網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)視角下瀉心湯對(duì)胃潰瘍的作用機(jī)制

吳 旭，徐 明，潘 洋

胃潰瘍（gastric ulcer，GU）是胃粘膜層和粘膜下層因胃腸防御因素與進(jìn)攻因素的生物學(xué)狀態(tài)失衡從而發(fā)生病理學(xué)改變［1］，以上腹部周期性、節(jié)律性疼痛，伴有反酸、噯氣、上腹部有局限性壓痛為主要臨床表現(xiàn)的消化系統(tǒng)疾?。?］。西醫(yī)常選用質(zhì)子泵抑制劑、胃酸中和劑、胃粘膜保護(hù)劑、抗生素等治療胃潰瘍，患者長(zhǎng)期使用會(huì)有諸多不良反應(yīng)，且病情容易反復(fù)［3］。中醫(yī)雖沒有胃潰瘍這一病癥，但從臨床表現(xiàn)來看可將其歸屬于“胃痛”“胃癰”等范疇，在整體思想和辨證論治的引導(dǎo)下運(yùn)用中醫(yī)療法，療效可觀，并能大大提高患者的生活質(zhì)量。

清熱瀉火之法是中醫(yī)藥治療胃潰瘍的主要方法之一，經(jīng)典名方——瀉心湯具有苦寒直折、清瀉胃火之功。瀉心湯出于《金匱要略》，又名三黃瀉心湯，由黃連、黃芩、大黃3 味中藥構(gòu)成。黃連味苦性寒，歸心、肝、膽、脾、胃經(jīng)，功能為清熱燥濕、瀉火解毒；黃芩味苦性寒，歸肺、膽、脾、大腸，功能為清熱燥濕、瀉火解毒，止血；大黃，味苦性寒，歸脾、胃、大腸、心包經(jīng)，功能為瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒。三藥合用，苦寒直折，清瀉火熱之邪。瀉心湯在中醫(yī)臨床中應(yīng)用頗為廣泛，現(xiàn)代研究認(rèn)為其具有抗炎、抑菌、抗幽門螺桿菌、保護(hù)胃粘膜、抑制腫瘤生長(zhǎng)等多種藥理學(xué)作用［4-8］，可用于治療消化性潰瘍、幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎、胃癌等多種消化系統(tǒng)疾病。有學(xué)者用瀉心湯結(jié)合溫針灸治療胃潰瘍患者30 例，臨床總有效率為93.33%［9］。有學(xué)者用瀉心湯結(jié)合針刺治療消化性潰瘍患者53 例，結(jié)果顯示，患者臨床癥狀顯著改善，血清中IL-6、TNF-α 和TGF-β1 較治療前明顯降低［10］。有學(xué)者將102 例幽門螺桿菌陽(yáng)性慢性胃炎隨機(jī)分成治療組和觀察組，每組各51 例，治療組予瀉心湯和抗生素，觀察組予抗生素，結(jié)果顯示，治療組總有效率明顯高于對(duì)照組［11］。有學(xué)者在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，瀉心湯可以顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖［8］。

從中醫(yī)學(xué)角度分析，胃潰瘍的發(fā)病可認(rèn)為是濕熱之邪壅聚于胃，久而不去，蘊(yùn)而化熱，熱盛肉腐，釀發(fā)癰瘍而成，且需清熱燥濕、瀉火解毒而治之。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，以“成分-靶點(diǎn)-通路”相互作用關(guān)系為引導(dǎo)思路，從多層次、多方向、多角度對(duì)瀉心湯治療胃潰瘍的作用機(jī)制進(jìn)行分析，希望通過“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)使中醫(yī)藥治療胃潰瘍的作用機(jī)制得以具體化、精準(zhǔn)化、可視化，為進(jìn)一步探討瀉心湯治療胃潰瘍作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 研究過程與方法

