耐藥基因芯片技術(shù)對耐藥結(jié)核患者早期診治價值的研究

童涌 宋群 童照威

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的傳染病。根據(jù)2019年12月全國法定傳染病疫情概況報道，我國結(jié)核病年發(fā)病數(shù)為82.3萬例[1]，僅次于印度、印度尼西亞，位居全球第三位[2]。根據(jù)2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告，分離菌株對11種抗MTB藥物的耐藥率為38.5%～42.7%[3]。其中異煙肼、利福平是抗結(jié)核治療中最重要的一線藥物，故對其進(jìn)行耐藥性檢測具有重要臨床意義[4]。據(jù)報道，全球耐多藥結(jié)核患者有46萬例，而治療成功率僅為54%，病死率達(dá)16%[5]。因此，耐藥結(jié)核患者的早期快速診斷與及時治療是防治重點[6]。然而，由于MTB生長緩慢，采用傳統(tǒng)藥敏試驗檢測耗費時間較長，導(dǎo)致治療方案調(diào)整時機相對滯后[7]。耐藥基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，使得耐藥結(jié)核的早期快速診斷具有可能性。該檢測技術(shù)是目前MTB菌種分型和耐藥分子診斷的先進(jìn)方法，能檢測患者痰液標(biāo)本中是否含有MTB以及病原菌是否有利福平、異煙肼耐藥性相關(guān)基因rpoB/katG/inhA的基因突變（3個基因8個位點16種突變類型）。有學(xué)者應(yīng)用該技術(shù)檢測了MTB和耐藥基因突變位點，且與高通量測序法具有很好的一致性[8]。本研究就耐藥基因芯片技術(shù)對耐藥結(jié)核患者早期診治的價值進(jìn)行探討，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年6月至2020年12月湖州市中心醫(yī)院感染科結(jié)核病門診轄區(qū)內(nèi)（吳興區(qū)、南潯區(qū)）登記的細(xì)菌學(xué)陽性患者882例為研究對象，其中耐藥基因芯片技術(shù)引入前（采用傳統(tǒng)藥敏試驗）308例，為對照組；耐藥基因芯片技術(shù)引入后（同時采用傳統(tǒng)藥敏試驗和耐藥基因芯片技術(shù)檢測）574例，為觀察組。對照組男 213 例，女 95 例；年齡 14～85（48.3±17.8）歲。觀察組男 420 例，女 154 例；年齡 15～93（51.1±19.1）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）治療開始時病原學(xué)確診為肺結(jié)核；（2）無難以控制感染；（3）血清 ALT、AST、TBil水平均在正常值上限的2倍以內(nèi)；（4）血清絕對中性粒細(xì)胞計數(shù)≥1.5×109/L，PLT≥100×109/L；（5）血清肌酐、尿素氮均在正常范圍以內(nèi)；（6）尿常規(guī)檢查結(jié)果正常；（7）心功能正常；（8）無不能耐受抗結(jié)核治療的其他情況。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）單純診斷為肺外結(jié)核；（2）合并嚴(yán)重的心、腦、肝、腎疾??；（3）拒絕參與臨床試驗研究；（4）肺結(jié)核病情嚴(yán)重且拒絕治療。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 （1）耐藥基因芯片技術(shù)檢測：采集患者痰液標(biāo)本，使用北京博奧生物有限公司生產(chǎn)的晶芯LuxScan 10K/B微陣列芯片掃描儀、芯片洗干儀、芯片雜交儀、LuxScan通用微陣列圖像分析軟件、質(zhì)控探針、DNA芯片及雜交試劑（規(guī)格：12人/盒，批號：20190801）進(jìn)行檢測。①樣本處理：取2～3 ml痰液標(biāo)本，加入10%氫氧化鈉液化30 min；吸取1 ml液化后溶液至1.5 ml的離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入1 ml 0.9%氯化鈉溶液振蕩；12 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入50 μl核酸提取液，混勻后轉(zhuǎn)移至核酸提取管中；然后置于核酸快速提取儀，最大轉(zhuǎn)速振蕩5 min，再將提取管置于95℃水浴5 min，10 000 r/min離心1 min，置于-20℃保存待檢。②樣本檢測：分別取18 μl樣本加入到3個PCR管中，每管加入2 μl核酸，上機擴增，產(chǎn)生擴增體系1、2、3產(chǎn)物；擴增產(chǎn)物95℃變性5 min，冰水浴3 min。第1個新PCR管加入擴增體系1產(chǎn)物3 μl+擴增體系2產(chǎn)物3 μl+雜交緩沖液9 μl，第2個新PCR管加入擴增體系1 產(chǎn)物 3 μl+擴增體系 3 產(chǎn)物 3 μl+雜交緩沖液 9 μl；混勻后各取13.5 μl雜交混合物加入芯片點陣中，體系1、2產(chǎn)物雜交加入到利福平耐藥，體系1、3產(chǎn)物雜交加入到異煙肼耐藥，蓋好盒蓋，金屬封條密封，運行芯片雜交程序。最后將完成雜交的芯片進(jìn)行洗滌干燥，載入微陣列芯片掃描儀中自動進(jìn)行結(jié)果判讀。（2）傳統(tǒng)藥敏試驗：采集患者痰液標(biāo)本，使用改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行MTB培養(yǎng)，采用比例法檢測菌株的耐藥性。樣本用4%氫氧化鈉液化處理后接種至改良羅氏培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落后1～2周。菌液濃度為1 g/L，用0.9%氯化鈉溶液稀釋100、10 000倍，不同稀釋度菌液各0.01 ml分別接種至含藥培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱4周后讀取結(jié)果。

