OsSAMS1在水稻稻瘟病抗性中的功能研究

楊德衛(wèi) 王 勛,** 鄭星星 項(xiàng)信權(quán) 崔海濤 李生平,* 唐定中,*

在水稻稻瘟病抗性中的功能研究

楊德衛(wèi)1,2,**王 勛1,**鄭星星1項(xiàng)信權(quán)1崔海濤1李生平1,*唐定中1,*

1福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 福建省作物設(shè)計(jì)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 福建農(nóng)林大學(xué)植物免疫研究中心, 福建福州 350002;2福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所; 福建福州 350018

稻瘟病是水稻最重要的病害之一, 對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。研究表明, 水稻中S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶OsSAMS1參與了水稻衰老相關(guān)的進(jìn)程, 我們實(shí)驗(yàn)室前期利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),基因的表達(dá)水平受稻瘟病菌誘導(dǎo)后明顯提高。然而,是否參與水稻的免疫反應(yīng), 尚未明確?；诖? 本研究選取野生型ZH11為背景材料, 通過構(gòu)建基因敲除突變體來探究該基因在水稻抗病中的功能。結(jié)果表明,主要在水稻葉片中表達(dá); 且其表達(dá)明顯受稻瘟病菌侵染所誘導(dǎo)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示, OsSAMS1在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá)。通過接種稻瘟病菌發(fā)現(xiàn), 與對(duì)照相比, 2個(gè)等位敲除突變體和均表現(xiàn)為更加感病, 且體內(nèi)病程相關(guān)基因的表達(dá)也明顯更低, 同時(shí)突變體中乙烯合成相關(guān)基因的表達(dá)也受到明顯抑制。綜上所述,參與了水稻的免疫反應(yīng), 且正調(diào)控水稻稻瘟病的抗性。本研究為深入揭示在稻瘟病免疫反應(yīng)的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ), 并為稻瘟病抗病育種研究提供了基因資源。

水稻; 稻瘟病;基因; 乙烯; 功能研究

水稻是世界上主要的糧食作物之一, 由稻瘟病菌引起的稻瘟病是一種世界性病害[1], 近年來呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)。稻瘟病不僅引起水稻大幅減產(chǎn)10%～35%[2], 嚴(yán)重時(shí)甚至顆粒無收[3]。為了減少稻瘟病對(duì)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)造成的危害, 研究者利用不同的方法, 已從水稻中克隆了、、、、、和等近30個(gè)稻瘟病抗性(,)基因[4-9], 這些基因在水稻抗稻瘟病育種中發(fā)揮了極其重要的作用。這些基因常編碼NLR (Nucleotide-binding domain and Leucine-rich Repeat)蛋白, 其介導(dǎo)的免疫防御體系, 被稱為病原菌效應(yīng)因子引發(fā)的ETI (effector-triggered immunity)反應(yīng)[10-11]。在植物中, 除了由ETI反應(yīng)引起的防御體系外, 還存在另外一層防御體系, 即PTI (PAMP- triggered immunity) 反應(yīng), 是由細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體(PRRs, pattern recognition receptors)識(shí)別病原菌保守成分PAMPs/MAMPs (pathogen-associated molecular patterns or microbe-associated molecular patterns), 從而觸發(fā)的植物免疫反應(yīng)[11-12]。植物中的抗病反應(yīng)過程十分復(fù)雜, 相較于ETI, PTI反應(yīng)具有更好的廣譜性和持久性[13]。最近研究發(fā)現(xiàn), PTI和ETI反應(yīng)可以相互促進(jìn), 植物免疫反應(yīng)的全面激活需要PTI和ETI反應(yīng)的協(xié)同作用[14-15]。

