高血壓病氣虛血瘀證患者血清對CRL-1730線粒體細(xì)胞色素C凋亡途徑的影響?

胡小勤，蒙 丹，付 蓉，郝二偉，2，段慧明，曾學(xué)文，3△

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530022；2廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實驗室；3金華高等研究院

高血壓病是臨床常見的一種心血管疾?。?］，氣虛血瘀證是高血壓病的常見中醫(yī)證型［2］，高血壓?。?］及氣虛血瘀證［4］的形成都與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷存在密切的關(guān)系，也都具有細(xì)胞凋亡的病理生理學(xué)特征。在前期研究中，采用流式細(xì)胞儀檢測了高血壓病氣虛血瘀證患者的血清作用于內(nèi)皮細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)高血壓病氣虛血瘀證組細(xì)胞凋亡率明顯升高；并發(fā)現(xiàn)透射電鏡下細(xì)胞線粒體腫脹或空泡變，管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)碎裂，嵴消失，證實了高血壓病氣虛血瘀證患者血清可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［5］，但誘導(dǎo)凋亡的具體機(jī)制尚不明確。有研究表明［6］，線粒體在細(xì)胞凋亡中起著中心調(diào)控作用，細(xì)胞色素C（cytochrome-c，Cyt-C）是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中不可缺少的重要因子，在凋亡過程中起著關(guān)鍵作用。線粒體Cyt-C途徑主要由Bcl-2、Bax、Cyt-C、Apaf-1、Caspase-9、Caspase-3等分子組成［7］。本實驗以體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株（CRL-1730）為觀察對象，主要觀察高血壓病氣虛血瘀證患者的血清對內(nèi)皮細(xì)胞線粒體Cyt-C途徑的影響，進(jìn)一步闡明高血壓病氣虛血瘀證患者血清誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-1730，由復(fù)旦生物醫(yī)學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供，批號：CP-H082。

1.2 實驗動物60只SPF級SD大鼠，雌雄各30只，體質(zhì)量180～210 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2014-0002。飼養(yǎng)條件：大鼠每天喂養(yǎng)一次飼料，兩天更換一次墊料與水。

1.3 實驗試劑胎牛血清（fetal bovine serum，WS500T）、青霉素（penicillin，I9532-10MG）、鏈霉素（streptomycin，批 號：57-92-1）；高 糖DMEM（Gibco，批號：PM150210）；0.25%胰酶-0.02%EDTA（北京索萊寶，批號：03-050-1A/B）；一抗Cyt-C（Sant Cruz，YT154）、Apaf-1（Sant Cruz，EK-R38301）、Caspase-9（Sant Cruz，批號：BS6444）；二抗Cy-3羊抗鼠（Abgree，批號：BHR102）；正常熔點(diǎn)瓊脂糖（normal melting point agarose，NMA）、低熔點(diǎn)瓊脂糖（low melting point agarose，LMA）（TAKARA，批號：6132-04-3）；Cyt-C、Apaf-1、Caspase-9引物（上?？党缮锟萍加邢薰?，批號：HZ-2654）；溴化乙錠（ethidium bromide，EB）（Sigma，批號：1239-45-8）；三（羥甲基）胺基甲烷［tris（hydroxymethyl）amine methane，Tris］（南京凱基，批號：KGF019-1）；RIPA組織細(xì)胞快速裂解液（Boster，批號：08J15B02）；乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediamine tetraacetic acid disodium，Na2EDTA）（上海前尖生物科技有限公司，批號：13254-36-4）。

1.4 實驗儀器1000 μL移液器（Eppendorf公司）；TGL型臺式低溫離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）；DYY-6C型電泳儀水平、XCell SureLock Mini-Cell型電泳槽（美國BIO-RAD公司）；MA-688型實時熒光定量PCR儀（Thermo Fisher Scientific公司）。

