類葉升麻苷調(diào)控Rnd3/NF-κB通路對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響

楊洋 李天發(fā) 王軍 黃珊 凌學(xué)斌

中圖分類號 R965.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）05-0542-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.05.06

摘 要 目的 探討類葉升麻苷調(diào)控Rho家族GTP酶3（Rnd3）/核因子κB（NF-κB）通路對缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響。方法 本實驗將H9c2心肌細(xì)胞分為對照組（不給藥、不造模）、H/R組（僅造模）、H/R+AS-L組、H/R+AS-M組、H/R+AS-H組（以上3組先分別給予10、30、90 μmol/L類葉升麻苷，再造模）、H/R+pcDNA組[先轉(zhuǎn)染pcDNA（空載體），再造模]、H/R+pcDNA-Rnd3組[先轉(zhuǎn)染pcDNA-Rnd3（Rnd3過表達(dá)載體）使Rnd3過表達(dá)，再造模]、H/R+AS-H+si-NC組[先轉(zhuǎn)染si-NC（陰性對照），然后給予90? μmol/L類葉升麻苷，再造模]、H/R+AS-H+si-Rnd3組[先轉(zhuǎn)染si-Rnd3（Rnd3小分子干擾RNA）抑制Rnd3過表達(dá)，然后給予90 μmol/L類葉升麻苷，再造模]。各組經(jīng)相應(yīng)處理后，檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中乳酸脫氫酶（LDH）釋放量、丙二醛（MDA）水平、超氧化物歧化酶（SOD）活性、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）水平、IL-6水平、Rnd3和NF-κB亞基p65（NF-κB p65） mRNA及蛋白的表達(dá)、活化胱天蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果 給予不同濃度類葉升麻苷均可降低H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡率、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平、NF-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá)水平、LDH釋放量和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平，升高SOD活性和Rnd3 mRNA及蛋白表達(dá)水平（P<0.05），且呈劑量依賴性。Rnd3過表達(dá)可使H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡率，NF-κB p65、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平，LDH釋放量和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，使Rnd3蛋白表達(dá)水平和SOD活性升高（P<0.05）;而抑制Rnd3過表達(dá)，可減弱類葉升麻苷對H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的抑制作用（P<0.05）。結(jié)論 類葉升麻苷可通過促進(jìn)Rnd3表達(dá)、抑制NF-κB p65表達(dá)來調(diào)控Rnd3/NF-κB通路，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，從而減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

關(guān)鍵詞 類葉升麻苷;Rnd3/NF-κB通路;缺氧/復(fù)氧;H9c2心肌細(xì)胞;細(xì)胞凋亡;氧化應(yīng)激;炎癥反應(yīng)

Effects of acteoside on hypoxia/reoxygenation-induced cardiomyocyte damage by regulating the Rnd3/NF-κB pathway

