網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)視角下柴胡對肝硬化的作用機(jī)制

孫志紅，于 琦，楊思遠(yuǎn)，孫 焱

肝硬化是由某種病因激發(fā)的，其組織學(xué)特征為肝組織細(xì)胞彌漫性纖維化、假小葉和再生結(jié)節(jié)［1］。肝硬化在全球的發(fā)病率逐年上升，我國為肝硬化的高發(fā)地區(qū)。肝硬化臨床發(fā)病率高，危害大。除肝移植外，目前西醫(yī)并無治療肝硬化的切實(shí)辦法，常采用保肝、抗病毒等療法，但治療費(fèi)用高昂，患者長期用藥易產(chǎn)生抗藥性，也會損傷患者的消化系統(tǒng)功能，加重其肝腎負(fù)擔(dān)，療效不佳［2-3］。中醫(yī)根據(jù)肝硬化的臨床癥狀將其納入“脅痛”“積聚”“黃疸”“鼓脹”的范疇［4］。中醫(yī)整體施治、審證求因，其活血散瘀、化樞散結(jié)、養(yǎng)陰解毒等法［5］在抗肝硬化治療中已取得一定療效［6］。

柴胡歸肝經(jīng)，在治療肝病方面已有悠久歷史，柴胡類方也是《傷寒論》中的經(jīng)典方劑。柴胡別稱山菜、地熏、茈胡，性微寒，味苦且辛［7］。《神農(nóng)本草經(jīng)》云：“柴胡，可主心腹，去腸胃中結(jié)氣”［8］。已有研究表明柴胡有解除肝氣瘀滯、抗癌、抗纖維化的療效［9］。柴胡治療肝硬化在中醫(yī)領(lǐng)域已有應(yīng)用，但目前國內(nèi)研究多注重臨床觀察、病例展示，分子層面的理論支持較為欠缺，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不清晰，治療機(jī)制不透明，因而柴胡治療肝硬化的方案臨床采用率較低，不利于中醫(yī)藥現(xiàn)代化健康發(fā)展。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是根據(jù)“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”間的作用關(guān)系，運(yùn)用已有的基因庫、蛋白庫、疾病庫、藥物庫等數(shù)據(jù)庫的相關(guān)信息，結(jié)合從實(shí)驗(yàn)中獲取的圖譜信息，使用專門的網(wǎng)絡(luò)軟件及相應(yīng)的算法，具體清晰地揭示疾病與疾病、疾病表型與靶點(diǎn)蛋白、靶點(diǎn)蛋白與藥物、藥物與藥物間的互作方式，從網(wǎng)絡(luò)的范疇監(jiān)控藥物對疾病的作用，從而摸索出有效且副作用小的多靶點(diǎn)新藥［10-11］。

分子對接是把Pubchem 等三維數(shù)據(jù)庫中的小分子依次置于靶標(biāo)分子的活性位點(diǎn)，經(jīng)過持續(xù)整合受體化合物的位置、構(gòu)象、分子內(nèi)部可旋轉(zhuǎn)鍵的二面角和受體的氨基酸殘基側(cè)鏈及骨架，探求受體小分子和靶標(biāo)大分子相互作用的最優(yōu)組合，并推斷其結(jié)合方式及親和力。分子對接可經(jīng)過一系列函數(shù)計(jì)算篩選出最貼合的天然構(gòu)象和受體親和力最好的配體，是模仿分子間作用的方法［12-13］。分子對接技術(shù)縮短了藥物開發(fā)周期，具有快速、精確度高的特點(diǎn)，在藥物研發(fā)領(lǐng)域大有作為，是先導(dǎo)化合物發(fā)掘和不斷優(yōu)化的實(shí)用工具［14］。

本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法并結(jié)合分子對接技術(shù)從分子層面詳細(xì)探究柴胡治療肝硬化的作用機(jī)制，為進(jìn)一步明確柴胡治療肝硬化的作用機(jī)制提供理論支持，以期為今后肝硬化的治療研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform，TCMSP）以“Herb name=chaihu”為檢索詞獲取柴胡的全部有效成分，設(shè)置藥物篩選標(biāo)準(zhǔn)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，移除不合格成分，得到可藥用成分信息。