在水稻中, 研究者利用不同的方法, 已鑒定了70多個(gè)稻瘟病抗性相關(guān)的調(diào)控因子[16], 通過深入研究這些基因的功能, 初步形成了免疫反應(yīng)的信號(hào)通路。例如, 水稻免疫受體OsCEBiP能特異識(shí)別并結(jié)合質(zhì)外體中的PAMP組分幾丁質(zhì), 并發(fā)生同源二聚化, 隨后招募共受體OsCERK1 (CHITIN ELICITOR RECEPTOR KINASE1)形成異源三聚體[17]。當(dāng)OsCERK1被激活后, 能直接磷酸化細(xì)胞質(zhì)類受體激酶OsRLCK185, 隨后通過連續(xù)激活由OsMAPKKKε/ OsMAPKKK18、OsMKK4/5和OsMAPK3/6組成的級(jí)聯(lián)反應(yīng), 最終將抗病信號(hào)傳遞至下游, 引發(fā)水稻的PTI防御反應(yīng)[18-20]。由于稻瘟病菌在致病性方面的多變性, 使得傳統(tǒng)的育種方法和化學(xué)防治都很難控制這種病害[21]。而近年來, RNA-seq技術(shù)已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用, 為研究植物與病原菌之間的相互作用提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具[22]。研究者利用微陣列、RNA-seq的方法, 鑒定獲得更多的稻瘟病抗性相關(guān)基因, 并深入研究其功能, 這些將為深入揭示水稻抗病反應(yīng)的分子遺傳機(jī)理以及水稻稻瘟病抗病新品種的選育奠定基礎(chǔ)。

S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶(SAMS), 也被稱為蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(MAT), 研究表明SAMS參與調(diào)控植物DNA和組蛋白甲基化修飾, 進(jìn)而調(diào)控植物的發(fā)育與衰老等[23-24]。如水稻F-Box蛋白OsFBK12通過靶向降解OsSAMS1參與水稻衰老相關(guān)的進(jìn)程[25]。我們實(shí)驗(yàn)室前期利用稻瘟病菌Guy11誘導(dǎo)感病品種日本晴后, 通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),基因被誘導(dǎo)后表達(dá)顯著提高。但基因是否參與水稻的免疫反應(yīng), 尚未明確。鑒于此, 本研究選取野生型ZH11為背景材料, 通過構(gòu)建基因敲除突變體來探究該基因在水稻抗病中的功能, 為深入揭示參與免疫反應(yīng)的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ), 并為稻瘟病抗病育種研究提供優(yōu)異的基因資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

野生型中花11 (Zhonghua 11, ZH11)為福建農(nóng)林大學(xué)植物免疫中心保存, 突變體和是本實(shí)驗(yàn)室利用基因編輯技術(shù)在野生型ZH11背景下敲除而獲得的2個(gè)等位純合突變體。

1.2 室內(nèi)噴霧接菌

室內(nèi)稻瘟病抗性鑒定, 參照Yang等[4]方法接菌, 并進(jìn)行適當(dāng)修改。將帶有Guy11孢子的濾紙片放置到完全培養(yǎng)基上, 于28℃黑暗培養(yǎng)1周后, 轉(zhuǎn)接到米糠培養(yǎng)基上, 再培養(yǎng)至菌絲長滿米糠培養(yǎng)基, 刮去菌絲, 于28℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行產(chǎn)孢。5～7 d后用含0.2% Tween 20的水將孢子進(jìn)行懸浮并調(diào)整濃度至1×105個(gè) mL–1, 均勻地噴霧到生長15 d左右的水稻葉片表面, 將噴菌后的幼苗放置在26℃黑暗培養(yǎng)24 h, 然后放置于長日照接菌室, 并保持環(huán)境高濕, 3～5 d后, 統(tǒng)計(jì)發(fā)病表型。

1.3 基因表達(dá)分析

水稻總RNA提取按照提取試劑盒(TRIzol, Invitrogen, USA)說明書的要求與步驟進(jìn)行, 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)合成總cDNA。所有的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)均使用染料法實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司), 并用CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad)進(jìn)行檢測(cè)與分析。qRT-PCR分析按照Bustin等[26]描述的步驟進(jìn)行, 設(shè)置3個(gè)獨(dú)立的生物重復(fù); 接菌后水稻葉片真菌生物量的變化, 參考Park等[27]方法進(jìn)行分析。植物病程相關(guān)基因(,)為、和, 植物乙烯生物合成相關(guān)基因?yàn)?、、? 引物序列見表1。