1.5 實驗方法

1.5.1 臨床資料 選擇2016年7月至2017年1月在廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院心血管內(nèi)科就診的高血壓?。?］患者80例，分為高血壓氣虛血瘀證［9-10］組和高血壓非氣虛血瘀證組，每組40例；健康體檢者20例為健康對照組。3組基線資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.5.2 人血清采集 空腹?fàn)顟B(tài)下，取每人外周血約8 mL，放入帶帽無菌不抗凝試管，自凝后，以4℃，離心半徑10 cm，3000 r/min離心15 min，取上清液置于無菌EP管，混合均勻，滅活，過濾除菌，置于-80℃，備用。每組血清混合后用于細(xì)胞學(xué)實驗。

1.5.3 動物分組及處理1）將60只SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組（30只）和補(bǔ)陽還五湯高、中、低劑量組（各10只）。2）補(bǔ)陽還五湯原方劑量進(jìn)行水煎提?。ㄉS芪120 g，當(dāng)歸尾6 g，赤芍5 g，地龍3 g，川芎3 g，紅花3 g，桃仁3 g）。按照體表面積換算用藥量，補(bǔ)陽還五湯高、中、低劑量組大鼠分別用等效劑量的24、12、6 g/（kg·d）灌胃，每日2次，兩次間隔12 h，連續(xù)3天?？瞻讓φ战M以等體積的生理鹽水灌胃。

1.5.4 動物血清采集1）含藥血清：于末次灌胃1 h后頸動脈放血，自凝后以4℃，離心半徑10 cm，3000 r/min離心15 min，取上清，將同組血清混合，放入無菌EP管，混勻，滅活，過濾除菌，-80℃凍存?zhèn)溆谩?）空白血清：空白對照組以同法取血清。

1.5.5 混合血清培養(yǎng)液制備 各組混合血清培養(yǎng)液制備：高血壓病氣虛血瘀證組、高血壓病非氣虛血瘀證組、健康對照組分別以各組10%血清+10%空白血清+80%的高糖DMEM培養(yǎng)基，補(bǔ)陽還五湯各劑量組分別以10%補(bǔ)陽還五湯高、中、低劑量含藥血清+10%高血壓病氣虛血瘀證患者血清+80%高糖DMEM培養(yǎng)基。

1.5.6 細(xì)胞培養(yǎng) 取對數(shù)生長期內(nèi)皮細(xì)胞，消化、傳代后，按1×105/mL密度，接種于25 mL培養(yǎng)瓶，4 mL/瓶，每組6瓶，共36瓶，每2瓶為一個樣品。先用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，在再換無血清培養(yǎng)液同步化以后，分為6組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 激光共聚焦顯微鏡檢測內(nèi)皮細(xì)胞Cyt-C蛋白的表達(dá)和分布 取生長良好的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對數(shù)生長期細(xì)胞，消化、傳代，以3×105/mL接種于6孔板，按上述實驗分組分為6組，每組設(shè)置6個復(fù)孔，每孔2 mL的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，換無血培養(yǎng)液使細(xì)胞同步化24 h，再用混合血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。再進(jìn)行以下操作：棄細(xì)胞上清液；PBS洗2次；每孔加入4%多聚甲醛，室溫固定細(xì)胞，10 min；PBS洗5 min，3次；TritonX-100（0.3%）通透細(xì)胞，20 min；PBS洗5 min，3次；每孔加2%BSA封閉液，37℃30 min；加一抗：4℃孵育過夜；PBS洗5 min，3次；加二抗：37℃避光孵育60 min；PBS洗5 min，3次；甘油：PBS=1∶1封片，避光，上機(jī)檢測。

