（LC-HRMS）法，測(cè)定鹽酸二甲雙胍緩釋片中7 種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)，質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI），平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下，色譜柱為沃特世XSelect CSH C18（3.0 mm×150 mm，2.5 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液和甲醇梯度洗脫，流速0.3 ml/min，柱溫30 ℃；對(duì)7種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)：NDMA、NDEA、NDPA、NDIPA、NMBA、NEIPA、NDBA 同時(shí)進(jìn)行定量檢測(cè)。7 種雜質(zhì)濃度在 1～100 ng/ml 內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.995），LOD范圍為 0.3～0.5 μg/ml，LOQ 為 0.5～1.0 μg/ml，7 種雜質(zhì)的加樣回收率范圍為在82.6%～111.4%。8 h 內(nèi)加樣供試液穩(wěn)定，日內(nèi)精密度、重復(fù)性好，準(zhǔn)確度、靈敏度高；在3 批樣品中均可能含有N，N-二甲基甲酰胺（DMF）假陽(yáng)性干擾物的情況下，當(dāng)設(shè)置質(zhì)量偏差為5 μg/ml 時(shí)，應(yīng)用該方法可以實(shí)現(xiàn)混合對(duì)照溶液中DMF 與NDMA 的分離，進(jìn)而消除檢驗(yàn)過(guò)程中的假陽(yáng)性干擾影響，表明本方法具有很強(qiáng)的專屬性，可用于鹽酸二甲雙胍緩釋片的質(zhì)量品質(zhì)控制。

徐文峰［31］等建立的高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC-Q-TOF-MS）法，測(cè)定氯沙坦鉀及其復(fù)方制劑中的痕量雜質(zhì)NMBA，采用四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜，ESI 離子源，正離子模式下選擇［M+H］+m/z 147.076 4 對(duì)NMBA 進(jìn)行測(cè)定，色譜柱為安捷倫ZORBAX SB-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為 0.1%甲酸水溶液和乙腈梯度洗脫，流速0.3 ml/min，柱溫30 ℃；NMBA 濃度在 5～100 ng/ml 內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.995 6），LOD 為 1.0 ng/ml，LOQ 為 2.1 ng/ml，高、中、低 3 個(gè)濃度的平均加樣回收率為89.2%，精密度試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)RSD 均未超過(guò)10.0%。12 h 內(nèi)加樣供試液穩(wěn)定，該方法前處理操作便捷，靈敏度高，3 批供試品（包括1 批氯沙坦鉀片和2 批氯沙坦鉀氫氯噻嗪片）中均未檢出NMBA，可以更好地控制氯沙坦鉀等ARB 類藥物的質(zhì)量。

2.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS） 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）廣泛用于環(huán)境、食品、藥品等領(lǐng)域中沸點(diǎn)低、可氣化小分子有機(jī)化合物的檢驗(yàn)檢測(cè)［32］，氣相色譜部分的流動(dòng)相為惰性氣體，氣-固色譜法中以表面積大且具有一定活性的吸附劑作為固定相。當(dāng)多組分的混合樣品經(jīng)色譜柱分離后，先后進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器中。在質(zhì)譜中待測(cè)分子經(jīng)離子源轉(zhuǎn)化為離子，而后測(cè)量離子的質(zhì)荷比（m/z）。在這類儀器中，由于質(zhì)譜儀工作原理不同，又有氣相色譜-四極質(zhì)譜儀，氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，氣相色譜-離子阱質(zhì)譜儀等。GC-MS 法分析取樣量少，可有氣體和液體兩種進(jìn)樣形式，靈敏度高，定性定量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠［33-34］。

吳兆偉等［35］采用GC-MS 法測(cè)定纈沙坦中NDMA的含量，氣相色譜柱為安捷倫DB-WAX UI 石英毛細(xì)管柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm），載氣為氦氣，程序升溫分離，電子轟擊（EI）離子源，選擇離子檢測(cè)模式（SIM）監(jiān)測(cè)，檢測(cè)離子（m/z）：42、43、74 和 80，其中NDMA 定量離子（m/z）為 74，輔助定性離子（m/z）為42 和43，定量方法采用內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物為NDMA-d6，內(nèi)標(biāo)定量離子（m/z）為 80。NDMA 濃度在 3～300 ng/ml內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9），LOD 為1 ng/ml，LOQ 為3 ng/ml，試樣加標(biāo)回收率為103.2%。該方法測(cè)定了來(lái)自2 個(gè)廠家共9 批纈沙坦原料藥樣品，其中一廠家樣品未檢出，另一廠家樣品NDMA 含量為0.08～0.14 μg/g。12 h 內(nèi)供試品溶液內(nèi)標(biāo)物穩(wěn)定，前處理步驟簡(jiǎn)單，精密度和重復(fù)性好，靈敏度和準(zhǔn)確性高，可應(yīng)用于生產(chǎn)纈沙坦原料藥的質(zhì)量控制。