表1 研究OsSAMS1所用引物信息

1.4 OsSAMS1的亞細(xì)胞定位

擴(kuò)增OsSAMS1基因的cDNA全長序列, 用無縫克隆(infusion)技術(shù), 將OsSAMS1全長cDNA序列插入到pCMABIA2300-35S-eGFP載體的R I和LI兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間, 完成35S-OsSAMS1-eGFP載體的構(gòu)建。然后將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株GV3101中, 并注射到煙草葉片中。注射3 d后, 用Zeiss 880共聚焦顯微鏡觀察并拍攝GFP信號(hào)。

1.5 農(nóng)藝性狀調(diào)查分析

于2019年10月, 供試材料種植于福建農(nóng)林大學(xué)大型人工氣候室。敲除純合突變體ossams1-1、ossams1-2和野生型ZH11分別種植1個(gè)小區(qū), 每個(gè)小區(qū)種植3行, 每行種20株, 每個(gè)小區(qū)設(shè)置3個(gè)重復(fù), 常規(guī)管理。水稻株高、穗長和分蘗數(shù)等主要農(nóng)藝性狀, 參考Yang等[28]方法進(jìn)行調(diào)查和分析。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以O(shè)sSAMS1 (基因號(hào)為)的蛋白序列為參考序列, 利用BLAST分析在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、RGAP (http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)和TAIR (http://www.arabidopsis.org/)蛋白數(shù)據(jù)庫中對(duì)OsSAMS1進(jìn)行同源蛋白搜索, 獲得水稻中2個(gè)同源蛋白LOC_ 01g18860和LOC_01g22010、擬南芥中2個(gè)同源蛋白AtSAM1和AtSAM2、以及玉米、高粱、黍稷和粟中的SAMS1蛋白, 然后利用MEGA7.0軟件進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病菌誘導(dǎo)后OsSAMS1的表達(dá)分析

我們實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)日本晴在0、12、24和36 h不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行稻瘟病菌Guy11誘導(dǎo)處理, 并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析, 結(jié)果表明, OsSAMS1被稻瘟病菌侵染后表達(dá)量顯著提高(圖1-A)。為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性, 我們利用稻瘟病菌Guy11對(duì)生長2周左右的水稻品種ZH11進(jìn)行噴霧接菌, 并以水處理作為對(duì)照。在接菌后的0、12、24、48和72 h分別進(jìn)行取樣, 定量測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)水稻OsSAMS1基因的表達(dá)量。結(jié)果表明, 相比于水處理對(duì)照, 在接菌后12 h, 水稻OsSAMS1的表達(dá)量明顯上調(diào); 在接菌后24 h, OsSAMS1表達(dá)量達(dá)到最高, 且差異更顯著; 在接菌48 h后, 雖然OsSAMS1的表達(dá)量開始下降, 但是仍然比對(duì)照高(圖1-B)。上述結(jié)果表明OsSAMS1很可能參了水稻的免疫反應(yīng)。

2.2 OsSAMS1的時(shí)空表達(dá)模式分析

為了確定在水稻不同組織中的時(shí)空表達(dá)模式, 在野生型ZH11中, 取不同發(fā)育階段的組織樣品, 利用qRT-PCR技術(shù)分析基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)水平(檢測(cè)引物見表1)。結(jié)果表明, 在生長2周、4周和6周等水稻愈傷組織, 以及水稻抽穗期、成熟期的不同組織中均有表達(dá), 但是在各個(gè)時(shí)期的葉片中表達(dá)量最高(圖2)。

圖1 稻瘟病菌Guy11侵染后OsSAMS1的表達(dá)變化

A: 對(duì)稻瘟病菌侵染前和侵染后12、24和36 h后的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析, 發(fā)現(xiàn)明顯受稻瘟病菌侵染而誘導(dǎo)表達(dá); B: 對(duì)稻瘟病菌侵染前和侵染后12、24、48和72 h后的樣品進(jìn)行qRT-PCR分析, 發(fā)現(xiàn)與水處理對(duì)照相比, 稻瘟病菌侵染后的表達(dá)水平明顯升高, 侵染24 h后達(dá)到最高。