1.2.2 觀察指標(biāo) 觀察指標(biāo)包括異煙肼及利福平耐藥檢出率、耐藥性反饋時間（藥物產(chǎn)生耐藥性所需要的時間）以及治療第2或6個月末臨床癥狀、影像學(xué)好轉(zhuǎn)及痰檢陰轉(zhuǎn)情況。按照肺結(jié)核診療規(guī)范的要求，兩組患者均采取初定方案（初治：2HRZE/10HR；復(fù)治：3HRZE/6HRE）進(jìn)行治療，待傳統(tǒng)藥敏試驗或耐藥基因芯片技術(shù)檢測結(jié)果報告后及時調(diào)整治療方案。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異煙肼及利福平耐藥檢出率比較 觀察組（基因法）、觀察組（傳統(tǒng)法）、對照組（傳統(tǒng)法）患者異煙肼或利福平耐藥分別108、113、52例，其中異煙肼耐藥檢出率分別為18.5%、19.3%、16.6%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；利福平耐藥檢出率分別為7.5%、7.8%、8.7%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；異煙肼+利福平耐藥檢出率分別為7.1%、7.5%、8.4%，差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 1。

表1 異煙肼及利福平耐藥檢出率比較[例（%）]

2.2 耐藥性反饋時間比較 觀察組（基因法）、觀察組（傳統(tǒng)法）、對照組（傳統(tǒng)法）耐藥性反饋時間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，觀察組（基因法）耐藥性反饋時間短于對照組（傳統(tǒng)法）、觀察組（傳統(tǒng)法）（均 P＜0.05），而觀察組（傳統(tǒng)法）與對照組（傳統(tǒng)法）耐藥性反饋時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 2。

表2 耐藥性反饋時間比較（d）

2.3 治療第2個月末臨床癥狀、影像學(xué)好轉(zhuǎn)及痰檢陰轉(zhuǎn)情況比較 治療第2個月末，觀察組（基因法）患者總體臨床癥狀好轉(zhuǎn)率、影像學(xué)好轉(zhuǎn)率、痰檢轉(zhuǎn)陰率均明顯高于對照組（傳統(tǒng)法），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。在單異煙肼耐藥患者中，觀察組（基因法）患者痰檢轉(zhuǎn)陰率明顯高于對照組（傳統(tǒng)法）（P＜0.05），而臨床癥狀好轉(zhuǎn)率、影像學(xué)好轉(zhuǎn)率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；在單利福平耐藥患者中，觀察組（基因法）與對照組（傳統(tǒng)法）患者臨床癥狀好轉(zhuǎn)率、影像學(xué)好轉(zhuǎn)率、痰檢轉(zhuǎn)陰率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；在異煙肼+利福平耐藥患者中，觀察組（基因法）患者臨床癥狀好轉(zhuǎn)率、影像學(xué)好轉(zhuǎn)率、痰檢轉(zhuǎn)陰率均明顯高于對照組（傳統(tǒng)法），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05），見表 3。

