Tn5轉(zhuǎn)座子及其在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用

高暢,任鵬程,李明格,呂赫喆,胡儀

(1. 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100875;2. 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所,北京 100101)

1 Tn5轉(zhuǎn)座子及轉(zhuǎn)座機(jī)制

1.1 Tn5轉(zhuǎn)座子

Tn5是一種復(fù)合型轉(zhuǎn)座子,其中心序列可表達(dá)3種抗生素(kanr、strr、bleor),兩側(cè)為高度同源的倒置序列IS50R和IS50L[1](圖1A)。IS50R可以表達(dá)產(chǎn)生轉(zhuǎn)座酶(transposase,Tnp)和抑制轉(zhuǎn)座酶活性的抑制蛋白(inhibitor,Inh),IS50L表達(dá)產(chǎn)生兩個(gè)非活性蛋白[2-3]。每個(gè)IS50序列都位于兩個(gè)19 bp的倒置末端(外末端outside end,OE和內(nèi)末端inside end,IE)之間。倒置末端為轉(zhuǎn)座酶的作用位點(diǎn),但OE和IE在序列上略有不同[1,4]。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)座的發(fā)生只需其中的關(guān)鍵成分,即轉(zhuǎn)座酶和兩個(gè)19 bp的倒置末端,內(nèi)部可以包含任何足夠長(zhǎng)的DNA片段(圖1B)。并且,這兩個(gè)19 bp的末端可以是倒置的OE和IE、兩個(gè)OE、兩個(gè)IE,也可以是兩個(gè)馬賽克末端(mosaic end,ME)。實(shí)際上,ME是一種人工構(gòu)建的末端,其序列與OE存在3個(gè)堿基對(duì)的不同,且具有比OE和IE更高的轉(zhuǎn)座速率[5]。

圖1 Tn5轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)Note. A. Traditional transposon Tn5. It contains two inverted versions of IS50 (IS50L and IS50R) bracketing three antibiotic resistance genes (kanr, strr, bleor), and the IS50 elements are defined by the outside end (OE) and inside end (IE). IS50L encodes two inactive proteins, while IS50R encodes transposase (Tnp) and an inhibitor of transposition (Inh). B. Simplified transposon Tn5. Two outside ends (OE) or other ends (IE, ME) brackets sufficient DNA.Figure 1 Structure of transposon Tn5

1.2 轉(zhuǎn)座酶結(jié)構(gòu)

由IS50R編碼的Tn5轉(zhuǎn)座酶可以分成3個(gè)結(jié)構(gòu)域:與轉(zhuǎn)座子末端DNA結(jié)合的N端結(jié)構(gòu)域、具有催化活性的中部結(jié)構(gòu)域和負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)結(jié)合的C端結(jié)構(gòu)域。N端結(jié)構(gòu)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)僅包含α-螺旋和轉(zhuǎn)角,用于與轉(zhuǎn)座子末端序列的識(shí)別和結(jié)合;C端結(jié)構(gòu)域也僅有α-螺旋和轉(zhuǎn)角,可以與轉(zhuǎn)座酶結(jié)合促進(jìn)轉(zhuǎn)座過(guò)程,也可以同Inh結(jié)合形成二聚體抑制轉(zhuǎn)座[6]。而轉(zhuǎn)座酶的活性位點(diǎn)則位于由約300個(gè)氨基酸殘基組成的中部結(jié)構(gòu)域內(nèi),該結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有一個(gè)“核酸酶類(lèi)H模體”起催化作用,且該模體在所有轉(zhuǎn)座酶和逆轉(zhuǎn)錄病毒整合酶中都起類(lèi)似的作用[6-8]。Tn5轉(zhuǎn)座酶的“核酸酶類(lèi)H模體”活性中心內(nèi)有D97、D188、E326作為保守的氨基酸殘基組成DDE模體,對(duì)轉(zhuǎn)座酶的活性有至關(guān)重要的作用。該DDE模體與兩個(gè)Mn2+結(jié)合,兩個(gè)Mn2+分別與OE末端的3’-OH和5’-P配位作為催化活性中心[6]。此外,在DDE模體的谷氨酸殘基后還存在一對(duì)保守的賴(lài)氨酸殘基(E×××K××K),其中,第二個(gè)賴(lài)氨酸殘基與Y319、R322及DDE模體中的E326組成了高度保守的YREK模體,該模體使得非轉(zhuǎn)移鏈的5’-P發(fā)生位移,為靶DNA的結(jié)合留下了空間[9]。