YANG Yang，LI Tianfa，WANG Jun，HUANG Shan，LING Xuebin（Dept. of Cardiovascular Medicine， the First Affiliated Hospital of Hainan Medical College， Haikou 570102， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To explore the effects of acteoside on hypoxia/reoxygenation （H/R）-induced cardiomyocyte damage by regulating Rho family GTPase 3 （Rnd3）/nuclear factor κB （NF-κB） pathway. METHODS The H9c2 cardiomyocyte were divided into control group （no administration， no modeling）， H/R group （only modeling）， H/R+AS-L group， H/R+AS-M group， H/R+AS-H group （10， 30， 90 μmol/L acteoside for above 3 groups firstly， and then modeling）， H/R+pcDNA group [transfecting pcDNA （empty vector） firstly， and then modeling]， H/R+pcDNA-Rnd3 group [overexpression of Rnd3 by transfecting pcDNA-Rnd3 （Rnd3 overexpression vector） firstly， and then modeling]， H/R+AS-H+si-NC group [transfecting si-NC （negative control） firstly， and then giving 90 μmol/L acteoside and modeling]， H/R+AS-H+si-Rnd3 group [inhibiting overexpression of Rnd3 by transfecting si-Rnd3 （Rnd3 small interfering RNA） firstly， and then giving 90 μmol/L acteoside and modeling]. After corresponding treatment， the apoptotic rate， release of lactate dehydrogenase （LDH） ， malondialdehyde （MDA） level， the activity of superoxide dismutase （SOD）， the level of tumor necrosis factor α （TNF-α）， interleukin 1β （IL-1β） and interleukin-6 （IL-6）， mRNA and protein expression of Rnd3 and NF-κB subunit p65 （NF-κB p65）， the expression of aspartate proteolytic enzyme 3 （Cleaved Caspase-3） protein and Cleaved Caspase-9 protein were detected. RESULTS Different concentrations of acteoside could reduce the apoptotic rate of H/R-induced H9c2 cardiomyocyte， the protein expressions of Cleaved Caspase-3 and Cleaved Caspase-9， mRNA and protein expressions of NF-κB p65， the levels of LDH release and MDA， TNF-α， IL-1β and IL-6， while increase the activity of SOD and mRNA and protein expressions of Rnd3 （P<0.05）， in a dose-dependent manner. Overexpression of Rnd3 could decrease the apoptotic rate of H9c2 cardiomyocyte， protein expressions of NF-κB p65， Cleaved Caspase-3 and Cleaved Caspase-9， the levels of LDH release， MDA， TNF-α， IL-1β and IL-6， while increase the protein expression of Rnd3 and the activity of SOD （P<0.05）. The inhibition overexpression of Rnd3 could weaken the inhibitory effects of acteoside on H/R-induced apoptosis of H9c2 cardiomyocyte， oxidative stress and inflammatory reaction （P<0.05）. CONCLUSIONS Acteoside could regulate Rnd3/NF-κB pathway by promoting the expression of Rnd3 and inhibiting the expression of NF-κB p65， inhibit cardiomyocyte apoptosis， oxidative stress and inflammation reaction so as to relieve the H/R-induced cardiomyocyte damage.

KEYWORDS? ?acteoside; Rnd3/NF-κB pathway; hypoxia/reoxygenation; H9c2 cardiomyocyte; cell apoptosis; oxidative stress; inflammatory reaction

急性心肌梗死是一種臨床常見的心臟疾病，恢復(fù)冠狀動脈血流是其主要治療措施，但當(dāng)心肌組織恢復(fù)血流時，心肌組織損傷可能會加重從而引起心肌缺血再灌注損傷[1]。缺氧可引起心肌細(xì)胞凋亡從而加重心肌組織損傷[2]。研究表明，中藥及其活性成分具有抗炎、抗氧化等作用，并可用于減輕心肌缺血再灌注損傷[3-4]。類葉升麻苷（acteoside）是肉蓯蓉的主要活性成分，基礎(chǔ)研究表明其對小鼠具有神經(jīng)保護(hù)、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、改善學(xué)習(xí)記憶等作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，Rho家族GTP酶3（Rho family GTPase 3，Rnd3）在肝臟缺血再灌注損傷中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路的活化從而減輕肝臟缺血再灌注損傷[6]。本研究采用缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細(xì)胞建立心肌缺血再灌注損傷模型，探討類葉升麻苷是否通過調(diào)控Rnd3/NF-κB通路進(jìn)而影響H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷過程。

1 材料

1.1 主要儀器

StepOnePlus型實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀購自美國ABI公司;FACS Calibur型流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter有限公司;DYCP-44N型快速凝膠電泳槽購自北京六一生物科技有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

