rDNA和端粒重復序列鑒定馬鈴薯和茄子體細胞雜種染色體丟失和融合

王海波 應靜文 何 禮,3 葉文宣 涂 衛(wèi) 蔡興奎 宋波濤,* 柳 俊

研究簡報

rDNA和端粒重復序列鑒定馬鈴薯和茄子體細胞雜種染色體丟失和融合

王海波1,2應靜文1何 禮1,3葉文宣1涂 衛(wèi)1蔡興奎1宋波濤1,*柳 俊1

農業(yè)農村部馬鈴薯生物學與生物技術重點實驗室/ 園藝植物生物學教育部重點實驗室/ 湖北省馬鈴薯工程技術研究中心/ 華中農業(yè)大學, 湖北武漢 430070;2湖北民族大學生物科學與技術學院, 湖北恩施 445000;3四川省農業(yè)科學院園藝研究所, 四川成都 610066

植物體細胞雜交是植物種質資源創(chuàng)制的重要方法。體細胞雜種在原生質體再生的過程中染色體會產生非常多的遺傳變異。研究體細胞雜種的染色體行為為馬鈴薯體細胞雜種的創(chuàng)制和利用提供理論基礎。本研究采用rDNA和端粒重復序列作為探針進行原位雜交(fluorescence in situ hybridization), 并結合基因組原位雜交(genomic in situ hybridization), 對馬鈴薯和茄子體細胞雜種染色體組成和變異進行了分析。原位雜交結果表明, 體細胞雜種中存在馬鈴薯和茄子融合的染色體和雙著絲粒染色體, 并發(fā)現部分融合染色體是由馬鈴薯和茄子2號染色體末端對末端融合得到的。重排的雙著絲粒染色體的著絲粒一個來源于馬鈴薯, 一個來源于茄子。此外, 體細胞雜種中來源于茄子的5S rDNA在體細胞雜種再生及穩(wěn)定的過程中全部丟失。研究結果表明馬鈴薯與茄子在進行體細胞雜交的過程中, 染色體是不穩(wěn)定的, 容易造成融合后代出現雙著絲粒和染色體重排等現象。體細胞雜種的染色體會通過染色體重排、雙著絲粒、rDNA均一化等多種形式使其染色體趨于穩(wěn)定。

馬鈴薯; 茄子; 體細胞雜種; rDNA; 染色體重排

馬鈴薯(L.)是重要的非谷物類糧食作物, 在保障我國糧食安全和全面脫貧攻堅中具有重要的作用。由于栽培種和野生種之間存在倍性差異以及胚乳平衡數(Endosperm balance number, EBN)不匹配等原因導致遠緣雜交不親和, 使得野生種中抗性資源難以向栽培種轉移。原生質體融合技術的發(fā)展和成熟為馬鈴薯野生種優(yōu)良遺傳資源利用和種質資源創(chuàng)制提供了非常好的方法。前人通過原生質體融合創(chuàng)制了非常多的優(yōu)良材料, 為作物遺傳育種提供了非常多的優(yōu)良材料。例如, 小麥通過與高冰草等小麥近緣屬禾草的非對稱體細胞融合, 可以使小麥產生帶有部分近緣屬禾草染色體片段的漸滲系, 從而實現優(yōu)良性狀的轉移[1-2]。前人通過馬鈴薯體細胞雜交創(chuàng)制了非常多的具有生物或者非生物脅迫抗性的馬鈴薯種質資源, 如抗晚疫病[3-4]、抗青枯病[5-6]、抗病毒[7-8]、抗寒[9]、耐鹽[10]等, 并將這些優(yōu)良的種質資源運用到馬鈴薯育種中。

