九味溫灸艾的質量標準研究

楊寶蓮，吳建華，廖洲青

贛州市中醫(yī)院，江西 贛州 341000

九味溫灸艾配方源自元代王好古的《此事難知·易老解利法》的九味羌活湯的化裁方，在熱敏灸理論基礎上，結合贛州市中醫(yī)院（以下簡稱我院）針康科多年的臨床實踐經驗，對該方進行了數次修改優(yōu)化，并最終固定為我院協(xié)定處方，此后逐漸發(fā)展為我院特色中藥制劑。

此方是由艾絨、羌活、沉香、獨活、白芷、細辛、川芎、夏天無等9 味中藥材組成的復方制劑，具有溫經散寒、活血通絡的功效，臨床上用于風寒濕痹、肌肉酸麻、四肢關節(jié)疼痛、脘腹冷痛等癥［1-8］。

但因該協(xié)定處方由針康科醫(yī)師臨用前自行搓制，個體操作差異大，難以對其質量進行有效的控制，且在使用、保管上均極為不便，為此，我們修改了該制劑的生產工藝。鑒于目前該標準缺少定性、定量等實質性控制指標，本研究參考了《中國藥典》2020 年版一部［9］及相關文獻，對九味溫灸艾質量標準進行了研究，采用顯微鑒別法對九味溫灸艾中君藥艾絨進行定性鑒別，使用薄層色譜鑒別川芎和羌活，采用HPLC 法測定九味溫灸艾中指標性成分綠原酸的含量并制訂了含量限度。參照《中國藥典》2020 年版一部要求，對九味溫灸艾的重量差異和水分等項目進行檢查，確保有效控制該產品質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1260 型HPLC 儀（紫外檢測器），超聲波清洗器（深圳冠博科技實業(yè)有限公司），萬分之一電子天平（mettler-toledo 公司），Saikedigital 顯微鏡，卡瑪薄層色譜數碼成像系統(tǒng)。

1.2 藥品與試劑

對照品：綠原酸（批號：110753-201817，含量96.8%），羌活醇（批號：111820-201705，含量99.9%），異歐前胡素（批號：110827-201812，含量99.6%）。對照藥材：羌活（批號：120935-201809），川芎（批號：120918-201813）。以上對照品/藥材均采購自中國食品藥品檢定研究院。九味溫灸艾（贛州市中醫(yī)院制劑室，批號20200301、20200302、20200303，規(guī)格：每支重28 g）。硅膠G 板（青島海洋，0.20～0.25 mm）。乙腈（色譜純）、水（超純水），其余試劑（分析純）。

2 方法與結果

2.1 鑒別

2.1.1 艾絨的顯微鑒別 取樣品粉末，用水合氯醛裝片，置顯微鏡下觀測：可見T 形毛，頂端長而彎曲，柄2～4 細胞。見圖1。

圖1 艾絨顯微鑒別圖（×400）：A.批號20 200301；B.批號20 200302；C.批號20200303。

2.1.2 川芎的TLC 鑒別 取3 批樣品各約10 g，分別加入乙醚100 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯2 mL 使溶解，即得供試品溶液；另取川芎對照藥材0.5 g 及缺川芎陰性樣品適量，同法制成對照藥材溶液及缺川芎陰性溶液。

吸取上述5 種溶液各10 μL，照TLC 法操作，分別點于同一硅膠G 板上，以正己烷-乙酸乙酯（3∶1）為展開劑，展開，取出后晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的主斑點，斑點清晰，分離良好，陰性樣品無干擾。經方法學驗證，重現性良好，見圖2。

圖2 九味溫灸艾中川芎TLC圖

2.1.3 羌活的TLC 鑒別 取3 批樣品各約10 g，分別加入乙醚100 mL，超聲提取30 min，濾過，濾液揮干，殘渣加三氯甲烷1.5 mL 使溶解，得供試品溶液；另取羌活對照藥材0.5 g 及缺羌活陰性樣品適量，同法制成對照藥材溶液及缺羌活陰性溶液；再取羌活醇對照品、異歐前胡素對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每l mL 各含羌活醇、異歐前胡素1 mg 的對照品溶液。

