小花杜鵑中兩個新的木脂素

范賢哲，朱陽利，袁榮文，鄧 麗，伍念榮，張立軍，廖海兵*

1廣西師范大學化學與藥學學院 省部共建藥用資源化學與藥物分子工程國家重點實驗室，桂林 541004； 2廣西桂林銳德檢測認證技術有限公司，桂林 541100

小花杜鵑(Rhododendronminutiflorum)又名細花杜鵑、細榴花，為杜鵑花科杜鵑屬(RhododendronL.)植物，常生于海拔1 120～1 430 m的丘陵地區(qū)，主產于我國廣西和廣東兩個省份[1]。該屬中的多種植物均有較高的藥用和經濟價值，如羊躑躅(R.molle)具有抗炎鎮(zhèn)痛的藥理作用，可用于風濕性關節(jié)炎、心血管等疾癥的治療[2]；烈香杜鵑(R.athopogonoide)為常用藏藥，具有止咳平喘、清熱解毒之功效[3]。隨著現代色譜分離和波譜技術的快速發(fā)展，國內外對杜鵑屬植物的化學成分和藥理活性的研究正在不斷深入和系統(tǒng)化。近年來從該屬植物中分離得到了許多結構新穎、活性優(yōu)良的化學成分，主要結構類型包括：香豆素、木脂素、黃酮和萜類等[4，5]，許多化合物表現出顯著的降血糖、抗腫瘤、抗炎、抗菌、殺蟲以及抗氧化等生物活性[6,7]。

杜鵑屬植物的降血糖活性一直以來備受國內外研究者的關注。Choi等[8]從R.brachycarpum中分離得到的rhododendric acid A和熊果酸對胰島素信號轉導關鍵酶PTP1B具有較強的抑制活性，其IC50值分別為6.3±0.6、3.1±0.3 μM。Liao等[5]從R.capitatum中分離出一對具有PTP1B抑制活性的對映異構體(-)-rhodonoids B和(+)-rhodonoids B，其IC50值分別為43.56±8.53、30.38±13.41 μM。從R.arboreum中分離得到的3-O-acetylursolic acid對α-葡萄糖苷酶表現出明顯的抑制活性，IC50值為3.3±0.1 μM[9]。Muhammad等[10]發(fā)現R.schlippenbachii樹皮80%甲醇粗提物的乙酸乙酯和二氯甲烷萃取部位可有效抑制α-葡萄糖苷酶活性和降低小鼠體內的血糖濃度。

小花杜鵑隸屬杜鵑屬植物，目前國內外有關小花杜鵑的化學成分和藥理活性的研究尚未見報道。鑒于此，本文對小花杜鵑95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位進行化學成分研究并對所分離得到的單體化合物進行α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選，以期為小花杜鵑的進一步開發(fā)和利用提供參考和科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

JASCO P-2000型圓二色光譜儀(JASCO日本分光株式會社)；PerkinElmer Spectrum Two FT-IR紅外光譜儀(美國珀金埃爾默股份有限公司)；Synergy H1全功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；Bruker-AVANCE400 NMR及600 NMR核磁共振儀(瑞士Bruker公司)；Agilent 6545 Q-TOF液質聯用系統(tǒng)和Cary 100型紫外可見分光光度計(安捷倫科技(中國)有限公司)；Shimadzu LC-20AT型高效液相色譜儀(Shimadzu公司)；P3000型高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；分析型C18色譜柱：5 μm，150 mm×4.6 mm及制備型C18色譜柱：5 μm，250 mm×20 mm(日本YMC公司)；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(瑞典Pharmacia Biotech公司)；RP18反相柱色譜硅膠(日本YMC公司)；柱色譜硅膠(200～300 目)及硅膠GF254薄層板(青島海洋化工有限公司)；色譜純甲醇、乙腈(美國Tedia和Fisher公司)；96孔細胞培養(yǎng)板(NEST公司)；α-葡萄糖苷酶(克拉瑪爾，批號：ZY210818)；阿卡波糖(MedChemExpress，批號：HY-B0089)；水為超純水；所用其他分析純試劑均為西隴化工股份有限公司產品。

1.2 植物材料

植物材料于2019年5月采集于廣西壯族自治區(qū)武鳴縣大明山，由廣西師范大學生命科學學院唐紹清教授鑒定為杜鵑屬植物小花杜鵑(Rhododendronminutiflorum)，植物樣品標本(No.TS-20190505)保存于廣西師范大學化學與藥學學院省部共建“藥用資源化學與藥物分子工程國家重點實驗室”。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取與分離