體細胞融合后經過再生過程, 染色體會發(fā)生比較多的變異, 例如重排、缺失、雙著絲粒等?；蚪M原位雜交(Genomic in situ hybridization, GISH)是區(qū)分體細胞雜種染色體來源的非常有效的工具[11-12]。有研究表明, 馬鈴薯和茄子的染色體是可以通過GISH進行有效區(qū)分的[13]。除了GISH以外, 還有一些染色體特異的細胞遺傳學DNA標記也可以通過熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)用到馬鈴薯茄子體細胞雜種研究中。例如, 馬鈴薯和茄子的5S rDNA都定位在1號染色體上, 25S rDNA在馬鈴薯和茄子2號染色體上都產生非常明顯的信號, 但是茄子25S rDNA在其他4條染色體也能觀察到信號[13]。馬鈴薯和茄子的端粒重復序列在染色體末端都能產生明顯的熒光信號[13]。這些特異的細胞遺傳學DNA標記都可以用于研究體細胞雜種中染色體的行為, 通過對體細胞雜種染色體行為的研究, 可以使我們了解體細胞雜種的染色體遺傳變異, 利于體細胞雜種的利用。

本研究通過GISH與rDNA等細胞遺傳學DNA標記相結合, 對體細胞雜種中染色體來源進行分析, 并對其中的雙著絲粒染色體的形成原因進行分析, 對遠源體細胞雜種原生質體融合再生過程中的染色體特殊行為有一個初步的了解, 為利用馬鈴薯體原生質體融合創(chuàng)制種質資源提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究所用到的植物材料包括栽培種馬鈴薯AC142 (二倍體), 栽培種茄子508.3 (二倍體), AC142和508.3的對稱融合體細胞雜種PE60-10 (非整倍體)、PE60-13 (非整倍體)等[14]。

1.2 中期染色體制片

組培苗接種在含40 g L–1蔗糖的MS培養(yǎng)基中生長1周左右, 待根尖生長到1 cm左右時進行預處理。在上午9點左右, 植物根尖生長旺盛的時間將根尖取下, 用蒸餾水洗凈培養(yǎng)基, 然后用2 mmol L–1的8-羥基喹啉(Sigma, USA)處理2～3 h[15], 預處理后的根尖用移液器吸凈8-羥基喹啉, 然后用蒸餾水洗凈, 并吸干水分, 然后用卡諾固定液(冰醋酸∶無水乙醇 = 1∶3)固定24 h以上, 然后將根尖保存在70%乙醇中備用。

固定好的根尖用手術刀片截取最前端偏白色的部分, 大約1～2 mm, 然后進行酶解。酶解的酶液為纖維素酶(Yakult, Japan)和果膠酶(Sigma, USA)的混合酶液, 37℃酶解90 min左右, 然后用移液器吸干凈酶液, 并用蒸餾水漂洗10 min左右, 然后用移液器使用剪掉頭的槍頭將根尖吸出, 置于干凈的載玻片上, 解剖針刮掉多余的水, 再加上卡諾固定液, 并用鑷子將根尖敲碎勻漿, 并均勻散布到載玻片的一定范圍內, 最后再加2滴卡諾固定液將細胞碎片等雜質沖洗干凈, 室溫陰干備用。

1.3 原位雜交

陰干的中期染色體制片在相差顯微鏡下進行鏡檢, 挑選出分裂相多且染色體形態(tài)較好的染色體制片用于下一步原位雜交試驗。原位雜交試驗的具體步驟參考何禮[13]。完成原位雜交試驗的染色體制片置于黑暗條件下室溫陰干, 然后用含有抗淬滅劑Vectarshield (Vector, USA)的DAPI (Roche, Switzerland)進行復染, 然后利用ZEISS AXIOSKOP40正置熒光顯微鏡進行鏡檢, Hamamatsu ORCA-R2 (Hamamatsu Photonics, Japan) CCD采集圖片。使用Image Pro Plus 6.0進行偽彩添加、雜交信號和染色體圖片的疊加。最后用Photoshop CS6 (Adobe, USA)進行圖片調整和圖版制作。