1.3 Tn5轉(zhuǎn)座機(jī)制

Tn5轉(zhuǎn)座需要多個(gè)步驟,主要包括轉(zhuǎn)座酶二聚體的形成、供體DNA的切割、靶DNA的捕獲與鏈轉(zhuǎn)移、鏈轉(zhuǎn)移復(fù)合物的脫離4個(gè)步驟(見(jiàn)圖2)。首先,在緩沖液中加入Mg2+,兩個(gè)轉(zhuǎn)座酶分子的N端26~65位氨基酸殘基及活性中心的幾個(gè)氨基酸殘基與Tn5轉(zhuǎn)座子末端序列特異性結(jié)合,構(gòu)成兩個(gè)轉(zhuǎn)座酶-DNA復(fù)合體[6,10]。緊接著,這兩個(gè)復(fù)合體利用轉(zhuǎn)座酶C端α螺旋交叉,發(fā)生剪刀狀二聚化,形成一個(gè)轉(zhuǎn)座酶二聚體[6-7]。在形成轉(zhuǎn)座酶二聚體后,轉(zhuǎn)座酶啟動(dòng)DNA的切割,并且,一側(cè)的轉(zhuǎn)座酶催化另一側(cè)末端的反應(yīng),呈現(xiàn)出交叉作用的現(xiàn)象[11]。整個(gè)催化反應(yīng)大致包括3個(gè)步驟:首先,轉(zhuǎn)座酶活化的水分子與DNA鏈反應(yīng),使OE末端暴露出游離的3’-OH;其在接下來(lái)的反應(yīng)中與互補(bǔ)鏈形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),使轉(zhuǎn)座子DNA從供體DNA骨架中脫離;最后,另一活化的水分子將該發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi),釋放出3’-OH為鏈轉(zhuǎn)移做準(zhǔn)備[12]。在整個(gè)催化反應(yīng)完成后,轉(zhuǎn)座酶二聚體捕獲靶DNA并進(jìn)行鏈轉(zhuǎn)移。許多研究表明,Tn5的鏈轉(zhuǎn)移插入位點(diǎn)在大范圍內(nèi)是隨機(jī)的,但是仍然存在優(yōu)選的9 bp插入位點(diǎn)[13]。并且,研究者們發(fā)現(xiàn)了非轉(zhuǎn)移鏈的5’-P會(huì)導(dǎo)致5’末端在空間上的運(yùn)動(dòng),進(jìn)而使得DNA構(gòu)象發(fā)生改變,更易于與靶DNA結(jié)合,并將3’-OH暴露在一個(gè)空腔中使其更易發(fā)生鏈轉(zhuǎn)移[9]。當(dāng)轉(zhuǎn)座酶二聚體與靶DNA結(jié)合后,轉(zhuǎn)座子DNA的3’-OH分別在9 bp靶位點(diǎn)兩側(cè)進(jìn)行親核攻擊完成鏈轉(zhuǎn)移,并在轉(zhuǎn)座子兩端各形成一個(gè)9 bp的粘性末端。據(jù)推測(cè),在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)鏈轉(zhuǎn)移后,鏈轉(zhuǎn)移復(fù)合物可能被宿主的某些功能釋放,隨后兩個(gè)粘性末端被補(bǔ)平,形成9 bp的正向重復(fù)序列。而在體外時(shí),Tn5鏈轉(zhuǎn)移復(fù)合物十分穩(wěn)定[14]。

