當(dāng)歸多糖對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠糖化血清蛋白、免疫反應(yīng)及氧化應(yīng)激的影響?

孟祥云，汪永鋒，郭樹明，楊麗霞，張之弘，王永勝

1甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)；3甘肅省中醫(yī)藥研究院；4張掖市甘州區(qū)人民醫(yī)院急診科

研究顯示［1］，2型糖尿病患者血循環(huán)中糖蛋白、急性期反應(yīng)物及白細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯增高；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，炎性標(biāo)志物能夠反映和預(yù)測(cè)2型糖尿病及其代謝綜合征的發(fā)生。2型糖尿病及其并發(fā)癥患者表現(xiàn)出全身性、低度性、慢性的炎癥反應(yīng)。因此2型糖尿病與免疫、炎癥有著密切的聯(lián)系。同時(shí)研究顯示，氧化應(yīng)激貫穿糖尿病的產(chǎn)生和發(fā)展過程中，起到重要作用［2］。而機(jī)體異常免疫應(yīng)答又能夠產(chǎn)生大量自由基，對(duì)胰島β細(xì)胞具有極大的破壞作用。

當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels屬傘形科植物，以干燥根入藥，有補(bǔ)血、和血，調(diào)經(jīng)止血，潤腸滑腸作用［3］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸中含有多種成分，主要包括揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖以及黃酮類化合物，具有廣泛的生物活性，如調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)肝臟［4］、抗動(dòng)脈粥樣硬化［5］、抗腫瘤［6］、抗炎鎮(zhèn)痛［7-8］等。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸多糖（angelica polysaccharides，AP）能夠有效降低血糖，調(diào)節(jié)脂代謝［9-10］。本研究通過鏈脲霉素（strep-tozotocin，STZ）誘導(dǎo)建立2型糖尿病大鼠模型，觀察當(dāng)歸多糖在2型糖尿病中糖化血清蛋白（glycated serum protein，GSP）、免疫反應(yīng)及抗氧化的活性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（甘）2015-0002，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號(hào)：SYXK（甘）2015-0005。飼養(yǎng)條件：大鼠飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度18～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 試藥及儀器當(dāng)歸多糖（純度98%，陜西慈緣生物技術(shù)有限公司提取，批號(hào)：CY170321）；吡格列酮片（廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：H44025019，規(guī)格：30 mg/片）；鏈脲佐菌素（SIGM公司，批號(hào)：51254975，規(guī)格：5 mg/瓶）；生理鹽水（華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：H11021635，規(guī)格：250 mL/瓶），用蒸餾水稀釋濃度為0.7 mg/mL的注射液，保存條件要避光；糖化血清蛋白ELISA測(cè)定試劑盒（上海信帆生物科技有限公司，批號(hào)：20171204341）；免疫球蛋白免疫球蛋白A［（immunoglobulin A，IgA）、免疫球蛋白G（immunoglobin G，IgG）、免 疫 球 蛋 白M（immunoglobin M，IgM）］、ELISA測(cè)定試劑盒（上海信帆生物科技有 限 公 司，批 號(hào)：20171206102、20171205201、20171206103）；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、一氧化氮（Nitric Oxide，NO）生化測(cè)定試劑盒（南京建成生物公司，批號(hào)：20171218、20171214）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）生化測(cè)定試劑盒（蘇州科銘生物，批號(hào)：20171218）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）ELISA測(cè)定試劑盒（上海信帆生物科技有限公司，批號(hào)：20171205125、20171204136）。352型酶標(biāo)儀［芬蘭（Labsystems Multiskan MS）公司］；AC8型洗板機(jī)［芬蘭（Thermo Labsystems）公司］；TG16W型微量高速離心機(jī)（長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）；GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（蘇州柏兆科學(xué)儀器有限公司）；移液器（吉爾森P型移液器公司，型號(hào)：P2、P10、P20、P100、P200、P1000）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試藥制備 當(dāng)歸多糖溶液的配制：分別稱取10、20、40 mg當(dāng)歸多糖，分別溶于100 mL雙蒸水溶解，混勻，配制成低、中、高濃度。4℃冰箱保存，使用前室溫平衡30 min以上。吡格列酮溶液的配制：吡格列酮100 mg，溶入100 mL蒸餾水，于4℃冰箱保存，使用前室溫平衡30 min以上。