吸取上述7 種溶液各2 μL，照TLC 法操作，分別點于同一硅膠G 板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（3∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴上1%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的主斑點，斑點清晰，分離良好，陰性樣品無干擾。經方法學驗證，重現性良好，見圖3。

圖3 九味溫灸艾中羌活TLC圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 Agilent C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相采用乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），按表1 進行梯度洗脫，流速1 mL/min；檢測波長327 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

表1 色譜梯度洗脫

2.2.2 溶液的制備 （1）對照品溶液的制備：精密稱取綠原酸對照品10.24 mg，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成濃度為19.824 6 μg/mL 的溶液，搖勻，即得。（2）供試品溶液制備：取樣品約0.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲提?。üβ?50 W，頻率40 kHz）30 min 后，取出放冷，再用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾后取續(xù)濾液，即得。（3）缺艾絨陰性溶液的制備：取缺艾絨陰性樣品同供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

2.2.3 方法學考察

（1）系統(tǒng)適應性試驗。取對照品溶液、供試品溶液和缺艾絨陰性溶液，按“2.2.1”項下色譜條件檢測，記錄色譜圖。綠原酸的保留時間約在13.7 min，能與其他各峰基線達到較好分離，且缺艾絨陰性溶液無干擾。見圖4。

圖4 HPLC色譜圖：A.綠原酸對照品溶液；B.供試品溶液；C.缺艾絨陰性溶液

（2）線性關系考察。分別量取綠原酸對照品溶液（濃度為39.649 3 μg/mL）1 mL、2.5 mL、4 mL、5 mL、7.5 mL、10 mL 置10 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。分別精密吸取上述溶液各20 μL，注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，以濃度（μg/mL）為橫坐標、峰面積為縱坐標做線性回歸，其回歸方程為：Y=76.078X-1.341 4，r=0.999 9，線性范圍為3.964 9～39.649 3 μg/mL。

（3）精密度試驗。取對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次并記錄色譜圖，計算得出綠原酸峰面積RSD為0.97%，顯示儀器精密度較好。

（4）重復性試驗。取九味溫灸艾樣品（批號：20200301）6 份，按上述“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，得出綠原酸含量RSD 為0.52%，顯示此法重復性較好。

（5）穩(wěn)定性試驗。取供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、18、24 h測定，綠原酸峰面積RSD 為1.95%，表示供試品溶液在24 h 內較穩(wěn)定。

（6）加樣回收率試驗。取九味溫灸艾樣品（批號：20200301，每1 g 含綠原酸0.764 mg）6 份，每份約0.35 g，精密稱定，分別精密加入綠原酸對照品溶液（濃度為0.287 3 mg/mL）1 mL 后揮干，按“2.2.2”項下方法配制加樣回收樣品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，結果見表2。綠原酸回收率在98.92%～99.79%區(qū)間，平均回收率為99.33%，RSD為0.38%，表示本法準確度高。

表2 加樣回收試驗結果

2.2.4 樣品含量測定 取三批九味溫灸艾樣品（規(guī)格：28 g/支），按上述的方法測綠原酸的含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果

2.2.5 樣品含量限度的確定 對我院生產的3 批九味溫灸艾試樣中綠原酸的含量進行檢測，結果平均含量為21.4 mg/支。以平均含量的70%擬定含量限度標準為：本品每支含艾絨以綠原酸（C16H18O9）計，不得少于15.0 mg。三批樣品的含量均符合擬定限度。

3 其他檢查

參照《中國藥典》2020 年版要求對樣品重量差異、水分等項目進行檢查，結果均符合規(guī)定。

4 討論

本研究對處方中的九味藥材均進行了薄層鑒別研究，由于沉香、獨活、白芷、細辛、夏天無和制遠志等六味藥材薄層鑒別不夠成熟，有待今后進一步研究，暫未列入擬定標準；艾絨的顯微鑒別及羌活、川芎薄層鑒別方法重現性好、陰性無干擾，可作為質量控制指標。本研究利用高效液相色譜法建立了艾絨中綠原酸的含量測定方法,結果顯示，方法學各項指標考察均符合中藥指導原則的要求，說明該方法可操作性強、專屬性好、準確度高、穩(wěn)定可靠，可為九味溫灸艾的質量控制提供參考。