慢性阻塞性肺疾病相關動物模型研究進展

周利潤,崔曉蘭

(中國中醫(yī)科學院中藥研究所,北京 100700)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種進行性、以持續(xù)性呼吸癥狀和氣流受限為特征的慢性呼吸系統(tǒng)疾病,并與氣道和肺部對氮氧化物顆粒或有害氣體的慢性炎癥反應增強有關,慢性氣流受限由小氣道阻塞、慢性支氣管炎和肺實質破壞(肺氣腫)共同作用所致,可影響日常活動和總體生活質量[1-2]。在全球范圍內受影響人口約3.28億,且高齡時患病率更高,約10%為中年人、25%是大于70歲的老年人[3]。COPD目前是第三大死亡原因,死亡人數超過300萬人/年[4]。由于人口老齡化日益嚴重以及歷史和當前的吸煙率較大,導致COPD的全球死亡率正在逐年上升,并且世界衛(wèi)生組織預測到2030年COPD的患病率和死亡率將總體上升30%[5-6]。吸煙每年導致約500萬例死亡,是COPD發(fā)生的主要內在風險因素,但也有其他外部風險因素,包括暴露于煙草煙霧環(huán)境下的二級和三級吸煙,以及職業(yè)暴露于灰塵、有毒煙霧和蒸汽、燃燒生物燃料造成的室內空氣污染和室外空氣污染[7-9]。

COPD與破壞肺實質組織有關,破壞正常的修復和防御機制,這種肺損傷導致慢性空氣潴留、進行性氣流受限和對入侵病原體的易感性增加[10]。研究表明,COPD患者的肺部可能比健康肺部更容易感染更多的致病菌,46% ~ 72%的COPD患者的痰液中發(fā)現了細菌,并且大約50%的COPD的惡化由細菌引起,細菌過度生長可能是COPD加重的誘因[1,11]。氣道細菌感染使大多數COPD患者的病程復雜化,導致癥狀加重、肺功能進一步受限、急性發(fā)作以及生活質量下降[5]。COPD的急性加重(AECOPD)是指患者咳嗽、咳痰、呼吸困難持續(xù)惡化并超出了日常變異范圍,隨著病情進展而不斷加劇,降低了機體的氣體交換能力,導致低血氧癥、高碳酸血癥、肺組織纖維化等,最終發(fā)展為肺源性心臟病,導致全身多器官衰竭,最后造成生活質量下降甚至會引起死亡。在疾病進行過程中可能出現發(fā)熱、炎痛等明顯合并加重癥狀,其主要誘因是細菌病毒感染[12]。細菌病毒感染COPD患者所致AECOPD會使病情進一步加重,臨床治療難度進一步加大,死亡率進一步增加[13]。

本文將分析COPD以及AECOPD動物模型的建立方法,以期為構建適宜穩(wěn)定的AECOPD動物模型,為深入研究AECOPD的致病機理、耐藥菌感染相關機制及開發(fā)新的抗AECOPD藥物奠定基礎。

1 慢性阻塞性肺疾病動物模型建立方法與評價指標

1.1 常見慢性阻塞性肺疾病動物模型

目前COPD動物模型常用的實驗動物包括:小鼠、大鼠、豚鼠、果蠅、犬、豬、雪貂、猴等,其中應用最為廣泛的為嚙齒類動物[14]。

1.1.1 慢性阻塞性肺疾病鼠類模型

鼠類與人有大約90%的相似基因,許多生理通路和過程在臨床上是相關的[8]。鼠類品種繁多包括大小鼠、豚鼠、倉鼠、金黃地鼠等[15],繁殖周期短、利于繁殖、飼養(yǎng)簡單、成本較低以及目前對鼠類基因組的研究比較透徹[16]。豚鼠的肺部解剖結構類似于人的呼吸道結構,呼吸上皮細胞排列均勻,可建立與人類相似COPD的疾病發(fā)作特點[17]。臨床上COPD患者多由于吸煙引起的,大小鼠為專屬性用鼻呼吸動物,對煙的濾過效率較低,建模方便快捷[18],炎癥反應明顯,造模穩(wěn)定性高。某些品種經過基因修飾后對煙霧更為敏感,可用于研究參與COPD病理生理過程性病變的某些特定基因和蛋白的變化[19]。

1.1.2 慢性阻塞性肺疾病小型豬模型

小型豬的肺組織比鼠類動物更為發(fā)達,是目前建立COPD模型較為理想的動物,其肺葉明顯,左二右三的結構與人類類似,具有呼吸性的細支氣管,呼吸道黏膜下腺體較為豐富,容易感染呼吸道的相關疾病,氣管較為粗大,易于相關操作和評價,誘導COPD模型相對容易[20-21]。