小花杜鵑干燥莖葉13.4 kg，經95%乙醇-水加熱回流提取3次，每次3 h，所得提取液經減壓濃縮得到浸膏1.5 kg，浸膏加入適量蒸餾水懸浮后用乙酸乙酯萃取3次，萃取液經減壓濃縮得到乙酸乙酯部位900 g。乙酸乙酯部位采用大孔樹脂柱層析脫除色素并進行極性分段，以乙醇-水(3∶7→5∶5→8∶2→10∶0，V/V)和丙酮作為流動相依次洗脫，分離得到5個餾分(Fr.A～Fr.E)。餾分Fr.C(100.0 g)經硅膠柱色譜，二氯甲烷/甲醇(100∶1→1∶1，V/V)梯度洗脫得到12個亞餾分(Fr.C-1～Fr.C-12)。餾分Fr.C-1(367.8 mg)經Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜，甲醇等度洗脫得到7個亞餾分(Fr.C-1-1～Fr.C-1-7)，餾分Fr.C-1-7(25.0 mg)經制備型HPLC等度洗脫(37%乙腈水，流速8.0 mL/min)得到化合物7(tR=88.8 min，8.0 mg)。餾分Fr.C-4(516.0 mg)經Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜，甲醇等度洗脫得到6個亞餾分(Fr.C-4-1～Fr.C-4-6)，餾分Fr.C-4-4(42.0 mg)經制備型HPLC等度洗脫(37%乙腈水，流速8.0 mL/min)得到化合物5(tR=29.4 min，8.0 mg)和化合物6(tR=51.2 min，11.0 mg)。餾分Fr.C-5(2.1 g)經ODS柱色譜，甲醇-水(5∶5→10∶0，V/V)梯度洗脫得到7個亞餾分(Fr.C-5-1～Fr.C-5-7)。餾分Fr.C-5-3(164.5 mg)經Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜，甲醇等度洗脫得到5個亞餾分(Fr.C-5-3-1～Fr.C-5-3-5)。餾分Fr.C-5-3-2(58.7 mg)經制備型HPLC等度洗脫(30%乙腈水，流速8.0 mL/min)得到化合物3(tR=83.2 min，28.2 mg)；餾分Fr.C-5-3-3(15.5 mg)經制備型HPLC等度洗脫(30%乙腈水，流速8.0 mL/min)得到化合物4(tR=117.0 min，4.7 mg)；餾分Fr.C-5-3-4(11.6 mg)經制備型HPLC等度洗脫(30%乙腈水，流速8.0 mL/min)得到化合物2(tR=93.5 min，3.0 mg)。餾分Fr.C-7(883.8 mg)經ODS柱色譜，甲醇-水(6∶4→10∶0，V/V)梯度洗脫得到5個亞餾分(Fr.C-7-1～Fr.C-7-5)，餾分Fr.C-7-2(17.4 mg)經制備型HPLC等度洗脫(30%乙腈水，流速8.0 mL/min)得到化合物8(tR=58.0 min，2.0 mg)和化合物9(tR=65.6 min，2.5 mg)。餾分Fr.E(60.0 g)經硅膠柱色譜，二氯甲烷/甲醇(100∶1→1∶1，V/V)梯度洗脫得到9個亞餾分(Fr.E-1～Fr.E-9)。餾分Fr.E-1(16.1 g)采用ODS柱色譜分離，甲醇-水(5:5→10:0，V/V)梯度洗脫得到6個亞餾分(Fr.E-1-1～Fr.E-1-6)。餾分Fr.E-1-2(7.4 mg)經制備型HPLC等度洗脫(55%甲醇水，流速6.0 mL/min)得到化合物1(tR=99.8 min，3.6 mg)。

1.3.2α-葡萄糖苷酶抑制活性測試

參照文獻方法[11]并略作改進，具體方法如下：以PNPG為底物，阿卡波糖為陽性對照，實驗分為空白組(不加α-葡萄糖苷酶液和樣品化合物)、對照組(不加樣品化合物)、樣品化合物測定組、樣品化合物空白組(不加α-葡萄糖苷酶液)，每組設置3個復孔。在96微孔板中加入適量(根據反應終止時體積為200 μL計算)磷酸鹽緩沖液(pH =6.8)，0.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶液50 μL和樣品溶液50 μL(反應體系中樣品終濃度為250.00、83.33、27.78、9.26、3.09 μM；阿卡波糖的終濃度分別為0.5×10-3、1.6×10-4、5.5×10-5、1.8×10-5、6.1×10-6、2.1×10-6、6.8×10-7、2.2×10-7mg/mL，50 μL)低速振蕩搖勻，37 ℃孵育10 min，加入50 μL的PNPG(0.5 mmol/L)，低速振蕩搖勻，37 ℃孵育30 min，再加入0.1 mol/L的碳酸鈉溶液50 μL終止反應，于405 nm處測定吸光值。按下式計算目標化合物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。每組實驗均重復三次，取平均值。并根據擬合的底物—抑制率方程計算IC50，結果用平均值±標準誤表示。