1.2 研究方法

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)且成熟的研究方法，可多靶點(diǎn)、多組分地將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)相聯(lián)系，全面揭示藥物的作用機(jī)制。因而，本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對柴胡治療肝硬化的成分及靶點(diǎn)進(jìn)行分析歸納，通過系統(tǒng)的分析方法篩選出核心靶點(diǎn)，探究其治療肝硬化的作用機(jī)制。

1.2.1 篩選柴胡治療肝硬化的作用靶點(diǎn)

通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫和DisGeNet 數(shù)據(jù)庫篩選出肝硬化關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)，移除重疊靶點(diǎn)，得到肝硬化靶點(diǎn)信息?；赩enny 2.1.0 在線數(shù)據(jù)庫對肝硬化靶點(diǎn)和柴胡作用靶點(diǎn)取交集，獲得柴胡和肝硬化的共同靶點(diǎn)。

1.2.2 初步構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

將篩選出的有效成分及靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件，計(jì)算拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)并且構(gòu)建“柴胡活性化合物-肝硬化靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，然后進(jìn)行可視化分析。

1.2.3 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，篩選核心靶點(diǎn)

將柴胡和肝硬化的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入在線數(shù)據(jù)庫STRING 進(jìn)行分析，生成蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（Protein-protein Interaction Network，PPI）。利用Cytoscape 3.8.2 軟件中的CytoNCA 插件及其算法程序篩選出核心靶點(diǎn)，構(gòu)建核心子網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

基于DAVID 在線數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，使用R 程輯包（ggpubr、tidyr、stringr、ggplot2）對富集結(jié)果進(jìn)行可視化分析，設(shè)置p＜0.05 為閾值，篩選符合條件的前20 位KEGG信號通路及GO 生物過程。

1.2.5 分子對接

對通過PPI 拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)篩選出的核心基因與其對應(yīng)活性成分進(jìn)行分子對接。在Pubchem 數(shù)據(jù)庫檢索出柴胡有效成分的二維結(jié)構(gòu)，將其導(dǎo)入ChemBio 3D Ultra v14.0.0.117 軟件轉(zhuǎn)換為三維結(jié)構(gòu)。使用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB）查找核心靶蛋白，將其導(dǎo)入Pymol 2.4.1 軟件解除水分子及其原有配體。Pymol 2.4.1 是蛋白質(zhì)可視化軟件，可以多角度展示蛋白質(zhì)的不同形態(tài)，并對其進(jìn)行操作。將柴胡有效成分的三維結(jié)構(gòu)和去除水分子及配體的核心靶蛋白導(dǎo)入AutoDockTool 1.5.6 軟件進(jìn)行分子對接。

2 結(jié)果與分析

2.1 柴胡的成分及相關(guān)靶點(diǎn)

通過檢索柴胡的有效成分發(fā)現(xiàn)，柴胡中有349種活性成分，將閾值調(diào)整為OB≥30%，DL≥0.18，共得到山柰酚（Kaempferol）、乙酸芳樟酯（Linoleyl acetate）、槲皮素（Quercetin）、豆甾醇（Stigmasterol）、茵陳黃酮（Areapillin）、黃芩苷（Baicalin）、異鼠李素（Isorhamnetin）等17 種成分，詳細(xì)信息見表1。這17 種成分分別作用于194 個靶點(diǎn)，其中部分靶點(diǎn)的Uniprot 編號、靶點(diǎn)名稱、基因名稱信息見表2。

表1 柴胡有效成分基本信息

續(xù)表1

表2 柴胡有效成分作用靶點(diǎn)（部分）

2.2 “柴胡活性化合物-肝硬化靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫和DisGeNet數(shù)據(jù)庫查找肝硬化相關(guān)的編碼基因，獲得肝硬化相關(guān)靶點(diǎn)4 754 個?；赩enny 2.1.0 在線軟件繪制韋恩圖的功能，對柴胡的194 個藥物潛在靶點(diǎn)和肝硬化的4 754 個靶點(diǎn)取交集，得到159 個共同靶點(diǎn)，如圖1 所示。這159 個靶點(diǎn)既是肝硬化相關(guān)的靶點(diǎn)，也是柴胡治療肝硬化的作用靶點(diǎn)。將共同靶點(diǎn)和活性成分導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件進(jìn)行可視化分析，得到“肝硬化-柴胡活性化合物”網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。其中外圍黃色部分表示共同靶點(diǎn)，紅色部分表示藥物活性成分。