A:transcriptome sequencing analysis of rice samples before and 12, 24, and 36 hours afterinfection showed that the relative expression level ofwas induced byinfection; B: qRT-PCR analysis of the rice samples before and 12, 24, 48, and 72 hours afterinfection showed that the relative expression level ofwas increased and reached the highest level at 24 hours after infection compared to the control.

圖2 OsSAMS1的時(shí)空表達(dá)模式

利用qRT-PCR對(duì)生長2周、4周和6周水稻的根、莖、葉, 0.5～1.0 cm、1～3 cm、3～5 cm和5～10 cm的小穗, 萌發(fā)和成熟的種子及愈傷組織中的表達(dá)水平進(jìn)行分析。誤差線表示從3個(gè)獨(dú)立的樣本獲得數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

The relative expression levels ofin roots, stems, and leaves of two-week old, four-week old and six-week old seedlings, spikelets of 0.5–1.0 cm, 1–3 cm, 3–5 cm, and 5–10 cm length, germinating and mature seeds and callus were analyzed by qRT-PCR.The error bar represents the standard deviation (SD) of the value from three independent biological samples.

2.3 ossams1突變體的獲得與農(nóng)藝性狀分析

2.3.1突變體的基因型鑒定 在前期研究發(fā)現(xiàn),基因在受到稻瘟病菌侵染后表達(dá)水平上調(diào)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證在水稻抗病中的功能, 本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻ZH11中的基因進(jìn)行了雙靶點(diǎn)敲除。在基因中選擇了2個(gè)不同的20 nt序列作為Cas9切割的靶位點(diǎn), 獲得敲除株系后, 利用檢測(cè)引物對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序分析(表1和圖3)。結(jié)果表明, 敲除系靶標(biāo)位點(diǎn)有4個(gè)堿基的缺失, 敲除系靶標(biāo)位點(diǎn)有1個(gè)堿基的插入(圖3)。

2.3.2突變體和野生型農(nóng)藝性狀分析

為了明確功能缺失后對(duì)水稻生長發(fā)育造成的影響, 我們通過對(duì)灌漿期2個(gè)等位突變體和及野生型ZH11進(jìn)行拍照觀察(圖4), 并對(duì)成熟期的、和野生型ZH11農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查, 結(jié)果表明ossams1-1和與ZH11相比, 在結(jié)實(shí)率、粒長、粒寬和千粒重等性狀沒有明顯差異, 而在株高、穗長、有效穗和每穗穎花數(shù)等性狀具有明顯差異(表2)。

表2 野生型與2個(gè)敲除系在株高、穗長和千粒重等主要農(nóng)藝性狀比較

*:<0.05;**:<0.01.

圖3(A)和(B)敲除突變體的鑒定

Fig.3 Determination of(A)and(B) knockout transgenic lines

圖4 ZH11、ossams1-1和ossams1-2的生長發(fā)育表型

對(duì)正常生長灌漿期的水稻進(jìn)行表型觀察, 標(biāo)尺為10 cm。

The phenotypes of ZH11,,andat filling stage were observed; bar: 10 cm.

2.4 OsSAMS1在水稻免疫反應(yīng)中的功能分析

2.4.1對(duì)稻瘟病菌表現(xiàn)為更加感病 利用稻瘟病菌菌株Guy11對(duì)2個(gè)等位突變體(ossams1-1和ossams1-2)和野生型ZH11進(jìn)行噴霧接菌, 3 d后調(diào)查發(fā)病情況。結(jié)果表明, ossams1突變體比野生型ZH11更加感病(圖5-A)。為了進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果, 我們?cè)俅螌?duì)ossams1突變體和ZH11進(jìn)行噴霧接菌, 在接菌3 d后, 檢測(cè)接菌后葉片上的真菌生物量, 將均勻感染的葉片等量混合后, 提取總DNA, 并進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果表明, ossams1突變體葉片表面的真菌生物量均明顯高于野生型ZH11 (圖5-B)。綜上表明, OsSAMS1正調(diào)控水稻的抗病反應(yīng)。