其中，Ac為對照組，Ab為空白組，As為樣品組，Asb為樣品空白組。

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

表1 化合物1的1H和13C NMR數據(400和150 MHz，CDCl3)Table 1 1H and 13C NMR data of compound 1(400 and 150 MHz,CDCl3)

經過文獻檢索發(fā)現，化合物1的主要一維譜信號與已被報道的苯駢呋喃型降木脂素fructusol A[12]的數據極為相似，結合分子式信息推測，兩個化合物的主要區(qū)別在于化合物母核結構上C-9和C-3′位所連取代基的不同。經碳譜數據比較，結果顯示化合物1比fructusol A多出2個羰基和2個甲基碳信號，且在HMBC譜中甲基質子信號δH2.09(3H，s，3′-OCOCH3)和連氧的亞甲基質子信號δH5.22(2H，d，J=0.8 Hz，H-3′)與碳信號δC171.1(3′-OCOCH3)均有相關；甲基質子信號δH2.11(3H，s，9-OCOCH3)和連氧的亞甲基質子信號δH4.75(2H，dd，J=6.4，1.2 Hz，H-9)與碳信號δC171.1(9-OCOCH3)均有相關。因此，推測化合物1(結構見圖1)是fructusol A的9，3′-乙酰氧基取代衍生物。根據HMBC和1H-1H COSY等二維圖譜中的其他關鍵相關信號(見圖2)確定化合物1的結構，命名為rhodominutinan A，是1個天然產物中比較罕見的苯駢呋喃型降木脂素?；衔?和2的詳細結構鑒定數據原始圖譜可從本刊官網免費下載(www.trcw.ac.cn)。

圖1 化合物1～9的化學結構式Fig.1 The chemical structures of compounds 1-9

圖2 化合物1的主要1H-1H COSY和HMBC相關Fig.2 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

表2 化合物2的1H和13C NMR數據(400和150 MHz，CD3OD)Table 2 1H and 13C NMR data of compound 2(400 and 150 MHz,CD3OD)

通過比較發(fā)現化合物2與已知化合物(+)-isolariciresinol 9′-ferulate[13]的NMR數據較為相似，區(qū)別在于化合物2的C-9′所連側鏈的不同。通過1H-1H COSY、HMBC和NOESY譜中的相關信號確定了化合物2的平面結構(見圖3)，盡管HMBC譜中化合物C-7′′的羰基碳與H-9′沒有顯示出相關性，但化合物C-9′的化學位移(δC65.1)相對于(+)-isolariciresinol[13](δC62.2)增加了2.9 ppm，這說明苯甲酰氧基是與C-9′而不是與C-9相連。有趣的一個現象是在對其同類型化合物(+)-isolariciresinol 9′-p-coumarate[14]的結構解析中H-9′與酯基碳的相關性同樣未見報道。在1H NMR譜中H-7′的耦合常數J=10.0 Hz，且NOESY譜中H-7′與H-8、H-9與H-8′均顯示出相關性，由此確定了化合物2的相對構型。在圓二色譜圖中，于274 nm處觀察到正的Cotton效應，于292 nm處觀察到負的Cotton效應，通過與文獻報道的(+)-(8R,7′S,8′R)-9-acetoxy-9′-benzoyloxy-isolariciresinol[15]相比較，由此確定化合物2的立體構型為(8R,7′S,8′R)，并將其命名為rhodominutinan B，是1個新的苯二氫化萘型木脂素。

圖3 化合物2的主要 1H-1H COSY、HMBC和NOESY相關Fig.3 Key 1H-1H COSY,HMBC and NOESY correlations of compound 2

化合物5無色針狀結晶(氯仿)，易溶于氯仿;HR-ESI-MS：m/z205.044 6 [M+Na]+(calcd for 205.047 1)，結合1H和13C數據，確定其分子式為C9H10O4。1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ：6.15(1H，d，J=2.4 Hz，H-3)，6.19(1H，d，J=2.4 Hz，H-5)，2.43(3H，s，H-8)，3.89(3H，s，H-9)；13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ：105.7(C-1)，163.8(C-2)，101.7(C-3)，166.2(C-4)，112.4(C-5)，144.5(C-6)，173.4(C-7)，24.3(C-8)，52.1(C-9)。以上數據與文獻報道基本一致[18]，故鑒定化合物5為苔色酸甲酯。