姜俊等［36］采用頂空GC-MS 法檢測(cè)厄貝沙坦原料藥中的NDMA 和NDEA，氣相色譜柱為島津H-Rtx-Wax（0.25 mm×30 m，0.5 μm），載氣為氮?dú)猓绦蛏郎胤蛛x，EI 電離源，SIM 模式監(jiān)測(cè)，NDMA 和 NDEA 的特征離子分別為74.00 和102.00。兩種雜質(zhì)濃度在10～500 ng/ml 內(nèi)線性關(guān)系良好（R2＞0.999），LOD 分別為 1.7 ng/ml 和 4.5 ng/ml，LOQ 分別為 5.2 ng/ml 和13.7 ng/ml，陰性及陽(yáng)性樣品加標(biāo)回收率為100.6%～108.7%。該方法精密度好，準(zhǔn)確度高，能夠有效地用于厄貝沙坦原料藥中NDMA 和NDEA 的檢測(cè)。

葛雨琦等［12］建立氣相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（GC-MS/MS）法，測(cè)定厄貝沙坦制劑中9 種N-亞硝胺基因毒性雜質(zhì)，氣相色譜柱為島津VF-WAXms（0.25 mm×30 m，0.5 μm），載氣為高純氦，程序升溫分離，EI 離子源，MRM 模式監(jiān)測(cè)；該方法以NDMA-d6和NDPA-d14為內(nèi)標(biāo)，可同時(shí)測(cè)定厄貝沙坦制劑中NDMA、NDEA、NDPA、NDBA、N-亞硝基甲基乙基胺、N-亞硝基二苯胺、N-亞硝基二芐胺、N-亞硝基哌啶、N-亞硝基嗎啉9 種雜質(zhì)。9 種雜質(zhì)濃度在5.0～283.1 ng/ml內(nèi) 線 性 關(guān) 系 良 好，LOD 為 0.1 ～20.6 ng/ml，LOQ 為0.3～78.3 ng/ml。平均加樣回收率為81.43%～123.2%，該報(bào)道檢測(cè)了多種厄貝沙坦制劑，包括厄貝沙坦片、厄貝沙坦分散片、厄貝沙坦氫氯噻嗪片、厄貝沙坦氫氯噻嗪分散片、厄貝沙坦膠囊和厄貝沙坦氫氯噻嗪膠囊等，檢出NDEA、N-亞硝基嗎啉和N-亞硝基二苯胺，檢出量為 NDMA 0.11～0.54 μg/g，N-亞硝基嗎啉 0.1～0.17 μg/g，N-亞硝基二苯胺 0.11～1.95 μg/g，值得注意的是，后兩者均為首次檢出。該方法靈敏度高、準(zhǔn)確度好，可幫助加強(qiáng)厄貝沙坦制劑的市場(chǎng)監(jiān)管，為其質(zhì)量控制提供參考。

周剛等［1］采用 GC-MS/MS 法，建立阿莫西林原料藥中12 種N-亞硝胺類化合物含量測(cè)定的方法，氣相色譜柱為安捷倫VF-WAXms（0.25 mm×30 m，0.25 μm），載氣為高純氦，程序升溫分離，EI 離子源，時(shí)間選擇反應(yīng)掃描模式（T-SRM）監(jiān)測(cè)，數(shù)據(jù)采集模式為一級(jí)質(zhì)譜采集母離子，定量定性分析采用二級(jí)質(zhì)譜監(jiān)測(cè)子離子。該方法對(duì)12 種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)：NDMA、NDEA、NDPA、NDBA、N-亞硝基甲基乙基胺、N-亞硝基-N-甲基苯胺、N-亞硝基-N-乙基苯胺、N-亞硝基哌啶、N-亞硝基吡咯烷、N-亞硝基嗎啉、N-亞硝基二苯胺和N-亞硝基二芐基胺同時(shí)進(jìn)行定量檢測(cè)，12 種雜質(zhì)濃度在0.5～200 ng/ml 內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.998），LOD 范圍為 0.033～0.481 ng/ml，LOQ 范圍為0.110～1.604 ng/ml，供試品用二氯甲烷溶解提取，試樣加標(biāo)回收率在為78.5%～106.6%。所建立的GCMS/MS 測(cè)定法操作簡(jiǎn)便，專屬性好，靈敏度高，精密度和重復(fù)性好，應(yīng)用前景良好，為阿莫西林原料藥的生產(chǎn)質(zhì)量控制提供參考。