2.4.2 稻瘟病菌侵染后中病程相關(guān)基因的表達(dá)分析 一般情況下, 植物病程相關(guān)基因的表達(dá)在植物受到病原菌侵染后經(jīng)常被激活。為了進(jìn)一步分析基因能否通過激活細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)來調(diào)控稻瘟病抗性, 我們對(duì)、和野生型ZH11進(jìn)行接種稻瘟病菌Guy11, 利用qRT-PCR對(duì)接菌0、24、48和72 h樣品中的、和等基因的表達(dá)模式變化進(jìn)行分析。結(jié)果表明, 在接種Guy11后, 野生型ZH11和突變體均能激活、和基因的表達(dá), 但ossams1突變體在接菌48 h時(shí),、和基因的表達(dá)水平明顯低于野生型ZH11, 而在72 h時(shí), 差異水平達(dá)到了極顯著水平(圖6)。上述結(jié)果進(jìn)一步證明,參與了水稻抗病反應(yīng), 并且正調(diào)控水稻稻瘟病抗性。

圖5 ossams1-1和ossams1-2與對(duì)照ZH11相比更感稻瘟病菌

A: 噴霧接種Guy11后,和植株比ZH11植株產(chǎn)生更多的病斑; B: 發(fā)病葉片中的真菌生物量分析, 星號(hào)代表顯著差異(*:< 0.05, **:< 0.01, 采用檢驗(yàn))。

A: the plants ofandproduced more diseased lesions compared to the ZH11 plants after inoculation with Guy11 using the spraying method; B: the analysis of the fungal biomass in the diseased leaves.*:< 0.05, **:< 0.01, Student’s-test.

圖6 ossams1-1、ossams1-2和ZH11中病程相關(guān)基因的表達(dá)分析

圖中A、B、C、D分別表示利用qRT-PCR檢測(cè)接種稻瘟病菌Guy11后,、和ZH11中病程基因、和轉(zhuǎn)錄本的積累情況(*:< 0.05; **:< 0.01).

A, B, C and D represent the expression changes of,,, andin,and ZH11after inoculation with Guy11.Asterisks represent significant differences relative to wild-type ZH11 plants (*:< 0.05, **:< 0.01, Student’s-test).

2.5 接菌后ossams1突變體中乙烯合成相關(guān)基因表達(dá)分析

研究表明與乙烯的生物合成途徑密切相關(guān)[25]。而乙烯是植物免疫信號(hào)傳遞鏈中非常重要的一類防御激素[29-30]。那么,是否通過乙烯相關(guān)途徑參與植物的免疫反應(yīng)呢？基于此, 我們分析了突變體和野生型ZH11在接菌前后ACC合成酶(ACC synthase, ACS)基因的表達(dá)情況。ACS是植物乙烯生物合成途徑中重要的限速酶, 水稻ACS基因?qū)儆诙嗷蛐徒M成的家族[25]。結(jié)果表明, 與未處理對(duì)照相比, 突變體和野生型ZH11中乙烯合成相關(guān)基因、、和的表達(dá)水平, 在接菌后均受到誘導(dǎo)表達(dá), 在48 h時(shí)達(dá)到最高, 之后呈現(xiàn)降低趨勢(shì)(圖7)。然而, 它們?cè)谕蛔凅w中的表達(dá)水平均顯著低于在野生型ZH11中的表達(dá)水平。這些結(jié)果表明,可能通過調(diào)控乙烯合成相關(guān)基因如等的表達(dá), 從而影響水稻的稻瘟病抗性(圖5)。