圖1 “肝硬化-柴胡靶點(diǎn)”韋恩圖

圖2 “肝硬化-柴胡活性化合物”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將159 個共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 在線數(shù)據(jù)庫中，設(shè)置物種為Homo Sapiens，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，展示了靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系。該網(wǎng)絡(luò)共有157 個節(jié)點(diǎn)（2 個靶點(diǎn)未被系統(tǒng)納入），2 963 條邊，見圖3。將PPI 網(wǎng)絡(luò)的TSV 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2，利用Cytoscape 3.8.2 中的CytoNCA 插件進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，根據(jù)插件算法在這157 個節(jié)點(diǎn)中篩選出連通性、緊密度、特征向量、中間度均靠前的15 個節(jié)點(diǎn)，利用這15 個節(jié)點(diǎn)構(gòu)建出核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，過程見圖4。篩選出的15 個核心靶點(diǎn)既受柴胡活性化合物的調(diào)控，也與肝硬化的發(fā)病密切相關(guān)，詳細(xì)信息見表3。

表3 “柴胡治療肝硬化核心基因”詳細(xì)信息

圖3 “柴胡治療肝硬化靶點(diǎn)作用靶點(diǎn)”PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)中核心靶點(diǎn)篩選過程

2.4 GO 生物過程和KEGG 通路富集分析

將柴胡與肝硬化的交集基因上傳至DAVID 在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 分析，以p＜0.05、最小計(jì)數(shù)為3 且富集因子＞1.5 為閾值進(jìn)行篩選，獲得GO 分析結(jié)果。利用R 程輯包（tidyr、stringr、ggpubr）將GO 分析結(jié)果可視化。依照p值從小到大的次序，選取前20 條GO 分析條目（圖5）。具體包括：生物進(jìn)程（biological process，BP）——細(xì)胞表面受體信號通路、病毒過程、子宮內(nèi)胚胎發(fā)育、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、t 細(xì)胞受體信號通路、對病毒的防御反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞生長的正調(diào)控、細(xì)胞或亞細(xì)胞成分的運(yùn)動、轉(zhuǎn)化生長因子β 受體信號通路；細(xì)胞組分（cellular components，CC）——黏著斑、神經(jīng)元胞體、突觸、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、基底外側(cè)質(zhì)膜；分子功能（molecular function，MF）——氧化還原酶活性、轉(zhuǎn)錄共激活因子活性、蛋白質(zhì)二聚化活性、鐵離子結(jié)合、跨膜信號受體活性等。

圖5 “柴胡治療肝硬化作用靶點(diǎn)”GO 富集分析柱狀圖

經(jīng)過柴胡治療肝硬化的靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析共獲得130 條KEGG 通路，依照p值從小到大的次序篩選前20 條，主要為癌癥途徑、乙型肝炎、TNF 信號通路、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、美洲錐蟲病、非小細(xì)胞性肺癌、Hif-1 信號通路、癌癥中的蛋白多糖、慢性髓細(xì)胞樣白血病、弓形體病、結(jié)腸直腸癌、小細(xì)胞肺癌、甲型H1N1 流感、丙型肝炎、Toll 樣受體信號通路、HTLV-I 感染、利什曼病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤。利用R 程輯包（tidyr、ggplot2）對這些KEGG 通路進(jìn)行分析及可視化（圖6）。