王璐等［37］建立了GC-MS 法測(cè)定芬地柞酸左旋氯哌斯汀中的NDMA 和NDEA。色譜柱為安捷倫DBWAX 毛細(xì)管柱（0.25 mm×30 m，0.5 μm），程序升溫，載氣為氦氣，EI 電離源，MRM 模式監(jiān)測(cè)。NDMA 濃度在0.922 2～46.109 3 ng/ml 內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.998 3），NDEA 濃度在 0.235 6～411.781 0 ng/ml 內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 8），LOD 分別為 0.139 00 ng/ml 和0.045 83 ng/ml，LOQ 分別為 0.6177 ng/ml 和 0.258 4 ng/ml，平均加樣回收率分別為96.82%和95.93%。該方法測(cè)定了3 批芬地柞酸左旋氯哌斯汀原料藥，均未檢出NDMA 和NDEA，15 h 內(nèi)加標(biāo)供試品溶液穩(wěn)定，結(jié)果準(zhǔn)確度、靈敏度高，精密度和重復(fù)性好，耐用性好，可用于該品種原料藥生產(chǎn)的品控參考。

韓勇等［38］建立了GC-MS/MS 法測(cè)定纈沙坦氫氯噻嗪制劑中NDMA 和NDEA。色譜柱為賽默飛TGWAXMS 毛細(xì)管柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm），程序升溫，載氣為氦氣，EI 離子源，MRM 模式監(jiān)測(cè)。NDMA和 NDEA 濃 度 分 別 在 0.54 ～108.99 ng/ml 與 0.20 ～100.00 ng/ml 內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9，r=0.999 8），NDMA 的 LOD 為 0.22 ng/ml，NDMA 和 NDEA 的LOQ 分別為0.54 ng/ml 和0.20 ng/ml，平均加樣回收率分別為101.6%和102.0%。該方法對(duì)18 批纈沙坦氫氯噻嗪制劑（來(lái)源于4 家生產(chǎn)企業(yè)，3 種劑型）進(jìn)行了檢測(cè)，均檢出了NDMA，部分批次檢出NDEA。8 h內(nèi)加標(biāo)供試品溶液穩(wěn)定，樣品制備過(guò)程簡(jiǎn)單，精密度和重復(fù)性好，專屬性好，靈敏度和準(zhǔn)確度高，有助于纈沙坦氫氯噻嗪制劑中基因毒性雜質(zhì)的控制。

徐小力等［39］建立GC-MS 法測(cè)定不同廠家鹽酸二甲雙胍緩釋片中的NDMA。色譜柱為安捷倫VFWAXms（0.25 mm×30 m，0.25 μm）毛細(xì)管柱，載氣為氦氣，EI 離子源，程序升溫，MRM 模式監(jiān)測(cè)。NDMA 在0.25～50.00 ng/ml 濃度內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9），LOD 為0.25 ng/ml，加樣平均回收率為107.79%。該方法測(cè)定了目前市場(chǎng)上31 家廠家的鹽酸二甲雙胍緩釋片（共75 批）的NDMA 含量，部分批次有檢出。24 h內(nèi)對(duì)照品溶液穩(wěn)定，精密度和重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單、靈敏度和準(zhǔn)確度高，具有良好的應(yīng)用前景，可用來(lái)幫助生產(chǎn)鹽酸二甲雙胍緩釋片的質(zhì)量控制。

3 展望

基因毒性雜質(zhì)存在于多類藥品中，相比較于其他藥物雜質(zhì)，即使是人體痕量攝入即可損傷機(jī)體遺傳物質(zhì)，不言而喻，對(duì)服藥者（尤其長(zhǎng)期服藥者）的危害性十分嚴(yán)重。而被世衛(wèi)組織列入致癌物清單中的8 種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)更是具有高致突變性和強(qiáng)致癌性。近年來(lái)的相關(guān)檢測(cè)方法的研究報(bào)道雖然不夠成熟，但此類研究發(fā)展迅速，足以證明其在藥物分析專業(yè)界的重要程度。早期的文獻(xiàn)報(bào)道涉及的N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)較少，主要為NDMA 和NDEA，近來(lái)隨著研究的深入，越來(lái)越多的此類雜質(zhì)可被新穎的方法同時(shí)檢測(cè)，方法靈敏度也大有提高。按照目前的研究趨勢(shì)顯示，越來(lái)越多種潛在的N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)被檢出的可能性非常大，所以開(kāi)發(fā)不同原料藥及制劑劑型中該類雜質(zhì)的檢測(cè)的分析方法依然迫在眉睫。