1.1 瀉心湯有效成分的篩選

瀉心湯的組成為黃連、黃芩、大黃。在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）中檢索3 味中藥的化學(xué)成分?？诜锢枚龋╫ral bioavailability，OB）是指口服藥物后，入血且可被機(jī)體吸收及利用的藥量與給藥量的比率；類藥性（drug-likeness，DL）是指化合物與已知藥物的相似性。當(dāng)二者值越大時(shí)，則代表化合物對(duì)人體越有科學(xué)研究?jī)r(jià)值。本文參照了以往網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究準(zhǔn)則，將OB≥30%、DL≥0.18 作為有效成分的納入標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 有效成分作用靶點(diǎn)的篩選

在TCMSP 平臺(tái)上查找有效成分的作用靶點(diǎn)，利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)查詢靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的人類基因組名稱。

1.3 胃潰瘍靶點(diǎn)基因的收集

以“gastric ulcer”為關(guān)鍵詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，獲取胃潰瘍的相關(guān)靶點(diǎn)基因。

1.4 瀉心湯與胃潰瘍共同靶點(diǎn)基因的獲取

在在線韋恩圖平臺(tái)中輸入上文獲得的有效成分靶點(diǎn)基因和胃潰瘍靶點(diǎn)基因，以獲取瀉心湯與胃潰瘍的共同靶點(diǎn)基因，并繪制韋恩圖。使用Cytoscape 3.7.1 軟件繪制“中藥-有效成分-交集靶點(diǎn)基因”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

在String 平臺(tái)中上傳上文獲得的“瀉心湯與胃潰瘍共同靶點(diǎn)基因”，物種設(shè)置選擇“Homo sapiens”，其他參數(shù)項(xiàng)為默認(rèn)值，分析蛋白質(zhì)的相互作用，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，下載 TSV 文件。使用Cytoscape 3.7.1 對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，取度中心性（degree centrality，DC）、介度中心性（betweenness centrality，BC）、緊密度中心性（closeness centrality，CC）的上四分位數(shù)，篩選出瀉心湯治療胃潰瘍的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。

1.6 GO 功能、KEGG 通路富集分析

在Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入上文獲得的“瀉心湯與胃潰瘍共同靶點(diǎn)基因”，在“物種設(shè)置”項(xiàng)選擇“H.sapiens”，設(shè)定P＜0.01 后，進(jìn)行生物學(xué)過程（gene ontology）和代謝通路（KEGG pathway analysis）富集分析，利用在線網(wǎng)絡(luò)作圖工具Bioinformatics 繪制富集圖。

1.7 構(gòu)建“中藥-有效成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

將藥物及其有效成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)基因、KEGG 富集通路（Count 值排名前20）導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件中，構(gòu)建“中藥-有效成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 瀉心湯有效成分及作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果

以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢到瀉心湯有效成分共63 個(gè)，其中黃連14 個(gè)，黃芩36個(gè)，大黃16 個(gè)（黃連與黃芩有2 個(gè)相同有效成分，大黃與黃芩有1 個(gè)相同有效成分），部分有效成分信息見表1。

表1 瀉心湯有效成分基本信息（部分）

續(xù)表1

將瀉心湯的63個(gè)有效成分導(dǎo)入TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，獲得900 個(gè)作用靶點(diǎn)，其中黃連285個(gè)，黃芩506 個(gè)，大黃109 個(gè)。在Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的人類基因名稱，然后進(jìn)行基因名標(biāo)準(zhǔn)化處理。

2.2 胃潰瘍與瀉心湯共同靶點(diǎn)基因的獲取結(jié)果

以“gastric ulcer”為關(guān)鍵詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢到胃潰瘍相關(guān)靶點(diǎn)基因5 066 個(gè)，以得分≥5 為篩選條件進(jìn)行篩選后得到960 個(gè)。瀉心湯的靶點(diǎn)基因去重后有228 個(gè)。在在線韋恩圖平臺(tái)上輸入胃潰瘍的重要靶點(diǎn)基因（得分≥5）和瀉心湯的去重靶點(diǎn)基因后得到109 個(gè)交集靶點(diǎn)基因，見圖1。將中藥、與交集靶點(diǎn)有直接作用關(guān)系的有效成分、交集靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape 3.7.1 軟件中制作“中藥-有效成分-交集靶點(diǎn)基因”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