圖2 Tn5的轉(zhuǎn)座機(jī)制Note. Mechanism of Tn5 transposition. Two Tn5 transposases bind to the OEs and then dimerize forming the synaptic complex. Then, Nucleophilic reactions occur resulting in cleavage of transposon-donor DNA bonds. Finally, the synaptic complex captures the target DNA and strand transfer occurs.Figure 2 Mechanism of Tn5 transposition

2 Tn5建庫(kù)方法

自人類(lèi)基因組計(jì)劃以來(lái),DNA測(cè)序技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的研究不斷深入。二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使大規(guī)模并行DNA測(cè)序成為可能[15]。二代測(cè)序技術(shù)的流程步驟主要包括樣品提取、文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序及最后的數(shù)據(jù)處理與分析。其中,文庫(kù)構(gòu)建在很大程度上直接影響到數(shù)據(jù)分析的結(jié)果,是整個(gè)技術(shù)的核心。傳統(tǒng)的文庫(kù)構(gòu)建流程通常包括DNA片段化(機(jī)械法或酶促法)、末端補(bǔ)齊、測(cè)序接頭的連接和PCR擴(kuò)增,在RNA-seq中還需要首先合成cDNA文庫(kù)。盡管barcode接頭的連接可以同時(shí)分析多個(gè)樣本,但是對(duì)于開(kāi)發(fā)一種樣本起始量低、實(shí)驗(yàn)周期短、成本低的文庫(kù)構(gòu)建方法的需求越來(lái)越強(qiáng)烈[16]。

基于Tn5轉(zhuǎn)座酶的文庫(kù)構(gòu)建方法大大縮減了傳統(tǒng)方案中文庫(kù)構(gòu)建的步驟、時(shí)間和成本。在此方法中,Tn5轉(zhuǎn)座酶的高活性衍生物的運(yùn)用可以在短時(shí)間內(nèi)將轉(zhuǎn)座序列插入靶DNA中,直接引發(fā)雙鏈DNA的片段化,同時(shí)將接頭序列加至片段的兩端[17]。其流程大致為,首先將測(cè)序接頭和OE序列整合為包被接頭,與轉(zhuǎn)座酶在體外孵育,形成結(jié)合了DNA的轉(zhuǎn)座酶二聚體;隨后該復(fù)合體與待測(cè)序DNA共孵育并將其打斷,形成可測(cè)序的DNA片段;最后加入酶將復(fù)合體插入時(shí)產(chǎn)生的切口補(bǔ)平,并通過(guò)PCR擴(kuò)增完成文庫(kù)的構(gòu)建。此外,在PCR擴(kuò)增時(shí)還可以引入barcode以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模并行的DNA測(cè)序。

但是PCR擴(kuò)增易產(chǎn)生擴(kuò)增偏差和錯(cuò)誤[18],這在細(xì)胞異質(zhì)性研究的單細(xì)胞測(cè)序中是極為不利的。因此,一種利用Tn5轉(zhuǎn)座子插入啟動(dòng)子進(jìn)行線(xiàn)性擴(kuò)增的方法(linear amplification via transposon insertion,LIANTI)應(yīng)運(yùn)而生。該方法利用Tn5轉(zhuǎn)座子將單細(xì)胞基因組DNA隨機(jī)打斷,同時(shí)在每個(gè)片段上添加T7啟動(dòng)子,再用DNA聚合酶補(bǔ)齊片段兩端的單鏈T7啟動(dòng)子,最后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。隨后,再通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄、RNA酶消化、cDNA二鏈的合成,最終形成LIANTI文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序[18]。并且,若在LIANTI轉(zhuǎn)座子和引物中添加組合barcode,也可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的高通量測(cè)序。此外,雖然Tn5偏好于包含鳥(niǎo)苷(G)和胞苷(C)的插入序列,導(dǎo)致插入間隔不夠均勻,進(jìn)而導(dǎo)致測(cè)序時(shí)的覆蓋范圍不夠均勻,但是Tn5轉(zhuǎn)座酶突變體Tn5-059可以有效解決這個(gè)問(wèn)題[19]。同時(shí),多種高活性Tn5轉(zhuǎn)座酶的高效生產(chǎn)進(jìn)一步降低了文庫(kù)構(gòu)建的時(shí)間和成本[20-22]。這些優(yōu)勢(shì)都使Tn5轉(zhuǎn)座酶在建庫(kù)領(lǐng)域備受青睞。

