HPV E6/E7 mRNA與p16/Ki-67雙染檢測的關(guān)系及對高危型人乳頭瘤病毒感染引起宮頸病變的檢出能力評估

彭海蘭 黃夢丹 林桂蘭 黃之文 羅愛華 黃 平

1.廣東省高州市人民醫(yī)院婦二科，廣東高州 525200；2.廣東省高州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東高州 525200；3.廣東省高州市人民醫(yī)院病理科，廣東高州 525200

宮頸癌屬于婦科常見惡性腫瘤，發(fā)病率位居女性惡性腫瘤第3位，病死率高，對女性生命健康威脅嚴(yán)重[1]。研究指出，宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）時(shí)期是預(yù)防宮頸癌發(fā)生的黃金時(shí)期，在此時(shí)期進(jìn)行干預(yù)可減少宮頸癌發(fā)生[2]。近年來，隨著診斷水平的提升，研究發(fā)現(xiàn)高危型人乳頭瘤病毒（HPV）E6/E7 mRNA可反映病毒的致癌活性，檢測HPV E6/E7 mRNA可為臨床診斷提供一定依據(jù)[3]。另有研究指出，p16/Ki-67雙染檢測技術(shù)能有效檢出宮頸癌前病變，可降低宮頸癌前病變漏診率[4]。兩者均對宮頸病變診斷具有一定價(jià)值，但兩者聯(lián)合應(yīng)用是否可進(jìn)一步提升診斷效能的臨床研究甚少。基于此，本研究選取高州市人民醫(yī)院收治的200例高危型HPV感染患者進(jìn)行研究，旨在探究HPV E6/E7 mRNA與p16/Ki-67雙染檢測的診斷價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究經(jīng)高州市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。選取2020年1月至2021年4月高州市人民醫(yī)院收治的200例高危型HPV感染患者作為研究對象，年齡21～60歲，平均（40.52±5.88）歲；體重指數(shù) 18.9～ 27.7 kg/m2，平均（23.56±1.51）kg/m2；孕次0～4次，平均（1.95±0.47）次。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①均為高州市人民醫(yī)院收治的高危型HPV感染女性，均存在不同程度下腹墜脹感、分泌物增多、陰道不規(guī)則出血、白帶增多等癥狀；②均接受病理組織檢查并明確病情；③均行HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67雙染檢測；④檢查前3 d內(nèi)無性生活、陰道用藥；⑤宮頸完整；⑥均知情本研究，并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并重要器官功能障礙者；②精神異常、認(rèn)知功能障礙者；③血液、免疫系統(tǒng)疾病者；④妊娠、哺乳期女性；⑤伴其他惡性腫瘤者。

1.3 方法

1.3.1 儀器及試劑盒 廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司提供p16/Ki-67試劑盒（批號：2007001）；廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司提供HPV E6/E7 mRNA試劑盒（批號：2105009）；廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司提供液基細(xì)胞儀（型號：DC-4212，序列號：KS-GD-0099）、生物顯微鏡（型號：CX43，序列號：9J51154）、多功能流式點(diǎn)陣儀（型號：Luminex 200，序列號：10017272422）；深圳市金科威實(shí)業(yè)有限公司提供陰道窺鏡（型號：Slc-2000B）。

1.3.2 標(biāo)本采集及制片 采用陰道張開器或窺陰鏡使陰道充分暴露，收集足量分泌物、脫落細(xì)胞制成洗脫液，取1 ml液體置于HPV E6/E7 mRNA檢測試管中，剩余液體制備2張宮頸細(xì)胞學(xué)薄片分別進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查及p16/Ki-67雙染檢測。

1.3.3 p16/Ki-67雙染檢測 利用免疫細(xì)胞化學(xué)雙染法的原理進(jìn)行檢測，病理科醫(yī)師在顯微鏡下閱片，若視野中出現(xiàn)至少1個宮頸細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈紅色（p16），細(xì)胞核呈黃色或棕色（Ki-67）則判讀為陽性；p16/Ki-67雙染檢測陽性標(biāo)準(zhǔn)：p16、Ki-67同時(shí)出現(xiàn)在一個細(xì)胞內(nèi)，胞核紅染、胞質(zhì)棕黃染為陽性；只有一個顯色或無顯色為陰性。

1.3.4 HPV E6/E7 mRNA 采用多功能流式點(diǎn)陣儀實(shí)施擴(kuò)增、顯色，再在擴(kuò)增體系中加入1 μl DNA抽提液，按照試劑盒擴(kuò)增程序持續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，計(jì)算機(jī)讀取檢測結(jié)果，其中HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)＜ 1.0 copy/ml為陰性，反之為陽性。

