當歸多糖對STZ誘導的糖尿病大鼠糖化血清蛋白、免疫反應及氧化應激的影響?

孟祥云，汪永鋒，郭樹明，楊麗霞，張之弘，王永勝

1甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2甘肅中醫(yī)藥大學；3甘肅省中醫(yī)藥研究院；4張掖市甘州區(qū)人民醫(yī)院急診科

研究顯示［1］，2型糖尿病患者血循環(huán)中糖蛋白、急性期反應物及白細胞計數(shù)均明顯增高；進一步研究發(fā)現(xiàn)，炎性標志物能夠反映和預測2型糖尿病及其代謝綜合征的發(fā)生。2型糖尿病及其并發(fā)癥患者表現(xiàn)出全身性、低度性、慢性的炎癥反應。因此2型糖尿病與免疫、炎癥有著密切的聯(lián)系。同時研究顯示，氧化應激貫穿糖尿病的產(chǎn)生和發(fā)展過程中，起到重要作用［2］。而機體異常免疫應答又能夠產(chǎn)生大量自由基，對胰島β細胞具有極大的破壞作用。

當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels屬傘形科植物，以干燥根入藥，有補血、和血，調經(jīng)止血，潤腸滑腸作用［3］?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，當歸中含有多種成分，主要包括揮發(fā)油、有機酸、多糖以及黃酮類化合物，具有廣泛的生物活性，如調節(jié)免疫、保護肝臟［4］、抗動脈粥樣硬化［5］、抗腫瘤［6］、抗炎鎮(zhèn)痛［7-8］等。研究發(fā)現(xiàn)，當歸多糖（angelica polysaccharides，AP）能夠有效降低血糖，調節(jié)脂代謝［9-10］。本研究通過鏈脲霉素（strep-tozotocin，STZ）誘導建立2型糖尿病大鼠模型，觀察當歸多糖在2型糖尿病中糖化血清蛋白（glycated serum protein，GSP）、免疫反應及抗氧化的活性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠60只，體質量（200±20）g，購自甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心，實驗動物許可證號：SCXK（甘）2015-0002，實驗單位使用許可證號：SYXK（甘）2015-0005。飼養(yǎng)條件：大鼠飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗室，溫度18～26℃，相對濕度40%～70%，普通飼料適應性喂養(yǎng)1周。

1.2 試藥及儀器當歸多糖（純度98%，陜西慈緣生物技術有限公司提取，批號：CY170321）；吡格列酮片（廣東華南藥業(yè)集團有限公司，批號：H44025019，規(guī)格：30 mg/片）；鏈脲佐菌素（SIGM公司，批號：51254975，規(guī)格：5 mg/瓶）；生理鹽水（華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司，批號：H11021635，規(guī)格：250 mL/瓶），用蒸餾水稀釋濃度為0.7 mg/mL的注射液，保存條件要避光；糖化血清蛋白ELISA測定試劑盒（上海信帆生物科技有限公司，批號：20171204341）；免疫球蛋白免疫球蛋白A［（immunoglobulin A，IgA）、免疫球蛋白G（immunoglobin G，IgG）、免 疫 球 蛋 白M（immunoglobin M，IgM）］、ELISA測定試劑盒（上海信帆生物科技有 限 公 司，批 號：20171206102、20171205201、20171206103）；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、一氧化氮（Nitric Oxide，NO）生化測定試劑盒（南京建成生物公司，批號：20171218、20171214）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）生化測定試劑盒（蘇州科銘生物，批號：20171218）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）ELISA測定試劑盒（上海信帆生物科技有限公司，批號：20171205125、20171204136）。352型酶標儀［芬蘭（Labsystems Multiskan MS）公司］；AC8型洗板機［芬蘭（Thermo Labsystems）公司］；TG16W型微量高速離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（蘇州柏兆科學儀器有限公司）；移液器（吉爾森P型移液器公司，型號：P2、P10、P20、P100、P200、P1000）。