3 Tn5建庫(kù)在表觀測(cè)序中的應(yīng)用

3.1 基于Tn5為全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序建庫(kù)

表觀遺傳是指基因序列不變時(shí),通過(guò)一些表觀修飾影響基因表達(dá)情況進(jìn)而影響表型的現(xiàn)象。胞嘧啶5-C位置的酶促甲基化是一種廣泛存在的表觀遺傳修飾,在基因調(diào)控方面有著重要作用[23]。全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序(whole genome bisulfite sequencing,WGBS)是研究胞嘧啶甲基化分辨率較高且較為全面的一種方法[24]。該方法中,亞硫酸氫鈉被用來(lái)處理基因組DNA,在5-甲基胞嘧啶保持非反應(yīng)性的條件下將單鏈DNA中的胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶殘基,隨后用胞嘧啶甲基化處理的引物擴(kuò)增并測(cè)序,序列中剩余的所有胞嘧啶殘基代表基因組中先前甲基化的胞嘧啶[25]。隨著大規(guī)模并行測(cè)序成本的下降,WGBS也越來(lái)越普及。但是WGBS有一個(gè)關(guān)鍵的限制因素是需要較大量的DNA樣本,這對(duì)于許多實(shí)驗(yàn)是難以實(shí)現(xiàn)的[24,26]。據(jù)此,Adey等[27]開(kāi)發(fā)了Tn5Mc-seq,該方法將Tn5轉(zhuǎn)座系統(tǒng)用于WGBS來(lái)快速制備亞硫酸氫鹽測(cè)序文庫(kù),先將傳統(tǒng)的Tn5建庫(kù)中與Tn5結(jié)合的接頭中的胞嘧啶進(jìn)行甲基化修飾,將基因組DNA片段化后再與亞硫酸氫鹽反應(yīng)。轉(zhuǎn)座酶的使用使DNA的片段化、末端的補(bǔ)齊和接頭的連接簡(jiǎn)化為單個(gè)反應(yīng)且將DNA更有效地轉(zhuǎn)化為測(cè)序兼容材料。因此其減少了建庫(kù)過(guò)程中對(duì)DNA樣本量的損耗,大大降低了WGBS所需要的基因組DNA起始量[27]。