1.3.2 造模及分組 選取10只大鼠為空白組（N），其余大鼠以專用的高糖高脂飼料飼養(yǎng)8周，以25 mg/kg STZ在大鼠左下側(cè)腹腔注射，連續(xù)注射1周，尾靜脈采血檢測(cè)大鼠血糖值≥13.9 mmol/L確定模型成功，如未成功的大鼠追加注射1次STZ（12.5 mg/kg）。按照隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組，分為模型組（M）、當(dāng)歸多糖低劑量組（APL）、當(dāng)歸多糖中劑量組（APM）、當(dāng)歸多糖高劑量組（APH），吡格列酮組（P），每組10只。

1.3.3 給藥方法 藥物劑量換算按“人與大鼠體表面積換算方法”進(jìn)行換算給藥。當(dāng)歸多糖低、中、高劑量組以當(dāng)歸多糖溶液灌胃，濃度依次為100、200、400 mg/kg；吡格列酮組以吡格列酮溶液10 mg/kg灌胃；空白組和模型組灌服相同體積的生理鹽水，劑量1 mL/100g。每日1次，連續(xù)灌胃4周。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 GSP、IgA、IgG、IgM、T-AOC、MDA、SOD、GSH-PX、NO水平 末次給藥后，禁食不禁水10 h，心臟負(fù)壓采血，4℃，4000 r/min離心5 min收集血清，分別按照試劑盒說明書中的操作步驟，檢測(cè)血糖指標(biāo)GSP［11］、血清中免疫指標(biāo)IgA、IgG、IgM，氧化指標(biāo)T-AOC、MDA、SOD、GSH-PX、NO水平。

1.4.2 胰島計(jì)數(shù) 大鼠采血后處死，取出胰腺組織，置于液氮罐冷凍固定后放入-80℃儲(chǔ)存。用4%多聚甲醛固定后保存的組織、石蠟包埋固定、切片后，經(jīng)常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察切片胰島的染色情況和形態(tài)及分布情況，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)200倍鏡下進(jìn)行胰島計(jì)數(shù)并拍照。

2 結(jié)果

2.1 糖化血清蛋白模型組大鼠較空白組糖化血清蛋白顯著升高（P＜0.01），經(jīng)藥物干預(yù)后，吡格列酮組及當(dāng)歸多糖各劑量組糖化血清蛋白水平顯著降低（P＜0.01），并且與當(dāng)歸多糖劑量呈負(fù)相關(guān)。見圖1。

圖1 各組大鼠糖化血清蛋白比較

2.2 免疫因子水平大鼠血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM含量，與空白組比較，模型組大鼠血清中3種免疫球蛋白含量均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，當(dāng)歸多糖中、高劑量組大鼠血清中3種免疫球蛋白含量均顯著增加（P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組大鼠血清IgA、IgG、IgM含量比較

2.3 抗氧化因子水平與空白組比較，模型組大鼠血清中T-AOC、SOD活性和GSH含量均有明顯下降，但MDA、NO的含量顯著上升（P＜0.01）。除當(dāng)歸多糖低劑量組SOD活性無明顯變化外（P＞0.05），吡格列酮組與當(dāng)歸多糖高、中劑量組均能明顯增加糖尿病大鼠血清中T-AOC、SOD的活性和GSH含量，并可有效降低MDA、NO含量（P＜0.01）。當(dāng)歸多糖的作用呈現(xiàn)劑量依賴性。見圖3。

圖3 各組大鼠血清中T-AOC、SOD、MDA、GSH和NO含量比較

2.4 胰島計(jì)數(shù)結(jié)果與空白組比較，模型組胰島破壞嚴(yán)重，胰島數(shù)目減少（P＜0.01）；與模型組相比較，比格列酮組和當(dāng)歸多糖各劑量組有新生胰島分布，胰島數(shù)目增加（P＜0.01）；并且當(dāng)歸多糖高劑量組和比格列酮組新生胰島數(shù)目增加明顯（P＜0.01）。新生胰島隨著當(dāng)歸多糖濃度的上升數(shù)目逐漸增加。見圖4。?