表3 治療第2個月末臨床癥狀、影像學(xué)好轉(zhuǎn)及痰檢陰轉(zhuǎn)情況比較[例（%）]

2.4 治療第6個月末臨床癥狀、影像學(xué)好轉(zhuǎn)及痰檢轉(zhuǎn)陰情況比較 治療第6個月末，觀察組（基因法）與對照組（傳統(tǒng)法）患者總體臨床癥狀好轉(zhuǎn)率、影像學(xué)好轉(zhuǎn)率、痰檢轉(zhuǎn)陰率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。在單異煙肼耐藥患者中，觀察組（基因法）患者痰檢轉(zhuǎn)陰率明顯高于對照組（傳統(tǒng)法）（P＜0.05），而臨床癥狀好轉(zhuǎn)率、影像學(xué)好轉(zhuǎn)率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；在單利福平耐藥患者中，觀察組（基因法）與對照組（傳統(tǒng)法）患者臨床癥狀好轉(zhuǎn)率、影像學(xué)好轉(zhuǎn)率、痰檢轉(zhuǎn)陰率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；在異煙肼+利福平耐藥患者中，觀察組（基因法）患者影像學(xué)好轉(zhuǎn)率明顯高于對照組（傳統(tǒng)法）（P＜0.05），而臨床癥狀好轉(zhuǎn)率、痰檢轉(zhuǎn)陰率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表4。

表4 治療第6個月末臨床癥狀、影像學(xué)好轉(zhuǎn)及痰檢陰轉(zhuǎn)情況比較[例（%）]

3 討論

耐藥結(jié)核的早期診斷較為困難，一直是結(jié)核病診療的難點。傳統(tǒng)的肺結(jié)核診斷方式主要依賴于痰涂片尋找MTB，雖然檢測時間較短，但靈敏度較低（僅20%），且不能檢測MTB藥敏情況；而傳統(tǒng)的藥敏試驗雖然能檢測MTB藥敏情況，但檢測所需時間較長[9]，導(dǎo)致耐藥結(jié)核患者不能得到及時的治療。然而，耐藥基因芯片技術(shù)能在短時間內(nèi)獲得MTB感染及耐藥相關(guān)數(shù)據(jù)，具有較高的診斷及時性和準(zhǔn)確性[10]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，利用基因分子檢測技術(shù)能在治療第2個月末預(yù)測痰涂陽性患者5個月末的治療效果[11]。可見，臨床上對耐藥結(jié)核患者進(jìn)行早期診斷，將治療方案調(diào)整時機前移，可以讓患者得到及時、有效的抗結(jié)核治療。但是該研究僅僅停留在結(jié)核診斷方面，對耐藥結(jié)核患者干預(yù)研究的論證尚存在不足。因此，本研究從耐藥結(jié)核早期治療入手來探討耐藥基因芯片技術(shù)對耐藥結(jié)核患者早期診治的價值。

本研究結(jié)果顯示，在檢測一致性方面，耐藥基因芯片檢測與傳統(tǒng)藥敏試驗具有良好的一致性，但也存在部分異煙肼、利福平耐藥患者耐藥基因芯片技術(shù)未檢出但傳統(tǒng)藥敏試驗檢出耐藥的情況。筆者分析原因，發(fā)現(xiàn)觀察組（基因法）患者樣本經(jīng)高通量測序顯示部分利福平耐藥基因rpoB 531（TCG-TAT）不常見突變存在，可能由于耐藥基因芯片技術(shù)本身僅針對單個菌落，而本研究是應(yīng)用耐藥基因芯片技術(shù)直接檢測臨床痰標(biāo)本中MTB耐藥基因，而樣本中含有抑制因子、菌量少或非結(jié)核菌DNA干擾等因素導(dǎo)致出現(xiàn)無法判讀的情況[12]。在耐藥性反饋時間方面，本研究發(fā)現(xiàn)耐藥基因芯片技術(shù)明顯優(yōu)于傳統(tǒng)藥敏試驗（提早近42 d），而檢測結(jié)果的快速報告能為治療方案調(diào)整時間前移提供可能性。