3.2 基于Tn5對(duì)蛋白質(zhì)與染色體的相互作用測(cè)定

染色質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用在表觀調(diào)控中也起到非常重要的作用,因此研究這種相互作用的眾多方法相繼誕生,染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序(chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)就是一個(gè)十分典型的例子[28]。但ChIP-seq需要甲醛來(lái)介導(dǎo)DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián),往往具有低信號(hào)、高背景且樣本需求量大等缺點(diǎn)[28]。隨后出現(xiàn)的CUT&RUN技術(shù)就是在此基礎(chǔ)上的改進(jìn),它的大致思路為在非交聯(lián)細(xì)胞中通過(guò)連續(xù)使用特定抗體,將蛋白A-微球菌核酸酶復(fù)合物(pA-MNase)導(dǎo)向蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn),隨后通過(guò)鈣離子的釋放來(lái)激活核酸酶,將所要的片段釋放到上清液中,最后進(jìn)行文庫(kù)的制備和測(cè)序等[29]。該方法可以將背景水平大大降低,也可以在一定程度上降低對(duì)樣本的需求量,僅在100~1000個(gè)細(xì)胞中就可以產(chǎn)生高質(zhì)量的數(shù)據(jù),但是必須經(jīng)過(guò)DNA末端的補(bǔ)齊和接頭的連接才能制備測(cè)序文庫(kù),這會(huì)增加整個(gè)過(guò)程的時(shí)間、成本和工作量。緊接著出現(xiàn)的CUT&Tag技術(shù)是對(duì)CUT&RUN技術(shù)的改進(jìn),研究人員將MNase替換為T(mén)n5轉(zhuǎn)座酶并使用Mg2+在特定時(shí)期激活pA-Tn5融合蛋白組成的轉(zhuǎn)座體,在獲取靶DNA的同時(shí)直接插入測(cè)序接頭,進(jìn)一步簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟,降低了時(shí)間成本[30]。在實(shí)際操作中,CUT&RUN和CUT&Tag技術(shù)都需要將細(xì)胞與磁珠結(jié)合,由于磁珠的懸浮性較差等因素,酶的效率往往會(huì)下降,于是研究者們又對(duì)磁珠進(jìn)行改良,有效改善了這一問(wèn)題,提高了檢測(cè)的靈敏度[31]。最近,研究者們?cè)谠械腃UT&Tag技術(shù)上進(jìn)一步創(chuàng)新,開(kāi)發(fā)出了multi-CUT&Tag,可以同時(shí)映射同一細(xì)胞中的多個(gè)染色體蛋白質(zhì),直接檢測(cè)不同蛋白質(zhì)在同一細(xì)胞中的共定位[32]。與此同時(shí),與CUT&Tag技術(shù)一樣基于抗體將Tn5靶向目的位點(diǎn)的技術(shù)還有ACTseq[33]、CoBATCH[34]和ChIL-seq[35]等,在單細(xì)胞表觀測(cè)序方面都具有深遠(yuǎn)意義和廣闊的發(fā)展前景。

通常情況下,染色質(zhì)可分為松弛型和緊密型兩種狀態(tài),緊密型染色質(zhì)往往不易于與蛋白質(zhì)等調(diào)控因子結(jié)合,可及性較弱;而松弛型染色質(zhì)更容易被調(diào)控因子等識(shí)別并結(jié)合,可及性較強(qiáng),因此染色質(zhì)可及性的研究也是基因組研究的一大重點(diǎn)。以轉(zhuǎn)座酶為載體研究染色質(zhì)可及性的技術(shù)(assay for transposase accessible chromatin with high-throughput sequencing,ATAC-seq)在這一領(lǐng)域有著極為重要的地位。該技術(shù)利用Tn5轉(zhuǎn)座酶優(yōu)先結(jié)合DNA中未受核小體保護(hù)的區(qū)域的特點(diǎn),將測(cè)序接頭引入染色質(zhì)的松弛區(qū)域進(jìn)行測(cè)序,以測(cè)定全基因組的染色質(zhì)可及性[36]。相比以往染色質(zhì)可及性的測(cè)定方法,ATAC-seq中Tn5的使用使DNA的切割和接頭的插入同時(shí)進(jìn)行,簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程,從而大大降低了對(duì)樣本量的要求。但同時(shí)ATAC-seq也存在一些問(wèn)題,例如,由于Tn5轉(zhuǎn)座酶在插入測(cè)序接頭時(shí)方向隨機(jī),一個(gè)片段兩端的接頭可能相同,導(dǎo)致僅有一半的片段可被測(cè)序[37]。此外,當(dāng)片段過(guò)大時(shí),也難以進(jìn)行體外的PCR擴(kuò)增[37]。