化合物6無色針狀結晶(氯仿)，易溶于氯仿;HR-ESI-MS：m/z219.062 1 [M+Na]+(calcd for 219.062 8)，結合1H和13C數據，確定其分子式為C10H12O4。1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ：6.14(1H，d，J=2.4 Hz，H-3)，6.18(1H，d，J=2.4Hz，H-5)，2.44(3H，s，H-7)，4.34(2H，q，J=7.2 Hz，H-9)，1.38(3H，t，J=7.2 Hz，H-10)；13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ：105.7(C-1)，166.3(C-2)，101.7(C-3)，163.7(C-4)，112.5(C-5)，144.6(C-6)，24.5(C-7)，173.0(C-8)，62.1(C-9)，14.6(C-10)。以上數據與文獻報道基本一致[19]，故鑒定化合物6為苔黑酚羧酸乙酯。

化合物7無色針狀結晶(氯仿)，易溶于氯仿;HR-ESI-MS：m/z219.062 8 [M+Na]+(calcd for 219.062 8)，結合1H和13C數據，確定其分子式為C10H12O4。1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：11.90(1H，s，2-OH)，6.12(1H，s，H-5)，5.39(1H，br s，4-OH)，3.89(3H，s，-OCH3)，2.42(3H，s，6-CH3)，2.00(3H，s，3-CH3)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：172.6(C =O)，163.0(C-4)，158.3(C-2)，139.9(C-6)，110.5(C-5)，108.5(C-3)，105.0(C-1)，51.9(-OCH3)，24.2(6-CH3)，7.6(3-CH3)。以上數據與文獻報道基本一致[20]，故鑒定化合物7為2，4-二羥基-3，6-二甲基苯甲酸甲酯。

化合物8淡黃色無定型狀粉末(甲醇)，易溶于甲醇;HR-ESI-MS：m/z293.041 2 [M+Na]+(calcd for 293.042 0)，結合1H和13C數據，確定其分子式為C15H10O5。1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.86(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，H-6′)，6.93(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，H-5′)，6.60(1H，s，H-3)，6.46(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.21(1H，d，J=1.8 Hz，H-6)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ：183.9(C-4)，166.3(C-2)，166.0(C-7)，163.2(C-9)，162.8(C-4′)，159.4(C-5)，129.5(C-2′)，129.5(C-6′)，123.2(C-1′)，117.0(C-3′)，117.0(C-5′)，105.3(C-10)，103.8(C-3)，100.1(C-6)，95.0(C-8)。以上數據與文獻報道基本一致[21]，故鑒定化合物8為芹菜素。

化合物9黃色無定型狀粉末(甲醇)，易溶于甲醇;HR-ESI-MS：m/z287.055 1 [M+H]+(calcd for 287.055 0)，結合1H和13C數據，確定其分子式為C15H10O6。1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ：8.09(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，H-6′)，6.90(2H，d，J=8.4Hz，H-3′，H-5′)，6.40(1H，br s，H-8)，6.19(1H，br s，H-6)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ：177.4(C-4)，165.6(C-7)，162.5(C-5)，160.6(C-4′)，158.3(C-9)，148.1(C-2)，137.2(C-3)，130.7(C-2′/6′)，123.7(C-1′)，116.3(C-3′/5′)，104.5(C-10)，99.3(C-6)，94.4(C-8)。以上數據與文獻報道基本一致[22]，故鑒定化合物9為山奈酚。

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性測試

本實驗采用PNPG法對從小花杜鵑中分離得到的部分單體化合物進行體外α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選。結果表明化合物8和9具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，且具有一定的劑量依賴性，其IC50值分別為57.51±6.35、54.70±3.67 μM(陽性對照藥阿卡波糖的IC50值為3.07 nM)?；衔?由于分離得到的量少未對其進行活性測試，化合物1和3～7對α-葡萄糖苷酶均未表現出明顯抑制活性。

3 結論

本實驗對小花杜鵑95%乙醇提取物的化學成分及其體外α-葡萄糖苷酶抑制活性進行研究，從中分離鑒定了9個化合物，化合物的主要類型包括木脂素、黃酮以及酚類化合物。其中，化合物1是一個天然產物中比較罕見的苯駢呋喃型降木脂素，化合物2是一個新的苯二氫化萘型木脂素，其余化合物均為首次從小花杜鵑中分離得到。采用PNPG法對除化合物2外的其余8個化合物進行了α-葡萄糖苷酶抑制活性測試，結果表明化合物8和9具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，實驗所得結論與其他研究文獻[23,24]報道相接近，由此推測芹菜素和山奈酚是小花杜鵑發(fā)揮體外降糖活性的重要物質基礎之一。本實驗首次開展了小花杜鵑化學成分和α-葡萄糖苷酶抑制活性研究，為小花杜鵑的植物化學資源合理開發(fā)利用提供參考依據。