1.6.2 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測內(nèi)皮細(xì)胞Cyt-C、Apaf-1、Caspase-9蛋白的表達(dá) 細(xì)胞接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，按上述分組和處理，隨機(jī)分為6組，每組3瓶。棄培養(yǎng)液，冰上裂解10 min（裂解液∶NaF∶PMSF=100∶5∶1）；細(xì)胞刮離并收集細(xì)胞；4℃，離心半徑10 cm，12 000 r/min離心15 min，多功能酶標(biāo)儀測定總蛋白含量，調(diào)整上樣孔濃度為80 μg進(jìn)行電泳。電泳完備后轉(zhuǎn)膜；50 g/L脫脂牛奶封閉1 h；各蛋白單抗和β-actin 4℃孵育過夜；5 g/L TritonX-100洗 膜3次；IRDyeTM 800標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（1∶2000）孵育2 h；1 g/L Tween-20洗膜3次；Odyssey雙紅外成像系統(tǒng)掃描成像，即可獲得結(jié)果圖像。各蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值相比作為各蛋白相對表達(dá)量。

1.6.3 酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測內(nèi)皮細(xì)胞Cyt-C、Apaf-1、Caspase-9細(xì)胞培養(yǎng)上清液蛋白的含量 取生長良好的對數(shù)生長期CRL-1730，消化、傳代以1×105/mL種24孔板，共分6組，每組設(shè)置6孔，每孔各500 uL的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，換無血培養(yǎng)液使細(xì)胞同步化24 h，最后再用混合血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，再換無血培養(yǎng)液使細(xì)胞同步化24 h，然后取細(xì)胞培養(yǎng)上清液于4℃，離心半徑10 cm，1000 r/min離心15 min，取上清液，凍存待測。按ELISA試劑盒說明檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液蛋白含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 激光共聚焦顯微鏡檢測內(nèi)皮細(xì)胞Cyt-C蛋白表達(dá)和分布情況高血壓病氣虛血瘀證組及高血壓病非氣虛血瘀證組與健康組比較，Cyt-C的表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）；補(bǔ)陽還五湯各劑量組明與高血壓病氣虛血瘀證組比較，Cyt-C的表達(dá)顯降低（P＜0.01或P＜0.05）。見圖1、表1。

表1 激光共聚焦顯微鏡下各組內(nèi)皮細(xì)胞Cyt-C蛋白表達(dá)比較（±s）

表1 激光共聚焦顯微鏡下各組內(nèi)皮細(xì)胞Cyt-C蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與健康對照組比較，*表示P＜0.01；與高血壓病非氣虛血瘀證組比較，△表示P＜0.05；與高血壓病氣虛血瘀證組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01

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圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察各組Cyt-C的分布（×400）

2.2 Western Blot檢測內(nèi)皮細(xì)胞Cyt-C、Apaf-1、Caspase-9相關(guān)蛋白表達(dá)高血壓病氣虛血瘀證組及高血壓病非氣虛血瘀證組與健康組比較，Cyt-C、Apaf-1、Caspase-9的表達(dá)均明顯升高（P＜0.01或P＜0.05）；補(bǔ)陽還五湯各劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組比較，Cyt-C、Apaf-1、Cas-pase-9的表達(dá)明顯下降（P＜0.01或P＜0.05）。見表2、圖2。

表2 Western Blot檢測各組內(nèi)皮細(xì)胞Cyt-C、Apaf-1、Caspase9蛋白表達(dá)量比較（±s）

表2 Western Blot檢測各組內(nèi)皮細(xì)胞Cyt-C、Apaf-1、Caspase9蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與健康對照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與高血壓病非氣虛血瘀證組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；與高血壓病氣虛血瘀證組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01

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2.3 ELISA檢測內(nèi)皮細(xì)胞Cyt-C、Apaf-1、Caspase-9細(xì)胞培養(yǎng)上清液中蛋白表達(dá)高血壓病氣虛血瘀證組及高血壓病非氣虛血瘀證組與健康組比較，Cas-pase-9、Apaf-1、Cyt-C表達(dá)均明顯升高（P＜0.01或P＜0.05）；高血壓病氣虛血瘀證組與高血壓病非氣虛血瘀證組比較，表達(dá)明顯升高（P＜0.01或P＜0.05）；補(bǔ)陽還五湯各劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組比較，表達(dá)明顯降低 （P＜0.01或P＜0.05）。見表3。??