近年來(lái),研究者們對(duì)ATAC-seq技術(shù)進(jìn)行了多種改進(jìn)。THS-ATAC-seq技術(shù)是利用類(lèi)似LIANTI技術(shù)的方法將T7啟動(dòng)子引入染色質(zhì)可及位點(diǎn)并進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,隨后對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。并且,為了解決ATAC-seq中片段兩端接頭相同導(dǎo)致測(cè)序效率降低的問(wèn)題,研究者們還設(shè)計(jì)了由兩套轉(zhuǎn)座體復(fù)合物二聚體先后進(jìn)行轉(zhuǎn)座以分別加入兩端測(cè)序接頭的方法[37]。此外,Single Cell ATAC-seq技術(shù)提供了單細(xì)胞染色質(zhì)可及性的測(cè)定方案,使異質(zhì)性細(xì)胞染色質(zhì)可及性的差異得以檢測(cè)[38-40]。Omni-ATACseq技術(shù)在轉(zhuǎn)座反應(yīng)中使用PBS以增加信噪比,可以消除線(xiàn)粒體的干擾,提高染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)的質(zhì)量[40-41]。UMI-ATAC-seq技術(shù)通過(guò)把帶有標(biāo)準(zhǔn)TruSeq測(cè)序接頭的 UMI(unique molecular identifiers)應(yīng)用到ATAC-seq中,將PCR導(dǎo)致的重復(fù)序列與固有的重復(fù)序列區(qū)分開(kāi),能更準(zhǔn)確地量化染色質(zhì)可及性[42]。近期,新開(kāi)發(fā)的ATAC-MS技術(shù)將ATAC-seq與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合,使開(kāi)放染色質(zhì)結(jié)合蛋白得到更精確的檢測(cè),這相比之前在ATAC-seq后通過(guò)數(shù)據(jù)分析猜測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)要更加精準(zhǔn)[43]。

4 Tn5建庫(kù)在長(zhǎng)片段測(cè)序中的應(yīng)用

二代測(cè)序技術(shù)雖然實(shí)現(xiàn)了人們對(duì)基因的進(jìn)一步研究,但是它只能有效讀取短片段的特點(diǎn)使得最初的長(zhǎng)片段測(cè)序往往需要先將長(zhǎng)片段打斷,測(cè)序后進(jìn)行拼接。這種方法不僅復(fù)雜繁瑣,而且給基因組中同源序列的辨別和染色體結(jié)構(gòu)變異的鑒定帶來(lái)困難。Peters等[44]利用稀釋法將長(zhǎng)片段相互分離后打斷,并在打斷后的每個(gè)短片段上添加barcode和測(cè)序接頭,在測(cè)序后利用barcode區(qū)分不同的長(zhǎng)片段并完成拼接。但將混合的長(zhǎng)片段稀釋為單條片段操作復(fù)雜,且后續(xù)處理成本高。2017年,stLFR(single-tube long fragment read)的開(kāi)發(fā)解決了這一困難。研究人員利用Tn5在被SDS去除之前都一直與DNA片段結(jié)合且不脫落這一特性[45],將Tn5轉(zhuǎn)座酶先與長(zhǎng)片段DNA結(jié)合后,再與表面含有不同barcode的磁珠共同孵育[46]。由于轉(zhuǎn)座酶上結(jié)合的特殊DNA片段可以與barcode側(cè)翼鏈雜交并連接,不同的長(zhǎng)片段會(huì)附著在不同的磁珠上。隨后加入SDS可打斷長(zhǎng)片段并將磁珠表面的barcode轉(zhuǎn)座到每一個(gè)短片段中,最后通過(guò)PCR加入測(cè)序接頭即可進(jìn)行常規(guī)測(cè)序[47]。該方法彌補(bǔ)了二代測(cè)序的不足,相比三代測(cè)序成本更低,準(zhǔn)確性更高,具有廣闊的應(yīng)用前景。