2.6 OsSAMS1的亞細(xì)胞定位

OsSAMS1能夠正調(diào)控水稻稻瘟病抗性, 但它如何發(fā)揮抗病功能呢？我們通過構(gòu)建35S∶OsSAMS1∶eGFP載體, 并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101,注射煙草2 d后, 利用激光共聚焦顯微鏡技術(shù), 在煙草葉片中觀察OsSAMS1的細(xì)胞定位情況。結(jié)果表明, OsSAMS1在細(xì)胞內(nèi)的定位不特異, 在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)都有表達(dá)(圖8), 與擬南芥OsSMAS1的同源蛋白AtSAM1和AtSAM2定位結(jié)果相似[31], 這與SAMS類蛋白能夠通過與不同的蛋白在不同的細(xì)胞場(chǎng)所發(fā)生相互作用, 從而發(fā)揮不同的生物功能相一致[25,31-32]。

圖7 接菌前后ossams1突變體與野生型ZH11中乙烯合成相關(guān)基因的表達(dá)分析

Fig 7 Relative expression patterns of ethylene synthesis related genes inmutants and the wild-type ZH11 after inoculation with

圖中A、B、C、D分別代表、、和在稻瘟病菌誘導(dǎo)前后突變體與野生型ZH11中的表達(dá)變化情況(*:< 0.05, **:< 0.01, 采用檢驗(yàn))。

A, B, C, and D represent the expression changes of,,and, inmutants and the wild-type ZH11 after inoculation withrespectively(*:< 0.05, **:< 0.01, Student’s-test).

圖8 OsSAMS1的亞細(xì)胞定位

利用激光共聚焦顯微鏡觀察OsSAMS1-GFP在煙草細(xì)胞中的表達(dá)部位, 表明OsSAMS1-GFP在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜內(nèi)均有表達(dá), 標(biāo)尺為20 μm。

The expression of OsSAMS1-GFP incells was observed by laser confocal microscopy.The results showed that OsSAMS1-GFP expressed in the nucleus, cytoplasm and cell membrane; bar: 20 μm.

2.7 OsSAMS1在植物中的同源進(jìn)化分析

為了對(duì)OsSAMS1在不同植物中的同源性進(jìn)行分析, 我們以水稻OsSAMS1的氨基酸序列為參考序列, 通過BLAST在水稻基因組中獲得和基因編碼的2個(gè)同源蛋白, 在擬南芥中獲得2個(gè)同源蛋白AtSAM1和AtSAM2, 在玉米中獲得一個(gè)同源蛋白ZmSAMS1, 在高粱中獲得一個(gè)同源蛋白SbSAMS1, 在黍稷中獲得一個(gè)同源蛋白PmSAMS1, 在粟中獲得一個(gè)同源蛋白SiSAMS1 (圖9), 系統(tǒng)發(fā)育分析表明, OsSAMS1及其同源蛋白在上述高等植物中是非常保守的。

圖9 OsSAMS1在植物中的進(jìn)化樹分析

Fig.9 Phylogenetic analysis of OsSAMS1 in plants

利用BLAST分析在NCBI、RGAP和TAIR蛋白數(shù)據(jù)庫中對(duì)OsSAMS1進(jìn)行同源蛋白搜索, 獲得獲得和基因編碼的2個(gè)同源蛋白, 擬南芥中2個(gè)同源蛋白AtSAM1和AtSAM2, 以及玉米、高粱、黍稷和粟中的SAMS1蛋白, 然后利用MEGA7.0軟件進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

Blast analysis was used to search for the homologous proteins of OsSAMS1 in NCBI, RGAP, and TAIR protein database, and two homologous proteins encoded byandin rice, two homologous proteins AtSAM1 and AtSAM2 in, and the SAMS1 protein in maize, sorghum, panicum, and setaria were obtained.Then phylogenetic analysis was performed with MEGA7.0 software.