1.1.3 慢性阻塞性肺疾病果蠅模型

果蠅的呼吸系統(tǒng)與哺乳動物的肺部系統(tǒng)相似,在發(fā)育和功能方面有很多相似之處,可以很清晰地觀察到氣道的早期結構損傷,可以對其所涉及的信號通路和細胞過程進行相關遺傳和藥理學操作,其可以關聯人類疾病基因,可通過果蠅篩選人COPD的相關基因[22]。可以研究氣道上皮屏障功能和先天性免疫的異常[23]。

1.1.4 慢性阻塞性肺疾病犬模型

犬極易發(fā)生自發(fā)性過敏反應,受到刺激后支氣管收縮反應的時間過程與患者相似,并且支氣管痙攣的程度與刺激的持續(xù)時間和強度成正比[24]。人類吸煙是導致COPD的主要原因,犬暴露于香煙煙霧后出現的肺部病變與人類COPD中出現的病變類似[25-26]。目前犬已被廣泛用于COPD領域的研究,長期研究顯示這些肺功能參數隨著時間的推移具有顯著的穩(wěn)定性[27-29]。因此,可以在COPD的慢性犬模型中評估肺功能的變化,包括評估氣道高反應性。犬像小型豬一樣體型相對較大且易于操作。

1.1.5 慢性阻塞性肺疾病雪貂模型

雪貂作為十分適合研究呼吸系統(tǒng)疾病的動物,有數據表明它們與人類氣道生理學和粘膜下腺體的分布十分相似。研究表明將雪貂暴露于香煙煙霧中后,發(fā)現它們與人類COPD的復雜臨床特征接近,暴露在煙霧中的雪貂表現出較高水平的氣道阻塞,伴有杯狀細胞化生、增生和小氣道粘液表達增加[30],具有明顯的慢性支氣管炎和肺氣腫的特征。

1.1.6 慢性阻塞性肺疾病猴模型

靈長類動物在生理學、遺傳學、解剖學、肺部免疫系統(tǒng)等方面都與人有著高度的一致性,猴常被用作實驗動物,其中恒河猴具有與人類及其相似的肺部結構,具有二分支的細支氣管,肺泡分布廣泛,纖毛、杯狀細胞排列順序與人類極為類似,在吸入香煙煙霧后可表現出慢性細支性支氣管炎、肺氣腫以及其他氣道病理學改變,所具備的獨特優(yōu)勢用于建立COPD最為合適[31-33]。

1.2 慢性阻塞性肺疾病動物模型常見建立方法

COPD臨床發(fā)病機制復雜,已有多種建立方法,常見的建模方法為將實驗動物暴露于香煙煙霧、脂多糖、蛋白酶、菌毒株以及大氣顆粒物等。

1.2.1 香煙誘導

香煙是導致COPD的主要原因,臨床上大約有90%的患者由吸煙引起,流行病學研究表明吸煙者比不吸煙者更容易患COPD[34]。香煙煙熏造模的方法主要有兩種:(1)直接經鼻煙熏:將煙霧直接輸送入動物鼻腔內;(2)全身暴露法:將動物置于連接煙霧發(fā)生裝置的容器進行全身暴露煙熏。研究表明單純鼻接觸和全身接觸煙霧導致肺損傷的機制可能是相同的[35]。香煙煙霧可直接損害氣道上皮細胞,使纖毛結構和功能受損,引起支氣管平滑肌痙攣收縮和粘液分泌,氣道阻力增加,顆粒物會沉積在小氣道中,引起慢性炎癥反應。這種慢性炎癥反應會破壞肺實質、肺泡壁,并永久擴張小氣道,從而誘發(fā)肺氣腫和氣道重塑[36]。

單純的香煙煙熏進行造模,造模時間長、成模慢,持續(xù)時間多為4 ~ 6個月甚至更長時間[37],且煙熏過程穩(wěn)定性不易保證,易出現死亡等不良情況。

1.2.2 彈性蛋白酶誘導

COPD主要臨床表現癥狀為肺氣腫,目前蛋白酶作用是肺氣腫、急性肺損傷模型建立最常見的方法,蛋白酶—抗蛋白酶失衡也是COPD發(fā)病機制最經典的學說,所以蛋白酶(彈性蛋白酶或木瓜蛋白酶或豬胰腺彈性蛋白酶)的氣管內滴注也可用于研究COPD的相關癥狀的近似表現[38]。木瓜蛋白酶是最常用于誘導肺部肺氣腫病變的蛋白水解酶。通過接觸性給予蛋白酶可誘導單純性肺部癥狀外,還有肌肉萎縮、體重減輕以及全身性炎癥反應[39]。有研究表明通過氣管內滴注蛋白酶會使模型動物肺泡腔擴大、肺水腫、炎癥浸潤、血氧飽和度下降等癥狀,與臨床癥狀具有一致性[40]。