1.3 實驗方法

1.3.1 試藥制備 當歸多糖溶液的配制：分別稱取10、20、40 mg當歸多糖，分別溶于100 mL雙蒸水溶解，混勻，配制成低、中、高濃度。4℃冰箱保存，使用前室溫平衡30 min以上。吡格列酮溶液的配制：吡格列酮100 mg，溶入100 mL蒸餾水，于4℃冰箱保存，使用前室溫平衡30 min以上。

1.3.2 造模及分組 選取10只大鼠為空白組（N），其余大鼠以專用的高糖高脂飼料飼養(yǎng)8周，以25 mg/kg STZ在大鼠左下側腹腔注射，連續(xù)注射1周，尾靜脈采血檢測大鼠血糖值≥13.9 mmol/L確定模型成功，如未成功的大鼠追加注射1次STZ（12.5 mg/kg）。按照隨機數(shù)字表法進行分組，分為模型組（M）、當歸多糖低劑量組（APL）、當歸多糖中劑量組（APM）、當歸多糖高劑量組（APH），吡格列酮組（P），每組10只。

1.3.3 給藥方法 藥物劑量換算按“人與大鼠體表面積換算方法”進行換算給藥。當歸多糖低、中、高劑量組以當歸多糖溶液灌胃，濃度依次為100、200、400 mg/kg；吡格列酮組以吡格列酮溶液10 mg/kg灌胃；空白組和模型組灌服相同體積的生理鹽水，劑量1 mL/100g。每日1次，連續(xù)灌胃4周。

1.4 指標檢測

1.4.1 GSP、IgA、IgG、IgM、T-AOC、MDA、SOD、GSH-PX、NO水平 末次給藥后，禁食不禁水10 h，心臟負壓采血，4℃，4000 r/min離心5 min收集血清，分別按照試劑盒說明書中的操作步驟，檢測血糖指標GSP［11］、血清中免疫指標IgA、IgG、IgM，氧化指標T-AOC、MDA、SOD、GSH-PX、NO水平。

1.4.2 胰島計數(shù) 大鼠采血后處死，取出胰腺組織，置于液氮罐冷凍固定后放入-80℃儲存。用4%多聚甲醛固定后保存的組織、石蠟包埋固定、切片后，經(jīng)常規(guī)HE染色，光學顯微鏡下觀察切片胰島的染色情況和形態(tài)及分布情況，每張切片隨機選取5個200倍鏡下進行胰島計數(shù)并拍照。

2 結果

2.1 糖化血清蛋白模型組大鼠較空白組糖化血清蛋白顯著升高（P＜0.01），經(jīng)藥物干預后，吡格列酮組及當歸多糖各劑量組糖化血清蛋白水平顯著降低（P＜0.01），并且與當歸多糖劑量呈負相關。見圖1。

圖1 各組大鼠糖化血清蛋白比較

2.2 免疫因子水平大鼠血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM含量，與空白組比較，模型組大鼠血清中3種免疫球蛋白含量均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，當歸多糖中、高劑量組大鼠血清中3種免疫球蛋白含量均顯著增加（P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組大鼠血清IgA、IgG、IgM含量比較

2.3 抗氧化因子水平與空白組比較，模型組大鼠血清中T-AOC、SOD活性和GSH含量均有明顯下降，但MDA、NO的含量顯著上升（P＜0.01）。除當歸多糖低劑量組SOD活性無明顯變化外（P＞0.05），吡格列酮組與當歸多糖高、中劑量組均能明顯增加糖尿病大鼠血清中T-AOC、SOD的活性和GSH含量，并可有效降低MDA、NO含量（P＜0.01）。當歸多糖的作用呈現(xiàn)劑量依賴性。見圖3。

圖3 各組大鼠血清中T-AOC、SOD、MDA、GSH和NO含量比較

2.4 胰島計數(shù)結果與空白組比較，模型組胰島破壞嚴重，胰島數(shù)目減少（P＜0.01）；與模型組相比較，比格列酮組和當歸多糖各劑量組有新生胰島分布，胰島數(shù)目增加（P＜0.01）；并且當歸多糖高劑量組和比格列酮組新生胰島數(shù)目增加明顯（P＜0.01）。新生胰島隨著當歸多糖濃度的上升數(shù)目逐漸增加。見圖4。?