圖1 瀉心湯與胃潰瘍交集靶點(diǎn)基因韋恩圖

圖2 “中藥-有效成分-交集靶點(diǎn)基因”網(wǎng)絡(luò)

圖2 所示的網(wǎng)絡(luò)中共有155 個(gè)節(jié)點(diǎn)、400 條連線，圓形表示中藥，六邊形表示有效成分（A1、A2 為黃連和黃芩共有成分，B 為大黃和黃芩共有成分），菱形表示交集靶點(diǎn)基因。其中節(jié)點(diǎn)越大，連線越密，則說明重要性越高，有效成分中HL10（槲皮素）、HQ2（漢黃芩素）、HQ4（黃芩素）、HQ1（刺槐素）、DH13（蘆薈大黃素）的節(jié)點(diǎn)較大，連線較密，分別對(duì)應(yīng)度值為96、29、19、14、14。

2.3 瀉心湯治療胃潰瘍的蛋白質(zhì)相互作用（PPI）結(jié)果

將上文獲得的109 個(gè)交集靶點(diǎn)基因上傳至String 平臺(tái)進(jìn)行蛋白相互作用分析，創(chuàng)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖3，下載TSV 文件。在Cytoscape 3.7.1 軟件中對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，取度中心性（DC）、介度中心性（BC）、緊密度中心性（CC）的上四分位數(shù)，篩選出瀉心湯治療胃潰瘍的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，見圖4。

圖3 瀉心湯治療胃潰瘍的PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖4 瀉心湯治療胃潰瘍關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖4 所示的網(wǎng)絡(luò)中包含25 個(gè)節(jié)點(diǎn)和598 條連線，故這25 個(gè)節(jié)點(diǎn)可能是瀉心湯治療胃潰瘍的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。其中節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，連線越密越粗，則說明地位越重要。AKT1、TP53、IL6、TNF、VEGFA 的節(jié)點(diǎn)較大，顏色較深，連線較密較粗，度值分別為94、94、88、87、87，所以瀉心湯治療胃潰瘍的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因可能為AKT1、TP53、IL6、TNF、VEGFA。

2.4 GO 功能和KEGG 通路富集結(jié)果

將瀉心湯和胃潰瘍的交集靶點(diǎn)基因上傳至Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析，設(shè)置P＜0.01，獲得1 803 個(gè)GO 條目，其中生物過程（biological processes，BP）1 598 個(gè)，主要包括對(duì)無機(jī)物的應(yīng)答、細(xì)胞凋亡的正調(diào)控、對(duì)激素的應(yīng)答、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞粘附的調(diào)控；細(xì)胞組成（cellular components，CC）64 個(gè)，主要包括膜筏、膜微區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物；分子功能（molecular functions，MF）141 個(gè)，主要包括激酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚體化活性，相關(guān)條目見圖5；KEGG 富集通路176 條，主要包括癌癥通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路。取Count 值排名前20 的KEGG 富集通路，將其導(dǎo)入Bioinformatics 網(wǎng)站中制作高級(jí)氣泡圖，見圖6。

圖5 瀉心湯治療胃潰瘍的GO 功能富集圖

圖6 瀉心湯治療胃潰瘍的KEGG 富集通路氣泡圖

2.5 “中藥-有效成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

將黃連、黃芩、大黃、與關(guān)鍵靶點(diǎn)有直接作用關(guān)系的有效成分、上文獲得的25 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因、Count 值排名前 20 的 KEGG 富集通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件中制作“中藥-有效成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖7。

圖7 “中藥-有效成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

圖7 所示的網(wǎng)絡(luò)中，圓形表示中藥，六邊形表示有效成分（A1、A2 為黃連和黃芩共有成分，B為大黃和黃芩共有成分），菱形表示交集靶點(diǎn)基因，V 形表示通路。該網(wǎng)絡(luò)可反映出瀉心湯通過“多成分、多靶點(diǎn)、多通路”的調(diào)控特點(diǎn)對(duì)胃潰瘍發(fā)揮治療作用。