2 結果與分析

2.1 端粒重復序列和rDNA在融合親本上的定位

前期研究表明, 端粒重復序列在馬鈴薯和茄子染色體末端都可以檢測到非常明顯的FISH信號[16]。本研究對5S rDNA、25S rDNA在AC142和508.3的定位進行分析發(fā)現, 5S rDNA在AC142和508.3上都得到2個明顯的信號(圖1-a, b)。根據前人研究結果, 這2條染色體為1號染色體。25S rDNA在AC142上可以得到2個明顯的熒光信號, 這2個信號位于2號染色體末端核仁組織區(qū)(圖1-a); 在508.3上, 25S rDNA得到了6個明顯的信號(圖1-b), 這6個信號中有2個是位于2號染色體末端核仁組織區(qū)的。說明rDNA可以用來識別馬鈴薯和茄子體細胞雜種中的特定染色體。

2.2 體細胞雜種中rDNA的丟失

利用5S rDNA和25S rDNA作為染色體特異的細胞遺傳學標記, 結合基因組原位雜交(GISH), 對體細胞雜種PE60-13的rDNA的組成及來源進行分析。結果表明, PE60-13中5S rDNA信號全部來自于馬鈴薯染色體, 11個25S rDNA信號中, 4個來自于茄子, 7個來自于馬鈴薯(圖2); 說明PE60-13中來源于茄子的5S rDNA信號在融合再生的過程中容易發(fā)生丟失, 并且來源于茄子的25S rDNA信號也比較容易丟失。

2.3 體細胞雜種中融合染色體的重排方式及來源

馬鈴薯和茄子體細胞雜種在融合的過程中, 染色體發(fā)生了比較多的變異, 包括染色體的丟失和重排等。利用不同的細胞遺傳學標記對馬鈴薯和茄子體細胞雜種的一個重排染色體進行分析發(fā)現, 這個重排的染色體的內部存在很大的一個25S rDNA區(qū)域, 并且這個25S rDNA是來自于馬鈴薯和茄子染色體的(圖3-a, b)。此外, 還發(fā)現該重排染色體的內部存在端粒重復序列的信號(圖3-c, d)。因此, 根據體細胞雜種PE60-10中該染色體的組成、形態(tài)以及含有較多的端粒重復序列, 我們推測該染色體是馬鈴薯和茄子2號染色體末端對末端融合得到的(圖4)。

圖1 rDNAs在AC142和508.3上的定位

a: rDNAs在AC142上的定位; b: rDNAs在508.3上的定位, 其中a、b中紅色熒光信號為5S rDNA信號, 綠色熒光信號為25S rDNA信號。標尺為10 μm。

a: the distribution of rDNAs on AC142; b: the distribution of rDNAs location on 508.3.Red signals denote 5S rDNA signals, green signals denote 25S rDNA signals.Bar: 10 μm.

圖2 rDNA探針結合GISH鑒定馬鈴薯和茄子體細胞雜種中染色體的組成

a: 體細胞雜種60-13染色體中含有rDNA位點染色體的識別(紅色為5S位點, 綠色為25S位點); b: 來自a中的染色體經過洗滌后再開展GISH鑒定其親本來源(紅色為馬鈴薯染色體, 綠色為茄子染色體)。箭頭指示25S位點, 箭指示5S位點。標尺為10 μm。

a: recognition of chromosomes containing rDNA sites in somatic hybrid 60-13 (red signals denote 5S sites, green signals denote 25S sites);b: recognition of parental chromosome origins by GISH performed after washing (Red signals denote chromosomes of.Green signals denote chromosomes of.).Arrowheads denote 25S sites, arrows denote 5S sites.Bar: 10 μm.