此方法相比于香煙煙熏法具有成模時間短、成本較低以及易于操作等優(yōu)點,氣管滴注彈性蛋白酶僅需要21 d即可建立肺氣腫模型,用來代替慢性阻塞性肺疾病模型[41]。蛋白酶進行造模雖然具有成模時間短操作方便等優(yōu)點,但其只能出現部分病理癥狀改變,與臨床COPD發(fā)病機制仍有差別。

1.2.3 脂多糖誘導

作為內毒素屬的一種重要物質,脂多糖是革蘭氏陰性菌的細胞壁成分,能刺激炎性細胞產生并釋放炎性介質,產生一系列的炎性反應,引起黏液分泌過多、氣道高反應、炎性細胞浸潤、肺功能下降、肺氣腫、肺部纖維化等COPD典型癥狀[42]。目前脂多糖常單獨氣管注射或香煙煙熏聯合氣管滴注脂多糖來建立COPD動物模型,嚴重的可出現肺動脈高壓等嚴重癥狀[43-44]。脂多糖進行造模的缺點與蛋白酶誘導的慢性阻塞性肺疾病模型基本一致。

1.2.4 空氣顆粒物誘導

空氣中的污染物如PM2.5、SO2、NO2、汽車尾氣、臭氧等物質均能對肺部產生不同程度的影響,也是慢性阻塞性肺疾病形成的重要原因。PM2.5可參與慢阻肺、支氣管哮喘等多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展,研究表明,PM2.5的濃度升高可增加慢阻肺的患病率,并且慢阻肺的死亡率隨著其濃度的增加而升高,目前常見的PM2.5造模方法有吸入和做成混懸液滴鼻或者氣管滴注進行[45]。SO2是工業(yè)煙霧的主要成分,在阻塞性氣道疾病的發(fā)病機制中起著重要作用。吸入SO2會產生多種病理、炎性以及生理反應,與慢性支氣管炎癥狀相似[46]。同時NO2吸入、香煙塵霧滴鼻、臭氧熏蒸以及汽車尾氣的吸入和滴鼻以及與LPS聯合應用也曾應用于慢性阻塞性肺疾病的模型建立[47-50]。

1.3 慢性阻塞性肺疾病動物模型常見評價方法

1.3.1 一般體征評價

COPD動物模型建立過程中會出現體重減輕、飲食量減少、飲水量增多的一般表現,還會出現咳嗽、黏液分泌增多、毛色暗淡枯槁無光澤、精神萎靡、運動量下降等表現。有研究表明臨床慢性阻塞性肺疾病患者還會出現體重指數下降、皮下脂肪、內部儲備脂肪以及白蛋白減少等狀況[51]。模型建立動物表現與臨床基本一致。

1.3.2 肺功能評價

肺功能檢測是COPD患者臨床診斷的黃金標準,是檢測患者肺容積大小以及是否存在呼吸受限的重要指標,隨著技術水平的發(fā)展,動物適配的肺功能檢測設備應用也越來越廣泛。有創(chuàng)無創(chuàng)設備均能實現對于肺功能的檢測,有創(chuàng)檢測可在麻醉條件下通過呼吸機輔助測量動物每秒用力呼氣容積/用力肺活量的比值來表示氣道受限情況,與臨床基本一致[52]。無創(chuàng)檢測可通過相關肺功能儀檢測呼吸氣峰流速、潮氣量、吸氣阻力、動態(tài)肺順應性、呼氣量、50%呼氣峰流速、呼吸頻率等相關肺功能指標[53-55]。

1.3.3 病理組織評價

肺部實質性病理變化能直觀表現肺組織的病變情況,測定平均線性間隔、平均肺泡數和支氣管壁厚/直徑比值能較好的表現出肺部病變情況。COPD模型動物會出現肺泡管、肺泡囊和肺泡的明顯擴張,肺泡結構紊亂,肺泡壁有變薄和破裂的跡象,有些已經融合成肺大皰。并且出現纖毛細胞變性壞死以及纖毛倒伏、斷裂、粘連、脫落等情況,上皮細胞脫落、杯狀細胞化生、黏液分泌增多等。肺動脈壁增厚,管腔變窄,有不同程度的外周中性粒細胞、淋巴細胞和單核巨噬細胞浸潤[56]。