圖4 各組大鼠胰島計數(shù)比較

3 討論

糖尿病患者由于長期高血糖、高血脂及蛋白質紊亂造成多系統(tǒng)損傷，如眼、腎、心臟、血管等發(fā)生慢性病變，以至于功能減退甚至衰竭。目前治療糖尿病主要是通過長期服用西藥或注射胰島素來控制血糖［12］。常用的降糖藥物有磺脲類、格列奈類［13］、雙胍類、α-糖苷酶抑制劑［14］、胰島素增敏劑類等藥物。中醫(yī)藥治療該病能兼顧各證，整體性和辨證性尤為突出。尤其近年來植物多糖在糖尿病方面的研究備受關注，植物多糖是一類由糖苷鍵連接起來的醛糖或酮糖組成的高聚物。因此，本研究采用當歸多糖干預STZ誘導的糖尿病大鼠，觀察其對血糖、免疫調節(jié)及抗氧化活性的影響。

GSP不受血紅蛋白變異或其他可促進紅細胞更新因素的影響，對于治療糖尿病療效的評價、監(jiān)控具有快速、靈敏、特異的特點［11］。因此，測定糖化血清蛋白，是治療糖尿病患者血糖水平及用藥監(jiān)測的一項有意義的指標。免疫是機體對異己物持是進行識別、排除或消滅，對人體生理平衡起到維和保護功能。胰島β細胞的損傷及胰島素抵抗2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展的主要發(fā)病機制［15］。免疫球蛋白是機體體液免疫重要的免疫效應分子，在機體初級免疫應答中，IgG是最持久、最重要的抗體，易透過毛細血管壁彌散到組織間隙中，發(fā)揮抗感染、中和毒素的作用。IgM是初次體液免疫反應最先產(chǎn)生的免疫球蛋白，主要分布于血流中，在早期防御中具有起較強的抗全身感染的作用。在對2型糖尿病及其并發(fā)癥的研究中發(fā)現(xiàn)，持續(xù)的高血糖、高血脂會使糖基化蛋白質發(fā)生氧化、細胞漿內醛還原反應、兒茶酚胺分泌增多與氧化增強、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的合成不足等原因致使體內氧自由基增高，當產(chǎn)生率大于其消除率時就會產(chǎn)生氧化損傷。同時產(chǎn)生的大量活性氧自由基可直接損傷胰島β細胞，破壞細胞內部線粒體結構，進而使胰島β細胞凋亡，并且大量的活性氧可以影響胰島素信號轉導通路，對β細胞功能起到間接抑制作用。MDA是活性氧與多不飽和脂肪酸反應的產(chǎn)物，能準確反映機體受氧化應激損傷的程度［16］。拮抗NO是一類重要的活性氧分子，既有神經(jīng)保護作用，又有神經(jīng)毒性作用。但過高濃度的NO會使蛋白質、核酸遭到破壞，加速細胞線粒體的損傷，促進細胞調亡［17-18］。T-AOC的測定能夠清楚地反映糖尿病患者抗氧化防御能力，并且能更好地反應抗氧化劑狀態(tài)。SOD和谷胱甘GSH-PX是機體維持自由基平衡，間接反映機體抗氧化損傷和清除氧自由基的能力［19］。

本研究結果顯示，當歸多糖能顯著降低糖尿病大鼠GSP水平、提高血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM含量，能減緩糖尿病大鼠自身免疫反應的程度；增強糖尿病大鼠血清中SOD的活性，增加TAOC、GSH含量；明顯降低MDA、NO的含量。同時，通過胰島計數(shù)顯示，當歸多糖各劑量組能夠增加糖尿病大鼠新生胰島細胞。因此從本次實驗結果觀察，當歸多糖能減緩2型糖尿病大鼠自身免疫反應程度，緩解氧化應激反應，從而降低糖化血清蛋白，改善胰島細胞損傷，對大鼠胰腺組織有一定的修復作用。但其作用的一系列信號通路及作用靶點還需要進一步研究證明，以便更好地開發(fā)該藥。