那么，耐藥結(jié)核患者早期診斷與治療能否提高治療有效率呢？本研究結(jié)果顯示，治療第2個月末，觀察組（基因法）患者總體臨床癥狀好轉(zhuǎn)率、影像學(xué)好轉(zhuǎn)率、痰檢轉(zhuǎn)陰率均明顯高于對照組（傳統(tǒng)法），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義?？梢?，耐藥基因芯片技術(shù)能使治療方案調(diào)整時間前移，使患者的治療效果優(yōu)于對照組（傳統(tǒng)法）。但在治療第6個月末，兩組患者總體臨床癥狀好轉(zhuǎn)率、影像學(xué)好轉(zhuǎn)率、痰檢轉(zhuǎn)陰率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；這是說明觀察組（基因法）總體治療效果未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，原因可能是對照組（傳統(tǒng)法）患者雖然治療方案調(diào)整時間滯后于觀察組（基因法），但是經(jīng)過積極規(guī)范的治療后仍能取得良好的治療效果。在單異煙肼耐藥患者中，治療第2或6個月末，觀察組（基因法）患者痰檢轉(zhuǎn)陰率均明顯高于對照組（傳統(tǒng)法），而臨床癥狀好轉(zhuǎn)率、影像學(xué)好轉(zhuǎn)率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。這說明治療方案調(diào)整時間前移僅能提高單異煙肼耐藥患者的痰檢轉(zhuǎn)陰率，而對臨床癥狀及影像學(xué)好轉(zhuǎn)的影響不大，這可能是因為單異煙肼耐藥患者本身穩(wěn)定性差，治療過程中部分患者對異煙肼仍然有效[10]，且利福平及其他藥物（除異煙肼外）仍然達(dá)到有效治療劑量。在單利福平耐藥患者中，治療第2或6個月末，觀察組（基因法）與對照組（傳統(tǒng)法）患者臨床癥狀好轉(zhuǎn)率、影像學(xué)好轉(zhuǎn)率、痰檢轉(zhuǎn)陰率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。在異煙肼+利福平耐藥患者中，治療第2個月末，觀察組（基因法）患者臨床癥狀好轉(zhuǎn)率、影像學(xué)好轉(zhuǎn)率、痰檢轉(zhuǎn)陰率均明顯高于對照組（傳統(tǒng)法）；可能是因為對照組（傳統(tǒng)法）耐藥結(jié)核患者對異煙肼、利福平無效，僅使用乙胺丁醇、吡嗪酰胺等藥物不足以殺滅MTB，加上藥敏試驗報告時間長，導(dǎo)致治療方案調(diào)整滯后，使得2個月末治療效果較差。但在治療第6個月末，觀察組（基因法）患者影像學(xué)好轉(zhuǎn)率明顯高于對照組（傳統(tǒng)法），而臨床癥狀好轉(zhuǎn)率、痰檢轉(zhuǎn)陰率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義?？紤]原因是對照組（傳統(tǒng)法）根據(jù)藥敏試驗結(jié)果及時調(diào)整治療方案，加上治療時間延長，因此在治療6個月末時仍能取得有效的治療效果。但是，耐藥基因芯片技術(shù)也有一定的局限性。有文獻(xiàn)報道與涂片鏡檢法比較，基因分子檢測技術(shù)可以提高結(jié)核病的診斷率，但不能降低治療6個月時的患者病死率，這說明及時的診斷與治療方案調(diào)整并不一定能提高患者的治療效果[13]。

綜上所述，耐藥基因芯片技術(shù)能提高耐藥結(jié)核的早期快速診斷，有利于治療方案調(diào)整時機前移，提高患者治療效果。