3 結(jié)論與討論

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)、“中藥-有效成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖得出，瀉心湯治療胃潰瘍的重要有效成分為槲皮素、漢黃芩素、黃芩素、刺槐素、蘆薈大黃素。槲皮素具有抗炎、抗氧化、抑制胃酸分泌等多重藥理學(xué)功能，還可以通過抑制機(jī)體IL-6、TNF-α、VEGF 等炎癥因子的產(chǎn)生而發(fā)揮其抗炎作用［12］。胃潰瘍發(fā)生后胃粘膜表現(xiàn)出炎癥應(yīng)激反應(yīng)［13-15］，所以槲皮素可以通過其抗炎作用減輕胃粘膜的炎癥應(yīng)激反應(yīng)。槲皮素對(duì)胃酸的排泌也能產(chǎn)生良好的抑制作用［16-17］，所以槲皮素也能夠利用其抑酸的功能減少胃酸對(duì)潰瘍面的破壞從而促使消化道黏膜的修復(fù)。幽門螺桿菌感染是胃潰瘍發(fā)生的重要原因之一［18］，槲皮素還可以抑制幽門螺桿菌在機(jī)體中的生長(zhǎng)［17,19-20］。漢黃芩素、黃芩素也具有較好的抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多重藥理學(xué)功能，能夠抑制機(jī)體TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、COX-2 等多種炎癥因子的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎作用［21-24］。漢黃芩素可以下調(diào)JAK1/2 的表達(dá)減少STAT3 的磷酸化進(jìn)而加快胃癌細(xì)胞的凋亡［25］。有試驗(yàn)研究結(jié)果表明黃芩素能夠上調(diào)胃癌MGC-803 細(xì)胞中caspase-3、PARP 水平，下調(diào)PARP 水平進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡［26］。所以漢黃芩素、黃芩素能夠抑制機(jī)體炎癥因子的生成，降低胃粘膜炎癥反應(yīng)，從而對(duì)胃潰瘍產(chǎn)生治療效應(yīng)。此外，胃潰瘍?yōu)槲赴┣盃顟B(tài)，漢黃芩素、黃芩素又能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，可以預(yù)防胃潰瘍進(jìn)一步朝向胃癌發(fā)展，所以瀉心湯治療胃潰瘍能體現(xiàn)出中醫(yī)學(xué)“治未病”的理論思想。刺槐素使Fas 和FasL、Bax 和p53 的表達(dá)上調(diào)，Bcl-2和Bad 的表達(dá)下調(diào)，通過活化Fas 通路抑制了胃癌AGS 細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡［27］。刺槐素還具有良好的鎮(zhèn)痛作用。有研究報(bào)道，在小鼠的扭體試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ED50的刺槐素鎮(zhèn)痛作用明顯強(qiáng)于ED50雙氯芬酸鈉［28］，所以瀉心湯治療胃潰瘍時(shí)除了有抗炎、抗腫瘤的效果外，還具有對(duì)癥止痛的作用。胃粘膜被胃酸、胃蛋白酶自身破壞是胃潰瘍發(fā)病的主要原因［29-31］，蘆薈大黃素可以抑制胃酸的分泌［32-33］，與胃蛋白酶結(jié)合形成復(fù)合物后改變其構(gòu)象［34-35］，減少胃酸、胃蛋白酶對(duì)胃粘膜的侵蝕。