3 討論

3.1 OsSAMS1正調(diào)控稻瘟病抗性

Mao等[31]發(fā)現(xiàn), 水稻OsSAMS1通過參與水稻DNA和組蛋白甲基化改變來調(diào)控水稻種子的萌發(fā), 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)F-box蛋白OsFBK12通過與OSK1互作參與了26S蛋白酶途徑, 并識(shí)別底物OsSAMS1促其降解[25]。本研究利用qRT-PCR技術(shù), 進(jìn)一步確定了被稻瘟病菌誘導(dǎo)后表達(dá)顯著提高(圖1-B);并對(duì)敲除突變體、的稻瘟病抗性進(jìn)行鑒定和分析, 結(jié)果表明,敲除突變體比野生型更加感病(圖5); 同時(shí), 對(duì)突變體和接菌后PR基因的表達(dá)進(jìn)行分析, 結(jié)果表明,、和表達(dá)水平明顯低于野生型ZH11 (圖6)。上述結(jié)果表明, OsSAMS1除了參與水稻種子的萌發(fā), 還參與了水稻的免疫反應(yīng), 并且正調(diào)控水稻稻瘟病抗性。

3.2 OsSAMS1基因與乙烯表達(dá)的相關(guān)

研究者前期利用RNA干擾技術(shù), 對(duì)水稻基因進(jìn)行干擾, 結(jié)果表明,-RNAi株系中乙烯的表達(dá)顯著降低[25]。我們分析發(fā)現(xiàn),在水稻中還存在和兩個(gè)同源基因(圖9), 同時(shí)由于RNA干擾技術(shù)的局限性,與這2個(gè)同源是否存在功能冗余還不能確定。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行特異性敲除, 結(jié)果表明, 接菌后敲除系中與乙烯合成相關(guān)基因、、和的表達(dá)明顯被抑制, 表達(dá)量均顯著降低(圖7), 進(jìn)一步確定了OsSAMS1正向參與水稻中乙烯的表達(dá)。進(jìn)化樹分析表明OsSAMS1在擬南芥中有2個(gè)同源蛋白, 分別是AtSAM1 (SAM1)和AtSAM2 (SAM2) (圖9)。Li等[33]發(fā)現(xiàn), 擬南芥受體激酶FER能夠與SAM1和SAM2互作, 從而減少SAM合成, 降低了植物中乙烯的表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)說明,基因家族廣泛參與了植物乙烯表達(dá)的調(diào)控。

3.3 OsSAMS1基因參與水稻稻瘟病抗性的初步探討

本研究表明, 在稻瘟病菌誘導(dǎo)條件下,敲除系中乙烯合成相關(guān)基因的表達(dá)受到明顯抑制, 同時(shí)敲除系的稻瘟病抗性明顯降低。近年來, 研究發(fā)現(xiàn)乙烯參與植物的抗病反應(yīng), 植物在感知到病原菌PAMP因子之后, 體內(nèi)能快速合成乙烯[34], 同時(shí)乙烯還能與內(nèi)源多肽聯(lián)合起作用, 將植物PTI反應(yīng)信號(hào)放大, 引起植物持久的抗性[35]。在水稻中, 乙烯同樣被證明在抗病方面發(fā)揮著十分重要的作用[29,36-38], 如將編碼乙烯合成的關(guān)鍵酶基因過表達(dá)后, 水稻稻瘟病抗性明顯增強(qiáng)[36], 水稻中乙烯含量的增加能提高稻瘟病抗性[37], 將乙烯合成基因的中心傳遞者沉默后, 稻瘟病抗性明顯降低[38]。以上結(jié)果表明, 乙烯在調(diào)控植物抗病尤其在調(diào)控水稻稻瘟病抗性方面具有非常重要的作用。因此, 我們推測(cè)本研究中突變體稻瘟病抗性的減弱, 可能與功能喪失, 并導(dǎo)致植株體內(nèi)乙烯合成相關(guān)基因的表達(dá)降低有關(guān)。