類葉升麻苷（純度≥98%，貨號SA8050）、Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒（批號20190115）購自北京索萊寶科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基（批號20190203）、胎牛血清（批號20190205）、Trizol試劑（批號20190216）、反轉(zhuǎn)錄PCR試劑（批號20190101）、實時熒光定量PCR試劑（批號20181203）購自美國Thermo Fisher Scientific公司; Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（批號20181223）購自美國Invitrogen有限公司;空載體pcDNA、Rnd3過表達(dá)載體pcDNA-Rnd3、Rnd3小分子干擾RNA（si-Rnd3）及其陰性對照（si-NC）購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;血清乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malon- dialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（批號分別為20181220、20190103、20181116）購自南京建成生物工程研究所;腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）、IL-6檢測試劑盒（批號分別為20181118、20181005、20181018）購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;兔抗鼠Rnd3抗體（批號20190103）、NF-κB亞基p65（NF-κB p65）抗體（批號20190105）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號20181215）、結(jié)合緩沖液（批號20181224）、RIPA裂解液（批號20181118）、聚偏二氟乙烯膜（批號20181123）、TBST（批號20181018）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗鼠活化胱天蛋白酶3抗體（Cleaved Caspase-3，批號20190107）、Cleaved Caspase-9抗體（批號20190111）、內(nèi)參GAPDH抗體（批號20190110）與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號20190114）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞

本研究所用大鼠心肌細(xì)胞株H9c2購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。

2 方法

2.1 分組、造模和給藥

本實驗將H9c2心肌細(xì)胞分為對照組、H/R組、H/R+AS-L組、H/R+AS-M組、H/R+AS-H組、H/R+pcDNA組、H/R+pcDNA-Rnd3組、H/R+AS-H+si-NC組、H/R+AS-H+si-Rnd3組。（1）對照組：將H9c2心肌細(xì)胞接種于6孔板（1×104個/孔），于37 ℃、5%CO2的正常培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，不進(jìn)行造模;H/R組：參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行H/R造模，將H9c2心肌細(xì)胞接種于6孔板（1×104個/孔），置于缺氧環(huán)境（37 ℃、5%CO2、<6%O2的培養(yǎng)箱）中培養(yǎng)24 h，然后將其置于37 ℃、5%CO2的正常培養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)氧培養(yǎng)6 h;H/R+AS-L組、H/R+AS-M組、H/R+AS-H組：另取H9c2心肌細(xì)胞分別給予低、中、高濃度（10、30、90 μmol/L）的類葉升麻苷處理[8]，然后參照“H/R組”進(jìn)行H/R處理。（2）H/R+pcDNA組、H/R+pcDNA-Rnd3組：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將pcDNA（空載體）、pcDNA-Rnd3（使Rnd3過表達(dá)）轉(zhuǎn)染至H9c2心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后參照“H/R組”進(jìn)行H/R處理。（3）H/R+AS-H+si-NC組、H/R+AS-H+si-Rnd3組：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將si-NC（陰性對照）、si-Rnd3（抑制Rnd3過表達(dá)）轉(zhuǎn)染至H9c2心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后給予90 μmol/L的類葉升麻苷處理[8]，然后參照“H/R組”進(jìn)行H/R處理。每組設(shè)9個復(fù)孔。

2.2 細(xì)胞凋亡率的檢測

采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測。收集各組造模、給藥后的H9c2心肌細(xì)胞，加入預(yù)冷PBS洗滌，棄上清液后加入500 μL結(jié)合緩沖液，然后分別加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC試劑與5 μL PI試劑，充分混勻后室溫避光孵育10 min，于1 h內(nèi)檢測細(xì)胞凋亡率。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.3 LDH釋放量、MDA水平、SOD活性檢測

采用相應(yīng)試劑盒檢測。收集各組造模、給藥后的H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，以3 000 r/min離心5 min，收集上清液，檢測LDH釋放量;另將RIPA裂解液加入各組H9c2心肌細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞裂解，檢測MDA水平和SOD活性。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.4 TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測。收集各組造模、給藥后的H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，以3 000 r/min離心5 min，收集上清液，檢測TNF-α、IL-1β、IL-6水平。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.5 Rnd3、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平檢測