圖6 “柴胡治療肝硬化作用靶點(diǎn)”KEGG 富集分析氣泡圖

2.5 分子對接及結(jié)合能分析

對根據(jù) PPI 拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)篩選出的核心基因（AKT1、TP53、IL6、TNF、VEGFA、JUN、IL1B、CASP3、HIF1A、MYC、EGFR、PTGS2、EGF、MMP9、CCND1）與其對應(yīng)活性成分（乙酸芳樟酯、山柰酚、槲皮素）進(jìn)行分子對接，驗(yàn)證柴胡活性成分與靶點(diǎn)的對應(yīng)關(guān)系。一般認(rèn)為，結(jié)合能小于-4.5 kcal/mol表示可以結(jié)合，結(jié)合能小于-6 kcal/mol 表示結(jié)合能力強(qiáng)［15］，其結(jié)果見表4。由表4 可見，乙酸芳樟酯與PTGS2、EGF 結(jié)合效果較好；山柰酚與CASP3、JUN、TNF 結(jié)合效果較好，與AKT1 可以結(jié)合，但結(jié)合效果有待進(jìn)一步研究；槲皮素與MYC、EGFR、CCND1 結(jié)合效果較好，與MMP9可以結(jié)合，與TP53、IL6、VEGFA3 結(jié)合效果較差。另外，在分子對接過程中發(fā)現(xiàn)，靶點(diǎn)HIF1A、IL1B無法與柴胡的活性成分成功對接。靶點(diǎn)分子對接三維圖見圖7。

表4 柴胡活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)果

圖7 “柴胡活性成分與核心靶點(diǎn)”分子對接三維圖

3 討論

21 世紀(jì)以來，我國社會經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展，人們的生活結(jié)構(gòu)發(fā)生巨變，人口老齡化進(jìn)程加劇，國民疾病譜出現(xiàn)了很大的變化，心血管疾病、肝腎疾病、腫瘤等慢性復(fù)雜病非常突出，已經(jīng)威脅到了我國人民的生命健康安全［16-17］。這些慢性病及其并發(fā)癥在發(fā)展過程中往往牽涉人體的多個器官、多個信號通路、多個靶點(diǎn)［18］，因此，西方醫(yī)學(xué)“一個靶點(diǎn)、一種疾病”［19］的藥物理念已經(jīng)很難達(dá)到很好的療效。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)“多基因、多靶點(diǎn)、多通路”及中藥“多靶點(diǎn)、多路徑、多組分”聯(lián)合作用［20］，與這些慢性病的治療理念不謀而合。因此，探究中藥多組分、多靶點(diǎn)間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，在闡述慢性病的發(fā)病機(jī)制和尋找治療靶標(biāo)方面十分必要。

肝硬化是全世界肝病患者死亡的主要病因之一，許多急、慢性肝病最后均可能演化為肝硬化［21］。全世界肝硬化病亡人口從1990 到2013 年上漲40 余萬［22-23］。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建了柴胡治療肝硬化的網(wǎng)絡(luò)圖譜，依次分析了其活性成分、調(diào)控靶點(diǎn)、生物進(jìn)程和信號通路，解釋了柴胡在治療肝硬化中的作用。根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選出了AKT1、TP53、IL6、TNF、VEGFA、JUN、IL1B、CASP3、HIF1A、MYC、EGFR、PTGS2、EGF、MMP9、CCND1 共15 個靶點(diǎn)度值較高的靶點(diǎn)。結(jié)合分子對接結(jié)果預(yù)測出柴胡治療肝硬化的關(guān)鍵靶點(diǎn)為PTGS2、EGF、CASP3、JUN、TNF、MYC、EGFR、CCND1。柴胡的有效成分可能是與這8 個關(guān)鍵靶點(diǎn)協(xié)同作用的。目前已有研究表明抑制PTGS2 可降低肝臟炎性損傷，PTGS2 可能是治療肝損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)［24-25］。EGF 促進(jìn)細(xì)胞分裂，與組織的修復(fù)再生、癌癥的發(fā)生有緊密的聯(lián)系［26］，肝硬化的發(fā)生與其存在關(guān)聯(lián)［27］。肝細(xì)胞CASP3 在激活NASH 相關(guān)的細(xì)胞纖維化中有突出作用［28］。JUN 與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)［29］，而在我國，將近85%的原發(fā)肝癌有肝硬化病理基礎(chǔ)［30］，可以推斷JUN 與肝硬化發(fā)病機(jī)制存在聯(lián)系［31］。有研究發(fā)現(xiàn)，降低血清中的TNF-α、IL-6、IL-8 水平后，肝纖維化的發(fā)展受到抑制［32］。MYC 在肝細(xì)胞增殖和肝臟腫瘤發(fā)生過程中起重要作用［33］。有研究表明，黏著斑激酶磷酸化后，可調(diào)控細(xì)胞周期蛋白從而促進(jìn)肝星狀細(xì)胞增殖，形成肝纖維化。而基因CCND1 參與細(xì)胞周期蛋白的編碼，若可調(diào)控該基因則可調(diào)控細(xì)胞纖維化進(jìn)程［34］，肝硬化發(fā)病率可得到有效控制。以上資料證明本文篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)參與肝臟內(nèi)的多個生物進(jìn)程，GO 富集分析結(jié)果表明，柴胡有效成分的靶點(diǎn)涉及人體內(nèi)的多個生物進(jìn)程，參與人體內(nèi)的多項(xiàng)機(jī)體活動，說明用柴胡治療肝硬化的過程是多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用的。