1.3.4 其他評價

血氣分析、血氧飽和度、炎性因子、炎性細胞等也可以用來輔助評價慢性阻性肺疾病模型是否建立成功。如肺組織和肺支氣管可出現多種炎性細胞浸潤,炎性細胞的浸潤聚集也是炎癥發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié);各種細胞因子在慢阻肺初期也會有較大變化,對模型的鑒定和評價也有重要意義;在COPD后期還會出現血氧飽和度下降、低血氧癥和高碳酸癥等表現,所以在評價慢性阻塞性肺疾病模型時血氧飽和度也是重要的實驗指標[57-59]。

2 慢性阻塞性肺疾病急性加重期動物模型建立方法與評價

AECOPD模型的建立在COPD模型建立的基礎上進行,所以AECOPD模型建立和COPD模型所用動物相互重合。本段只對AECOPD模型建立方法和評價進行討論。

2.1 慢性阻塞性肺疾病急性加重期動物模型建立方法

感染是導致COPD急性加重的重要原因,其中細菌感染約占60%,病毒感染占30%左右,其他非典型感染占10%[60-61]。

在AECOPD患者的痰液中分離到的主要細菌株有銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等,分離到的病毒主要有甲型流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等[62-65]。目前臨床常見的AECOPD模型的建立均是在COPD模型的基礎上進行滴鼻或者氣管滴注細菌病毒來誘導。

如祁海燕等[66]采用彈性蛋白酶氣管滴注建立肺氣腫大鼠模型,COPD模型建立成功后第2天肺氣腫大鼠氣管內滴注0.15 mL 1 × 1012CFU/mL的肺炎鏈球菌瓊脂懸液,構建AECOPD大鼠模型。Wang等[67]則通過采用氣管內注射18單位的豬胰腺彈性蛋白酶建立金黃地鼠肺氣腫模型,并在模型建立的基礎上右肺內注射含有3 × 108CFU/mL流感嗜血桿菌的瓊脂珠100 μL。張?zhí)鹛鸬萚68]采用香煙煙熏法建立慢阻肺大鼠模型,模型建立成功后第2天,COPD大鼠氣管內滴注0.2 mL濃度為2.4 × 109CFU/mL的肺炎鏈球菌瓊脂懸液或濃度為6 × 108CFU/mL銅綠假單胞菌懸液。Guan等[69]采用香煙煙熏法建立慢阻肺小鼠模型后鼻腔緩慢滴入30 μL 108CFU/mL的流感嗜血桿菌菌液,Roos等[64]則在COPD模型基礎上采用 35 μL 106CFU/mL的流感嗜血桿菌菌液建立模型。Xiao等[62]采用香煙煙熏法建立慢阻肺小鼠模型后鼻腔緩慢滴入50μL 2LD50的甲型H1N1流感病毒感染建立模型。

香煙煙霧和細菌、病毒感染對氣道損傷有協(xié)同作用,這種損傷可能是通過對彈性蛋白酶活性的影響介導的,且感染性物質的入侵會使氣道炎癥和全身炎癥進一步增加。細菌或病毒感染激活相關信號通路,可調控細胞因子和趨化因子的基因表達,進一步促進疾病的發(fā)展,COPD咳痰困難粘液分泌過度更易于細菌病毒的定植,且細菌感染相關病理變化與COPD進行和發(fā)展也具有高度一致性[62]。

2.2 慢性阻塞性肺疾病急性加重期動物模型評價方法

有研究表明AECOPD動物模型在滴入菌液后會出現活動能力下降、呼吸急促、活動后加劇、出現哮鳴音、咳嗽進一步加重,與臨床表現一致[70]。細菌標志物如C反應蛋白、降鈣素原等因子的急劇增加,呼吸頻率、呼吸氣峰流速進一步增加,而潮氣量和呼氣量均減少,50%呼氣峰流速也下降明顯[71]。并且可以在肺組織勻漿中培養(yǎng)出相關菌落[72]。

3 小結

臨床上吸煙是導致慢性阻塞性肺疾病的主要原因,所以目前最常用的模型為單純香煙煙熏和煙熏聯合氣管注射脂多糖來進行造模。但單純被動吸煙法具有造模時間長、難度大,飼養(yǎng)過程中動物狀態(tài)不容易保證,煙熏過程中容易死亡等缺點,而被動吸煙聯合氣管注射脂多糖雖然能很大程度上節(jié)省時間但LPS主要是引起急性肺損傷,而臨床上COPD患者多由吸煙等顆粒物沉積造成的,不能更好的還原臨床,所以急需一種能夠更好的還原臨床發(fā)病機制的動物模型來進行藥物篩選和評價實驗。目前急性加重期模型建立還處于初期階段,甚至慢性阻塞性肺疾病還未見統(tǒng)一標準,標準的動物模型的缺失仍然是阻礙COPD、AECOPD研究發(fā)展的關鍵原因之一。