5 Tn5建庫(kù)在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中的應(yīng)用

在常規(guī)轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)中,往往需要先富集目標(biāo)RNA再將其片段化,隨后進(jìn)行一鏈和二鏈cDNA合成、接頭連接和PCR擴(kuò)增等。盡管Tn5轉(zhuǎn)座酶建庫(kù)方法的普及簡(jiǎn)化了其中的步驟,但是其仍然無(wú)法滿(mǎn)足對(duì)微量RNA樣本方便、快捷地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析的需求。2020年,Tn5轉(zhuǎn)座酶被證實(shí)可以直接作用于DNA/RNA雜交鏈,基于此,研究者們開(kāi)發(fā)了一種轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)新方法,并命名為T(mén)RACE-seq(transposase-assisted RNA/DNA hybrids cotagmentation)(見(jiàn)圖3),該方法可以簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程,降低建庫(kù)成本及樣本的輸入量[48-49]。TRACE-seq具有廣闊的應(yīng)用前景,它有望用于獲取與復(fù)雜的宿主背景混合而無(wú)法體外培養(yǎng)的低滴度病毒的全基因組[50]。近期,TRACE-seq也被證明具有獲取綜合信息的潛力,可用于表征復(fù)雜的宿主與微生物組之間的相互作用[51]。

6 小結(jié)與展望

Tn5轉(zhuǎn)座子獨(dú)特的轉(zhuǎn)座機(jī)制使其可以將文庫(kù)構(gòu)建中DNA的片段化、末端的補(bǔ)齊和接頭的連接3個(gè)步驟簡(jiǎn)化為單一且快速的反應(yīng),這大大簡(jiǎn)化了文庫(kù)的構(gòu)建流程,同時(shí)降低了對(duì)樣本量的需求,這在疾病的研究中具有深遠(yuǎn)的意義和廣闊的前景。此外,LIANTI的應(yīng)用降低了由PCR擴(kuò)增帶來(lái)的擴(kuò)增偏差和錯(cuò)誤,使得文庫(kù)中DNA的擴(kuò)增更加保守。在長(zhǎng)片段測(cè)序中,Tn5轉(zhuǎn)座酶的應(yīng)用彌補(bǔ)了二代測(cè)序短讀長(zhǎng)的缺點(diǎn),相較于三代測(cè)序其成本更低,準(zhǔn)確性更高,這使得一些染色體疾病的檢測(cè)變得更加便捷。

除此之外,Tn5轉(zhuǎn)座酶還被應(yīng)用在多個(gè)領(lǐng)域中。例如BAT Hi-C技術(shù)利用Tn5轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行染色體3D構(gòu)象的捕獲[52];FACT-seq技術(shù)利用Tn5轉(zhuǎn)座酶開(kāi)發(fā)出有效分析福爾馬林固定石蠟包埋組織中組蛋白修飾的方法[53];SorTn-seq技術(shù)利用Tn5轉(zhuǎn)座酶高通量篩選細(xì)菌基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子[54]。Tn5轉(zhuǎn)座酶在各種技術(shù)中的應(yīng)用顯著降低了對(duì)樣本量的要求,這使許多稀缺的樣本也能夠滿(mǎn)足各種測(cè)序的要求。同時(shí),Tn5轉(zhuǎn)座酶與barcode等技術(shù)的結(jié)合提高了單細(xì)胞測(cè)序的可行性。目前,Tn5轉(zhuǎn)座酶在單細(xì)胞測(cè)序領(lǐng)域的研究還相當(dāng)稀缺,對(duì)相關(guān)技術(shù)的開(kāi)發(fā)和改進(jìn)還有待研究。但Tn5轉(zhuǎn)座酶所具有的單細(xì)胞測(cè)序潛力在細(xì)胞分化、腫瘤異質(zhì)性的研究中備受關(guān)注。雖然目前Tn5轉(zhuǎn)座酶的使用并未普及,但是隨著技術(shù)研究的不斷深入,Tn5轉(zhuǎn)座酶有望打開(kāi)單細(xì)胞測(cè)序等領(lǐng)域的新局面。