1.3.5 細(xì)胞學(xué)檢查 采用液基細(xì)胞儀進(jìn)行涂片染色，由專業(yè)醫(yī)師按照《子宮頸細(xì)胞學(xué)Bethesda報(bào)告系統(tǒng)》[5]對涂片進(jìn)行分析，分為未見上皮內(nèi)病變或惡性病變（NILM）、未確定意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞病變（ASCUS）、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）、浸潤癌。

1.3.6 病理組織檢查 將陰道窺鏡置入陰道，暴露陰道與宮頸連接部位，觀察宮頸形態(tài)、大小等情況，采用陰道鏡放大子宮頸圖片，采用5%乙酸進(jìn)行涂抹，在異常處取病理組織放入中性福爾馬林緩沖液中固定8 h，再實(shí)施石蠟包埋切片、染色，進(jìn)行病理學(xué)診斷，依據(jù)《WHO女性生殖器官腫瘤學(xué)分類（第4版）解讀》[6]對宮頸組織學(xué)診斷結(jié)果實(shí)施評估，分為宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、浸潤癌，其中NILM、CINⅠ為陰性，CINⅡ、CINⅢ、浸潤癌為陽性。

1.4 觀察指標(biāo)及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

①記錄病理組織檢查、細(xì)胞學(xué)檢查、HPV E6/E7 mRNA與p16/Ki-67雙染檢測陽性結(jié)果。②比較不同細(xì)胞學(xué)類型患者HPV E6/E7 mRNA與p16/Ki-67雙染檢測陽性率。③比較不同病理學(xué)類型患者HPV E6/E7 mRNA與p16/Ki-67雙染檢測陽性率。④比較不同HPV E6/E7 mRNA表達(dá)情況患者p16/Ki-67雙染檢測陽性率。⑤分析HPV E6/E7 mRNA與p16/Ki-67雙染檢測的關(guān)系。⑥以病理組織檢查為“金標(biāo)準(zhǔn)”，統(tǒng)計(jì)HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67雙染檢測及聯(lián)合檢查對CINⅡ+的檢查結(jié)果及診斷效能。聯(lián)合檢查陽性標(biāo)準(zhǔn)：任意單一檢查為陽性即為陽性。CINⅡ+是指CINⅡ、CINⅢ、浸潤癌。敏感度=真陽性例數(shù)/（真陽性+假陰性）例數(shù)×100%；特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性+假陽性）例數(shù)×100%；準(zhǔn)確度=（真陽性+真陰性）例數(shù)/（真陽性+假陰性+真陰性+假陽性）例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，多因素分析采用logistic回歸分析法。P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理組織檢查、細(xì)胞學(xué)檢查、HPV E6/E7 mRNA與p16/Ki-67雙染檢測陽性結(jié)果

200例宮頸病變患者經(jīng)病理組織檢查證實(shí) 宮 頸 炎 54例、CINⅠ 45例、CINⅡ 39例、CINⅢ33例、浸潤癌29例；經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢查證實(shí)NILM 51例、ASCUS 41例、LSIL 31例、HSIL 47例、浸潤癌30例；經(jīng)HPV E6/E7 mRNA檢出92例陽性，108例陰性；經(jīng)p16/Ki-67雙染檢測檢出84例陽性，116例陰性。

2.2 不同細(xì)胞學(xué)類型患者HPV E6/E7 mRNA與p16/Ki-67雙染檢測陽性率比較

隨細(xì)胞學(xué)診斷級別的提升，HPV E6/E7 mRNA與p16/Ki-67雙染檢測陽性率逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表1。

表1 不同細(xì)胞學(xué)類型患者HPV E6/E7 mRNA與p16/Ki-67雙染檢測陽性率比較[n（%）]

2.3 不同病理學(xué)類型患者HPV E6/E7 mRNA與p16/Ki-67雙染檢測陽性率比較

隨病理學(xué)診斷級別提升，HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67雙染檢測陽性率逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表2。

表2 不同病理學(xué)類型患者HPV E6/E7 mRNA與p16/Ki-67雙染檢測陽性率比較[n（%）]

2.4 HPV E6/E7 mRNA與p16/Ki-67雙染檢測的關(guān)系

HPV E6/E7 mRNA陽性患者的體重指數(shù)、p16/Ki-67雙染檢測陽性率高于陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；HPV E6/E7 mRNA 陽性、陰性患者間年齡、孕次比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表3。將體重指數(shù)、p16/Ki-67雙染陽性占比作為自變量，HPV E6/E7 mRNA表達(dá)情況作為因變量納入多因素logistic回歸模型，結(jié)果顯示，p16/Ki-67雙染陽性為HPV E6/E7 mRNA陽性的危險(xiǎn)因素。見表4～5。