采用StepOnePlus實時熒光定量PCR儀檢測。取各組造模、給藥后的H9c2心肌細(xì)胞，加入1 mL Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以GAPDH作為內(nèi)參，進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液2.5 μL，MgSO4 2.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O補足體系至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。采用Quantity One軟件進(jìn)行分析，以目的基因條帶與內(nèi)參基因條帶的比值表示Rnd3、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平。PCR引物序列和產(chǎn)物長度見表1。

2.6 Rnd3、NF-κB p65、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平檢測

采用Western blot法檢測。取各組造模、給藥后的H9c2心肌細(xì)胞，加入500 μL RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白后，加入5×十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液于沸水中煮10 min使蛋白變性。取變性蛋白，按照每孔40 μg的密度進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳;轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜后室溫封閉2 h，加入Rnd3、NF-κB p65、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9一抗稀釋液與內(nèi)參GAPDH抗體稀釋液（稀釋度分別為1 ∶ 1 000、1 ∶ 1 000、1 ∶ 800、1 ∶ 800、1 ∶ 2 000），4 ℃孵育24 h;TBST洗滌，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1 ∶ 3 000）后室溫孵育1 h，暗室內(nèi)曝光顯影。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶灰度值比值表示蛋白表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以x±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 類葉升麻苷對H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡及Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞的凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）;與H/R組比較，H/R+AS-L組、H/R+AS-M組、H/R+AS-H組H9c2心肌細(xì)胞的凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），表明成功建立心肌缺血再灌注損傷模型;與H/R+AS-L組比較，H/R+AS-M組、H/R+AS-H組H9c2心肌細(xì)胞的凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平降低更顯著（P<0.05）;與H/R+AS-M組比較，H/R+AS-H組H9c2心肌細(xì)胞的凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平降低更顯著（P<0.05）。結(jié)果見表2、圖1。

a：與對照組比較，P<0.05;b：與H/R組比較，P<0.05;c：與H/R+AS-L組比較，P<0.05;d：與H/R+AS-M組比較，P<0.05

3.2 類葉升麻苷對H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的影響

與對照組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞的LDH釋放量和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高，SOD活性顯著降低（P<0.05）;與H/R組比較，H/R+AS-L組、H/R+AS-M組、H/R+AS-H組H9c2心肌細(xì)胞的LDH釋放量和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低，SOD活性顯著升高（P<0.05）;與H/R+AS-L組比較，H/R+AS-M組、H/R+AS-H組H9c2心肌細(xì)胞的LDH釋放量和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平及SOD活性的上述變化程度更顯著（P<0.05）;與H/R+AS-M組比較，H/R+AS-H組H9c2心肌細(xì)胞的LDH釋放量和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平及SOD活性的上述變化程度更顯著（P<0.05）。結(jié)果見表3。

3.3 類葉升麻苷對H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞 中Rnd3、NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞中Rnd3 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低，NF-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）;與H/R組比較，H/R+AS-L組、H/R+AS-M組、H/R+AS-H組H9c2心肌細(xì)胞中Rnd3 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高，NF-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;與H/R+AS-L組比較，H/R+AS-M組、H/R+AS-H組H9c2心肌細(xì)胞中Rnd3、NF-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá)水平的上述變化程度更顯著（P<0.05）;與H/R+AS-M組比較，H/R+AS-H組H9c2心肌細(xì)胞中Rnd3、NF-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá)水平的上述變化程度更顯著（P<0.05）。結(jié)果見圖2、表4。

3.4 Rnd3過表達(dá)對H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的影響

轉(zhuǎn)染pcDNA-Rnd3使Rnd3過表達(dá)后，與H/R+pcDNA組比較，H/R+pcDNA-Rnd3組H9c2心肌細(xì)胞中Rnd3蛋白表達(dá)水平、SOD活性顯著升高，而細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中NF-κB p65、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平，LDH釋放量和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見圖3、表5。