圖3 rDNA、端粒重復序列結合GISH鑒定體細胞雜種中重排染色體的來源

a: 體細胞雜種PE60-10染色體中含有rDNA的染色體的識別(紅色為5S位點, 綠色為25S位點); b: 來自a中的染色體經過洗滌后再開展GISH鑒定其親本來源(紅色為馬鈴薯染色體, 綠色為茄子染色體); c: 端粒探針信號在體細胞雜種PE60-10染色體中的分布(紅色為端粒探針信號); d: 來自c中的染色體經過洗滌后再開展GISH鑒定其親本來源(紅色為馬鈴薯染色體, 綠色為茄子染色體)。圖a和b中箭頭指示25S位點, 箭指示5S位點, 圖c和d中橢圓和圓形框指示含有rDNA位點的重排染色體。圖a、b、c和d方框中放大的染色體為橢圓框中指示的染色體。標尺為10 μm。

a: the recognition of chromosomes containing rDNA sites in somatic hybrid PE60-10, red blocks denote 5S rDNA sites, green blocks denote 25S rDNA sites; b: the recognition of parental chromosome origins in (a) by GISH performed after washing, red denoted chromosomes from potato,green denoted chromosomes from eggplant.; c: the distribution of telomeric probe signals in PE60-10, red denoted the telomeric sites; d: the results of GISH performed after washing telomeric probe signals, red denoted chromosomes from potato, green denoted the chromosomes from eggplant.Arrowheads denoted 25S rDNA sites; arrows denoted 5S rDNA sites.White ellipse and rounded frames denote rearrangement chromo-somes containing 25S rDNA sites.The enlarged chromosomes in Fig.a, b, c, d denote chromosomes with white frames.Bar: 10 μm.

圖4 體細胞雜種PE60-10中末端融合的染色體產生的示意圖

染色體上明顯染色很淺的區(qū)域為核仁組織區(qū)(NOR)。圖中的染色體來自作為體細胞融合的馬鈴薯和茄子親本, 以及它們的體細胞雜種PE60-10。

The apparent lightly stained areas on chromosomes denote nucleo-lar organizing regions (NOR).Chromosomes in the picture are from parents for somatic fusion between potato and eggplant, and their somatic hybrid PE60-10.

2.4 體細胞雜種中的雙著絲粒及其形成方式

在馬鈴薯和茄子體細胞雜種PE60-10中發(fā)現了具有雙著絲粒的重排染色體。通過基因組原位雜交試驗發(fā)現, 重排染色體中的2個著絲粒中的一個位于茄子染色體片段上, 另外一個位于該重排染色體發(fā)生重排的區(qū)域(圖5)。前期對茄子中期染色體形態(tài)觀察, 并沒有發(fā)現具有2個著絲粒的染色體, 這說明茄子染色體都只有1個著絲粒, 因此該雙著絲粒染色體重排區(qū)域的著絲粒來源于馬鈴薯。

3 討論

端粒重復序列、rDNA是植物基因組中比較常見的重復序列, 并且這些序列相對比較保守且在染色體上定位位置相對固定[16-19]。此外, 還有報道利用端粒重復序列和著絲粒重復序列對茄屬物種進行分析, 發(fā)現在其著絲粒區(qū)域也存在端粒重復序列, 這對于端粒重復序列的進化和著絲粒的形成具有重要的意義。利用這些染色體特異的細胞學標記, 結合基因組原位雜交, 可以對體細胞雜種的染色體行為進行研究, 從而加深對體細胞雜種融合過程中染色體的行為的了解。

前人研究表明, 在新形成的異源多倍體中, rDNA位點的數量常常會發(fā)生變化[20], 其中一個親本的rDNA位點會容易發(fā)生減少或者丟失[21]。異源多倍體其中一個物種的rDNA迅速丟失, 對雜種的rDNA基因均一化起到至關重要的作用[22]。本研究中, PE60-13中來源于茄子的5S rDNA位點全部發(fā)生了丟失, 這表明馬鈴薯和茄子體細胞雜種的5S rDNA在朝著馬鈴薯5S rDNA基因均一化的方向發(fā)展, 并以此來促進體細胞雜種染色體組的穩(wěn)定性。

圖5 體細胞雜種PE60-10中染色體重排形成的雙著絲粒

a和b分別顯示來自體細胞雜種PE60-10的2個染色體分裂相。箭指示具有雙著絲粒的染色體。白色方框中顯示該染色體的黑白圖片以利于觀察染色體上的縊痕。白色線條指示主縊痕, 黃色線條指示該染色體上另外一個明顯的縊痕。標尺為10 μm。

a and b are two chromosome spreads of somatic hybrid 60-10.Arrows denote chromosomes with two centromeres.The white frames indicate chromosomes in black and white for better observation of constrictions.White lines denote primary constrictions, yellow lines denote another apparent constriction on chromosomes, respectively.Bar: 10 μm.