3.4 SAMS參與植物多種生物學(xué)功能的調(diào)控

在番茄中過量表達(dá) SlSAMS1 可以增加堿脅迫的耐受性[39]。在擬南芥中, 存在4個(gè)成員蛋白MAT1 (SAM1) ～ MAT4 (SAM4), 其中SAM1和SAM2可以與FER發(fā)生相互作用, 進(jìn)而抑制S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)生和乙烯的生物合成, 過量表達(dá)SAM1表現(xiàn)出與突變體類似的表型, 如植株矮小和葉片早衰等,雙突變體則與突變體表型相反, 乙烯含量降低[40]。而MAT3在花粉管的生長中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[41],此外,突變體則表現(xiàn)出木質(zhì)素積累的減少[42]。水稻的功能也相繼被報(bào)道,基因沉默轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出矮化, 開花延遲和育性降低的表型[43]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), OsSAMS1通過與OsFBK12互作, 并作為OsFBK12 的降解底物, 共同參與水稻種子萌發(fā)與葉片衰老的調(diào)控[25]。本研究發(fā)現(xiàn),還參與了水稻免疫反應(yīng)的調(diào)控(圖5和圖6), 正調(diào)控水稻的稻瘟病抗性。表明SAMS基因廣泛參與植物多種生物學(xué)功能的調(diào)控, 如生長發(fā)育, 生物和非生物脅迫反應(yīng)等, 但是否還參與其他生物學(xué)功能的調(diào)控還有待進(jìn)一步發(fā)掘和驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究鑒定的S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶編碼基因主要在水稻葉片中表達(dá), 稻瘟病菌Guy11侵染誘導(dǎo)后,的表達(dá)顯著提高。OsSAMS1蛋白在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布。敲除突變體和接菌后表現(xiàn)為更加感病,基因和乙烯合成相關(guān)基因的表達(dá)受到明顯抑制,這些結(jié)果表明參與了水稻稻瘟病抗性的免疫反應(yīng), 正調(diào)控水稻稻瘟病的抗性。

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Functional studies of rice blast resistance related gene

YANG De-Wei1,2,**, WANG Xun1,*, ZHENG Xing-Xing1, XIANG Xin-Quan1, CUI Hai-Tao1, LI Sheng-Ping1,*, and TANG Ding-Zhong1,*

1College of Agriculture, Fujian Provincial Key Laboratory of Crop Breeding by Design, Plant Immunity Center, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China;2Institute of Rice, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350018, Fujian, China

Rice blast is one of the most devastating diseases in rice, which causes great economic losses to agricultural production.It has been reported that1 () is involved in the process of senescence in rice.Transcriptome sequencing analysis showed that the relative expression level ofwas significantly increased after inoculation with().However, it remains unclear whetheris involved in rice immunity.To verify this, we constructed the knock-out mutants ofin the wild type variety ZH11.The results showed thatwas mainly expressed in rice leaves, and its expression was significantly induced byinoculation.Subcellular localization revealed that OsSAMS1 was distributed in the plasma membrane, cytoplasm, and nucleus.Compared to the wild type, the two knockout mutants,and, displayed enhanced susceptibility uponinfection, and the expression of pathogenesis-related () genes was significantly inhibited.In addition, ethylene synthesis-related genes were also dramatically decreased in both two mutants.These results suggested thatwas involved in rice immune response and positively regulated rice blast resistance, which lays a foundation for further revealing the molecular mechanism ofin plant immunity and provides genetic resources for rice breeding of blast resistance.

rice; rice blast disease;; ethylene; function research

2021-04-02;

2021-09-09;

2021-10-18.

10.3724/SP.J.1006.2022.12022

通信作者(Corresponding authors): 李生平, E-mail: lishun1981@126.com;唐定中, E-mail: dztang@fafu.edu.cn

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

楊德衛(wèi), E-mail: dewei-y@163.com;王勛, E-mail: 1448293617@qq.com;

本研究由福建省屬公益類項(xiàng)目(2020R11010016-3), 福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2019J01424)和福建省科技重大專項(xiàng)專題(2020NZ08016)資助。

This study was supported by the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest of Fujian Province (2020R11010016-3), the Natural Science Foundation of Fujian Province (2019J01424), and the Major Science and Technology Projects of Fujian Province (2020NZ08016).

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20211015.1735.008.html