表3 ELISA檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Cyt-C、Apaf-1、Caspase9蛋白含量比較（±s）

表3 ELISA檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Cyt-C、Apaf-1、Caspase9蛋白含量比較（±s）

注：與健康對照組比較，*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；與高血壓病非氣虛血瘀證組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；與高血壓病氣虛血瘀證組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01

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3 討論

細(xì)胞凋亡通過細(xì)胞內(nèi)的遺傳機(jī)制使細(xì)胞走向死亡，最終整個細(xì)胞的成分被消化降解［11］。經(jīng)典的細(xì)胞凋亡途徑有兩條，分別為細(xì)胞表面死亡受體途徑（或稱細(xì)胞外途徑）和線粒體引發(fā)途徑（或稱細(xì)胞內(nèi)途徑）［12］。

在細(xì)胞凋亡過程中，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）過度開放，線粒體跨膜電位降低，導(dǎo)致一些相關(guān)的促凋亡因子，如細(xì)胞色素C（Cytochrome C）、凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）等從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中［13］。目前，Cyt-C和Caspase-9是線粒體凋亡信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子已得到證實［14］。實驗研究表明，Cyt-C不僅可以直接介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還可以通過干擾呼吸鏈電子傳遞的運(yùn)輸、促進(jìn)活性氧自由基的產(chǎn)生、阻斷能量合成等方式間接參與細(xì)胞凋亡過程［15-16］，確定細(xì)胞色素C是線粒體啟動凋亡程序的關(guān)鍵物質(zhì)［17］。此外，以Caspase-9為核心的線粒體凋亡途徑是WNT通路下游的一個凋亡通路，Caspase-9是線粒體凋亡信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子也已得到證實［14］。

凋亡蛋白酶活化因子1（apoptosis protease activating factor-1，Apaf-1）是細(xì)胞質(zhì)中的一種蛋白質(zhì)，其氨基端有半胱氨酸蛋白酶募集域，可促進(jìn)多個Caspase家族成員前體活化［18］。有研究表明，細(xì)胞線粒體中的細(xì)胞色素C通過線粒體外膜，大量釋放到胞液中，與Apaf-1在ATP作用下促使Apaf-1激活，活化的Apaf-1依次激活Caspase-9和Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生［19］。說明Apaf-1是線粒體凋亡信號通路中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

目前，對Cyt-C釋放后作用的機(jī)制已經(jīng)較為清楚［20］，線粒體釋放Cyt-C分兩步，即先從呼吸鏈上游離出來，而后才被釋放入胞漿。入胞漿的Cyt-C與Apaf-1羧基端的WD重復(fù)序列結(jié)合，誘導(dǎo)Apaf-1變構(gòu)并進(jìn)一步結(jié)合Caspase-9前體，使Caspase-9復(fù)合體自發(fā)激活。Cyt-C、Apaf-1與Caspase-9復(fù)合物就是凋亡體，凋亡體繼續(xù)激活下游的Caspase-3，引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致凋亡。

實驗結(jié)果表明，與健康組比較，高血壓病氣虛血瘀證組及高血壓病非氣虛血瘀證組Cyt-C、Apaf-1、Caspase-9蛋白表達(dá)均明顯升高；與高血壓氣虛血瘀證組比較，補(bǔ)陽還五湯各劑量組Cyt-C、Apaf-1、Caspase-9蛋白表達(dá)明顯降低。

結(jié)合前期實驗結(jié)果及本次的實驗結(jié)果，我們認(rèn)為：高血壓病氣虛血瘀證患者血清存在細(xì)胞凋亡，且凋亡過程中Caspase-3、Bax、Cyt-C、Apaf-1、Caspase-9的表達(dá)量均升高。說明高血壓病氣虛血瘀證患者血清誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)理與線粒體Cyt-C途徑密切相關(guān)。本課題對凋亡機(jī)制的研究現(xiàn)停留在蛋白層次，下一步擬從mRNA及非編碼RNA層次開展研究。