表3 HPV E6/E7 mRNA陽性的單因素分析

表4 變量賦值

表5 HPV E6/E7 mRNA陽性的多因素分析

2.5 HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67雙染檢測及聯(lián)合檢查的檢查結(jié)果及診斷效能

聯(lián)合檢查診斷CINⅡ+敏感度高于HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67雙染檢測單獨(dú)診斷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表6 ～ 7。

表6 HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67雙染檢測及聯(lián)合檢查的檢查結(jié)果

表7 診斷效能[%（n/N）]

3 討論

近年來隨人們飲食習(xí)慣及生活方式改變，宮頸癌發(fā)病率逐漸增加且趨于年輕化，對女性生命健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅[7-8]。宮頸癌發(fā)生、發(fā)展時(shí)間較長，由癌前病變發(fā)展為宮頸癌需十年以上的時(shí)間[9]。因此及時(shí)發(fā)現(xiàn)癌前病變并準(zhǔn)確鑒別，對減少宮頸癌發(fā)生、提高治療效果、改善預(yù)后十分重要。

宮頸活檢為診斷宮頸病變的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其為有創(chuàng)檢查，且取材局限，導(dǎo)致患者難以接受，不利于疾病篩查[10]。因此，找尋一種簡單、快速、準(zhǔn)確地診斷宮頸病變的方式對患者十分重要。HPV E6/E7 mRNA為宮頸癌及癌前病變的致病因素，有研究指出，女性感染HPV后，約40%患者會發(fā)生宮頸上皮內(nèi)瘤病變，且持續(xù)感染者病變率更高，因此測定患者HPV感染情況有助于區(qū)分宮頸病變等級[11]。p16屬于抑癌基因，在多種腫瘤疾病中，p16均存在缺失、突變，造成細(xì)胞周期紊亂，細(xì)胞無限生長，引發(fā)癌變，但單獨(dú)p16診斷仍依賴于細(xì)胞形態(tài)；Ki-67是反映細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，在正常細(xì)胞內(nèi)p16、Ki-67不會同時(shí)表達(dá)，但其在宮頸高級別病變中具有較高的一致性，通過檢測HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67表達(dá)情況可對宮頸病變進(jìn)行診斷鑒別[12-13]。本研究通過分析不同細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)類型的宮頸病變患者HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67雙染陽性表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，隨細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)診斷級別的提升，HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67雙染陽性率逐漸增加（P＜ 0.05），這一結(jié)果與國外 Celewicz等[14]研究結(jié)果一致，提示HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67雙染陽性表達(dá)情況可一定程度地反映患者病變程度。本研究分析HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67雙染檢測結(jié)果關(guān)系發(fā)現(xiàn)，HPV E6/E7 mRNA陽性患者p16/Ki-67雙染陽性率高于HPV E6/E7 mRNA陰性患者，這與國外相關(guān)研究類似[15]。這是由于女性感染HPV病毒后，病毒基因可與宿主基因發(fā)生整合，形成致癌蛋白E7，可影響細(xì)胞周期循環(huán)，使細(xì)胞增殖不受控制，導(dǎo)致p16過表達(dá)，且p16/Ki-67與HPV感染導(dǎo)致的癌性轉(zhuǎn)化有關(guān)[16]。

本研究進(jìn)一步分析HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67雙染檢測的診斷價(jià)值發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢查診斷CINⅡ+敏感度高于HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67雙染檢測單獨(dú)診斷（P＜ 0.05），由此說明聯(lián)合 HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67雙染檢測診斷可提升對CINⅡ+的敏感度，有利于早期及時(shí)篩查，并制訂針對性干預(yù)措施，以降低宮頸癌發(fā)生率。

綜上所述，HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67雙染檢測聯(lián)合用于診斷CINⅡ+的診斷價(jià)值敏感度更高，可為宮頸癌前病變篩查提供指導(dǎo)，同時(shí)可顯著降低陰道鏡轉(zhuǎn)診率，減少不必要的陰道鏡轉(zhuǎn)診，防止過度診斷，協(xié)助臨床醫(yī)師對患者進(jìn)行準(zhǔn)確分層管理，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)患者早期干預(yù)。p16/Ki-67和HPV E6 /E7 mRNA作為宮頸病變發(fā)生、發(fā)展中重要的生物學(xué)標(biāo)志物，其無創(chuàng)的檢測特點(diǎn)受到患者的普遍認(rèn)可。p16/Ki-67雙染檢測和HPV E6/E7 mRNA結(jié)果易于判讀、具有更好的重復(fù)性和簡便性，其臨床應(yīng)用價(jià)值較高。本研究存在一定不足，在后期的工作將繼續(xù)擴(kuò)大樣本容量，深入研究p16/Ki-67雙染檢測、HPV E6/E7 mRNA和聯(lián)合檢測與宮頸癌前病變患者轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性，以期更合理地對宮頸病變患者進(jìn)行有效診治。