圖4 各組大鼠胰島計(jì)數(shù)比較

3 討論

糖尿病患者由于長期高血糖、高血脂及蛋白質(zhì)紊亂造成多系統(tǒng)損傷，如眼、腎、心臟、血管等發(fā)生慢性病變，以至于功能減退甚至衰竭。目前治療糖尿病主要是通過長期服用西藥或注射胰島素來控制血糖［12］。常用的降糖藥物有磺脲類、格列奈類［13］、雙胍類、α-糖苷酶抑制劑［14］、胰島素增敏劑類等藥物。中醫(yī)藥治療該病能兼顧各證，整體性和辨證性尤為突出。尤其近年來植物多糖在糖尿病方面的研究備受關(guān)注，植物多糖是一類由糖苷鍵連接起來的醛糖或酮糖組成的高聚物。因此，本研究采用當(dāng)歸多糖干預(yù)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠，觀察其對(duì)血糖、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化活性的影響。

GSP不受血紅蛋白變異或其他可促進(jìn)紅細(xì)胞更新因素的影響，對(duì)于治療糖尿病療效的評(píng)價(jià)、監(jiān)控具有快速、靈敏、特異的特點(diǎn)［11］。因此，測(cè)定糖化血清蛋白，是治療糖尿病患者血糖水平及用藥監(jiān)測(cè)的一項(xiàng)有意義的指標(biāo)。免疫是機(jī)體對(duì)異己物持是進(jìn)行識(shí)別、排除或消滅，對(duì)人體生理平衡起到維和保護(hù)功能。胰島β細(xì)胞的損傷及胰島素抵抗2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展的主要發(fā)病機(jī)制［15］。免疫球蛋白是機(jī)體體液免疫重要的免疫效應(yīng)分子，在機(jī)體初級(jí)免疫應(yīng)答中，IgG是最持久、最重要的抗體，易透過毛細(xì)血管壁彌散到組織間隙中，發(fā)揮抗感染、中和毒素的作用。IgM是初次體液免疫反應(yīng)最先產(chǎn)生的免疫球蛋白，主要分布于血流中，在早期防御中具有起較強(qiáng)的抗全身感染的作用。在對(duì)2型糖尿病及其并發(fā)癥的研究中發(fā)現(xiàn)，持續(xù)的高血糖、高血脂會(huì)使糖基化蛋白質(zhì)發(fā)生氧化、細(xì)胞漿內(nèi)醛還原反應(yīng)、兒茶酚胺分泌增多與氧化增強(qiáng)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的合成不足等原因致使體內(nèi)氧自由基增高，當(dāng)產(chǎn)生率大于其消除率時(shí)就會(huì)產(chǎn)生氧化損傷。同時(shí)產(chǎn)生的大量活性氧自由基可直接損傷胰島β細(xì)胞，破壞細(xì)胞內(nèi)部線粒體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使胰島β細(xì)胞凋亡，并且大量的活性氧可以影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)β細(xì)胞功能起到間接抑制作用。MDA是活性氧與多不飽和脂肪酸反應(yīng)的產(chǎn)物，能準(zhǔn)確反映機(jī)體受氧化應(yīng)激損傷的程度［16］。拮抗NO是一類重要的活性氧分子，既有神經(jīng)保護(hù)作用，又有神經(jīng)毒性作用。但過高濃度的NO會(huì)使蛋白質(zhì)、核酸遭到破壞，加速細(xì)胞線粒體的損傷，促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡［17-18］。T-AOC的測(cè)定能夠清楚地反映糖尿病患者抗氧化防御能力，并且能更好地反應(yīng)抗氧化劑狀態(tài)。SOD和谷胱甘GSH-PX是機(jī)體維持自由基平衡，間接反映機(jī)體抗氧化損傷和清除氧自由基的能力［19］。

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)歸多糖能顯著降低糖尿病大鼠GSP水平、提高血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM含量，能減緩糖尿病大鼠自身免疫反應(yīng)的程度；增強(qiáng)糖尿病大鼠血清中SOD的活性，增加TAOC、GSH含量；明顯降低MDA、NO的含量。同時(shí)，通過胰島計(jì)數(shù)顯示，當(dāng)歸多糖各劑量組能夠增加糖尿病大鼠新生胰島細(xì)胞。因此從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察，當(dāng)歸多糖能減緩2型糖尿病大鼠自身免疫反應(yīng)程度，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而降低糖化血清蛋白，改善胰島細(xì)胞損傷，對(duì)大鼠胰腺組織有一定的修復(fù)作用。但其作用的一系列信號(hào)通路及作用靶點(diǎn)還需要進(jìn)一步研究證明，以便更好地開發(fā)該藥。