馬鈴薯和茄子對稱融合體細胞雜種中發(fā)現了多條重排染色體, 對其中部分重排染色體來源進行分析, 發(fā)現PE60-10中的一條重排染色體是通過馬鈴薯和茄子2號染色體末端對末端融合得到的。這暗示著馬鈴薯和茄子在原生質體融合后再生的過程中, 2號染色體很有可能不穩(wěn)定, 容易發(fā)生重排。此外, 本研究發(fā)現, 馬鈴薯+茄子對稱融合體細胞雜種中存在比較多的染色體重排的現象。種間體細胞雜種著絲粒不穩(wěn)定, 容易發(fā)生重組[23], 雙著絲粒的染色體可以通過表觀修飾, 使其中的一個著絲粒失活從而達到穩(wěn)定狀態(tài), 并且會通過異染色質化阻止其重新活化[24]。本研究中, 在PE60-10中發(fā)現了具有雙著絲粒的重排染色體, 并且這2個著絲粒分別來源于馬鈴薯和茄子的染色體(圖5), PE60-10的雙著絲粒染色體經過多次繼代繁殖之后, 仍然能夠穩(wěn)定的存在。因此, PE60-10中具有雙著絲粒的染色體可能是通過使其中一個著絲粒失去活性或者喪失大部分活性來進行正常的有絲分裂。

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Identification of chromosome loss and rearrangement in potato and eggplant somatic hybrids by rDNA and telomere repeats

WANG Hai-Bo1,2, YING Jing-Wen1, HE Li1,3, YE Wen-Xuan1, TU Wei1, CAI Xing-Kui1, SONG Bo-Tao1,*, and LIU Jun1

1Key Laboratory of Potato Biology and Biotechnology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education / Potato Engineering and Technology Research Center of Hubei Province / Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China;2College of Biological Science and Technology, Hubei Minzu University, Enshi 445000, Hubei, China;3Horticulture Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, Sichuan, China

Somatic hybridization is an important way to create new germplasm.Somatic hybrids produced plenty of genetic variation during protoplast regeneration.In this study, to analyze the chromosome composition and variation of potato and eggplant somatic hybrids, rDNAs and telomeric repeats were used as probes for FISH (fluorescence in situ hybridization), combined with GISH (Genomic in situ hybridization).The results showed that rearranged chromosomes and dicentric chromosomes existed in somatic hybrids, and the parts of the rearranged chromosomes was derived from the end-to-end fusion of potato and eggplant chromosomes 2.One centromere of the rearranged dicentric chromosomes was derived from potato and the other was from eggplant.Eggplant 5S rDNA sites were lost in somatic hybrids to homogenize the rDNA of somatic hybrids.The results of this study indicated that the chromosomes were unstable during the somatic hybridization of potato and eggplant, which can easily cause dicentric and chromosomal rearrangements in somatic hybrids.The chromosomes of somatic hybrids tended to be stable through various ways such as chromosome rearrangement, dicentric and rDNA homogenization.

potato; eggplant; somatic hybrids; rDNA; chromosome rearrangement

本研究由國家現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項(馬鈴薯, CARS09-P07)資助。

This study was supported by the China Agriculture Research System (Potato, CARS-09-P07).

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20211015.1509.006.html

通信作者(Corresponding author): 宋波濤, E-mail: songbotao@mail.hzau.edu.cn

E-mail: wanghaibo0519@126.com

2021-09-10;

2021-10-18.

10.3724/SP.J.1006.2022.14070

2021-04-20;