KEGG 富集結(jié)果顯示，柴胡治療肝硬化涉及多條信號通路，主要與癌癥途徑（51 個靶點(diǎn)參與）、乙型肝炎（35 個靶點(diǎn)參與）、TNF 信號通路（25 個靶點(diǎn)參與）聯(lián)系密切。乙型肝炎是我國肝硬化的主要病因，每年乙型肝炎發(fā)展所導(dǎo)致的肝硬化、肝癌等患者死亡數(shù)達(dá)26.3 萬［35］。研究結(jié)果表明參與乙型肝炎的靶點(diǎn)與參與肝硬化的靶點(diǎn)重合率較高，同時參與肝硬化的靶點(diǎn)與參與肝癌的靶點(diǎn)重合率也非常高，證實(shí)這兩條通路與肝硬化相關(guān)。TNF 信號通路在肝硬化的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，有關(guān)研究表明位于肝竇內(nèi)表面的吞噬細(xì)胞（KCs）源性TNF-α 的釋放增殖可以經(jīng)TNFR/caspase8 通路誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡［36］，且肝星狀細(xì)胞活躍分化是肝纖維化產(chǎn)生的核心樞紐［37-38］，肝星狀細(xì)胞啟動機(jī)制和控制啟動的路徑研究成為治愈肝纖維化（早期肝硬化）的突破點(diǎn)［39］。

本文通過一系列分析發(fā)現(xiàn)，柴胡的有效活性成分有17 種，治療肝硬化的關(guān)鍵成分有乙酸芳樟酯、山柰酚、槲皮素。目前有研究結(jié)果顯示乙酸芳樟酯可以調(diào)節(jié)肝臟中的線粒體功能［40］，而有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證保護(hù)肝中的線粒體就可以保護(hù)肝細(xì)胞，抑制肝硬化［41］。山奈酚作用于緊密連接蛋白，能夠有效治療小鼠的肝損傷［42］，而慢性肝損傷患者修復(fù)期會出現(xiàn)病理或生理性肝硬化［43］。槲皮素在體內(nèi)和體外模型中均有抗纖維化活性，且在槲皮素的功能位置添加甲基可強(qiáng)化槲皮素的抗纖維化作用［44］。本文研究結(jié)果與上述相符，說明柴胡在治療肝硬化時具有多成分協(xié)作的特點(diǎn)。

4 結(jié)語

近年來，傳統(tǒng)醫(yī)藥在醫(yī)療領(lǐng)域逐漸發(fā)揮重大作用，許多疑難病癥通過中醫(yī)救治都有了很好的療效。對中藥作用機(jī)制細(xì)化可增強(qiáng)治療的可信性，有利于中醫(yī)藥更加深遠(yuǎn)的發(fā)展。本文預(yù)見了柴胡治療肝硬化的有效活性成分、靶點(diǎn)、結(jié)合形式及相關(guān)通路，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)給出了多成分、多靶點(diǎn)、多路徑的交互關(guān)聯(lián)結(jié)果，為研究柴胡的有效成分及肝硬化治療的機(jī)制提供了理論層面的依據(jù)。