3.5 抑制Rnd3過表達(dá)聯(lián)合類葉升麻苷對H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的影響

轉(zhuǎn)染si-Rnd3抑制Rnd3過表達(dá)后再給予90 μmol/L的類葉升麻苷，與H/R+AS-H+si-NC組比較，H/R+AS-H+si-Rnd3組H9c2心肌細(xì)胞中Rnd3蛋白表達(dá)水平、SOD活性顯著降低，而細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中NF-κB p65、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平，LDH釋放量和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高（P<0.05）。結(jié)果見圖4、表6。

4 討論

研究表明，心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及過度凋亡等均與心肌缺血再灌注損傷有關(guān)，但其病因及致病機制尚未完全闡明[9]。臨床常采用藥物、介入與外科手術(shù)等進(jìn)行治療，可改善心肌缺血癥狀，但不能從根本上治愈心肌缺血再灌注損傷;而中藥的副作用較小、治療效果較好，可減輕心肌缺血再灌注損傷，但其作用機制尚未闡明[10-11]。

類葉升麻苷可通過增強乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性從而減輕缺糖缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)從而減輕谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷，抑制炎癥反應(yīng)從而改善腦缺血再灌注損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[12-14]。本研究結(jié)果顯示，H/R誘導(dǎo)后H9c2心肌細(xì)胞的凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平升高，與既往研究結(jié)果相似[15]，提示成功建立心肌缺血再灌注損傷模型;給予類葉升麻苷可減少H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的凋亡，且呈劑量依賴性，提示類葉升麻苷可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。本研究還發(fā)現(xiàn)，類葉升麻苷能逆轉(zhuǎn)H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞中LDH釋放量、MDA水平升高，SOD活性降低，與既往研究結(jié)果相似[16]，提示類葉升麻苷可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)從而減輕細(xì)胞氧化損傷;同時，類葉升麻苷能逆轉(zhuǎn)H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高，與既往研究結(jié)果相似[17]，且呈劑量依賴性，提示類葉升麻苷可抑制炎癥反應(yīng)從而減輕H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的炎癥損傷。

Rnd3屬于Rho蛋白家族成員，是Rho蛋白激酶1的抑制物，其在細(xì)胞凋亡、肌動蛋白骨架形成等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用[18]。研究表明，Rnd3表達(dá)上調(diào)可通過抑制NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)從而抑制心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激，減輕心肌缺血再灌注損傷;Rnd3表達(dá)下調(diào)可通過激活NF-κB通路從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[19]。NF-κB通路過度活化可造成心肌細(xì)胞損傷，抑制其激活可減輕心肌細(xì)胞損傷[20]。本研究結(jié)果顯示，H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞中Rnd3 mRNA及蛋白表達(dá)水平降低、NF-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá)水平升高，而類葉升麻苷處理后細(xì)胞中上述指標(biāo)水平逆轉(zhuǎn)，提示類葉升麻苷可能通過調(diào)控Rnd3/NF-κB通路從而減輕心肌缺血再灌注損傷。同時本研究結(jié)果顯示，Rnd3過表達(dá)可通過抑制NF-κB通路的活化從而抑制H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的凋亡、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，而抑制Rnd3過表達(dá)可激活NF-κB通路從而減弱類葉升麻苷對H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的凋亡、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的抑制作用，提示Rnd3/NF-κB通路可能是類葉升麻苷治療心肌缺血再灌注損傷的潛在通路。

綜上所述，類葉升麻苷可抑制H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)從而減輕細(xì)胞損傷，其作用機制可能與促進(jìn)Rnd3表達(dá)、抑制NF-κB p65表達(dá)有關(guān)，但其具體作用機制尚需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2021-08-30 修回日期：2021-12-14）

（編輯：舒安琴）

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