由蛋白相互作用（PPI）結(jié)果、瀉心湯治療胃潰瘍關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)可知，瀉心湯治療胃潰瘍核心靶點(diǎn)為AKT1、TP53、IL6、TNF、VEGFA。AKT1 是AKT 家族中的一個(gè)亞型，是參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的靶點(diǎn)基因［36-37］。AKT1 可以通過促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th17 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而調(diào)控促炎癥因子IL-17 的表達(dá)［38］。有試驗(yàn)研究報(bào)道，AKT1 表達(dá)上調(diào)后可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 型極化，減輕機(jī)體組織的炎癥反應(yīng)［39］，所以可以通過瀉心湯來調(diào)控AKT1 降低促炎癥因子的產(chǎn)生，減輕胃粘膜的炎癥應(yīng)激反應(yīng)，達(dá)到治療胃潰瘍的目的。正常的TP53可以促進(jìn)機(jī)體胃粘膜及組織的修復(fù)，但突變后基因異常表達(dá)，其原有的抑癌功能缺失，誘導(dǎo)胃粘膜細(xì)胞凋亡，增加胃潰瘍向胃癌發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)［40］。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，胃潰瘍模型大鼠TP53 有明顯的升高，胃粘膜的損傷程度與TP53 突變型基因的表達(dá)呈正相關(guān)［41］。瀉心湯可能是通過下調(diào)TP53 突變型基因的表達(dá)，減輕胃粘膜的損傷，促進(jìn)胃粘膜的修復(fù)而對(duì)胃潰瘍起到治療作用。IL6、TNF 均為炎癥因子編碼基因。有相關(guān)研究報(bào)道，胃潰瘍患者相較于健康人，血清中TNF-α、IL-6 水平明顯偏高［42-43］。TNF-α 可促進(jìn)急性蛋白的生成，活化中性粒細(xì)胞，炎癥組織內(nèi)血小板凝聚，血氧降低，對(duì)胃粘膜造成持續(xù)性傷害［44］。因此可以推測(cè)，使用瀉心湯可以下調(diào)IL6、TNF 基因的表達(dá)，減少炎癥因子的產(chǎn)生，減輕炎癥對(duì)胃粘膜組織的損傷。VEGFA 是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A 的編碼基因，表達(dá)上調(diào)后可以活化血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)新的血管形成［45］，還可以抑制TNF、IL6 的生成，從而降低機(jī)體炎癥反應(yīng)［46］。

通過GO 功能富集分析可知，生物過程富集程度較高的是對(duì)無機(jī)物的應(yīng)答、細(xì)胞凋亡的正調(diào)控、對(duì)激素的應(yīng)答、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞粘附的調(diào)控；細(xì)胞組成富集程度較高的是膜筏、膜微區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物；分子功能富集程度較高的是激酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚體化活性。通過KEGG 通路富集分析得出，富集程度較高的通路為癌癥通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路。PI3K-Akt 信號(hào)通路激活后可以調(diào)控胃粘膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖［47］。有研究證實(shí)MAPK 信號(hào)通路與胃潰瘍的發(fā)生密切相關(guān)，該通路的EGFR/ERK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的任何一個(gè)分子表達(dá)異常都將會(huì)導(dǎo)致胃潰瘍的發(fā)生［48］。

綜上所述，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，對(duì)瀉心湯的多成分、多靶點(diǎn)與胃潰瘍之間的網(wǎng)狀關(guān)系進(jìn)行了研究，認(rèn)為瀉心湯通過槲皮素、漢黃芩素、黃芩素、刺槐素、蘆薈大黃素等有效成分調(diào)控AKT1、TP53、IL6、TNF、VEGFA 等核心靶點(diǎn)，以及癌癥通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路等主要通路，發(fā)揮抗炎、抑酸、抗幽門螺桿菌、保護(hù)胃粘膜、防癌抑癌等作用，對(duì)胃潰瘍起到治療目的。

4 結(jié)語(yǔ)

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)屬于生物信息學(xué)的分支，可以利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)、計(jì)算機(jī)軟件和數(shù)據(jù)分析技術(shù)尋找醫(yī)學(xué)生物信息，構(gòu)建并分析藥物與疾病之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。本文以經(jīng)典名方——瀉心湯與疾病胃潰瘍作為研究對(duì)象，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，使用相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件篩選并分析瀉心湯治療胃潰瘍所涉及的有效成分、靶點(diǎn)、通路，通過GO 功能富集分析，構(gòu)建“有效成分-交集靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，將它們之間的相互作用關(guān)系進(jìn)行可視化，找出瀉心湯治療胃潰瘍的核心成分、核心靶點(diǎn)、主要通路，為進(jìn)一步研究瀉心湯治療胃潰瘍作用機(jī)制提供了參考。