納豆中抗氧化肽的分離純化與活性研究

張豐文 周麗亞 董超 史延茂

（1. 河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300401；2. 河北省科學(xué)院生物研究所，石家莊 050081）

傳統(tǒng)的抗氧化物有維生素C、二丁基羥基甲苯（BHT）等，可以延緩衰老，在某些疾病的治療方面有著重要的輔助作用。隨著生物健康產(chǎn)業(yè)的深入研究發(fā)現(xiàn)，生物活性肽也具有抗氧化和清除自由基的作用，包括肌肽、玉米肽、大豆肽、菜籽肽和海洋生物活性肽等，如王禹程等［1］從菜籽粕中提取了菜籽肽；姜源等［2］利用酶解法從玉米蛋白粉中提取了玉米五肽。這些生物活性肽原料充足，加工工藝簡單，整體生產(chǎn)成本可控，是目前功能性食品領(lǐng)域的一個研究和應(yīng)用熱點。大豆抗氧化活性肽（soybean antioxidative peptide）是大豆蛋白水解產(chǎn)物中具有抗氧化功效的多肽，溶解度高，黏度低，穩(wěn)定性好［3］。人體攝入后，可以在一定程度上消除機體內(nèi)多種生理功能的障礙，如大豆肽可阻礙脂肪的吸收和促進脂肪分解代謝、降低總膽固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）含量，提高高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）含量，大豆肽通過阻止腸道內(nèi)膽固醇的重吸收，并促使其排出體外而降低血清膽固醇的水平［4］。大豆肽還可延緩機體的衰老，如徐天等［5］研究發(fā)現(xiàn)，自由取食含有大豆低聚肽和大豆低聚糖的桑葉的家蠶，其幼蟲期和成蟲期的平均壽命和最高壽命都有顯著的延長?？梢?，大豆肽在抗衰老方面有著重要的運用。目前國內(nèi)外對大豆肽的制備方法主要集中在酶解法，如曾婷和馬福建等［6］用5種不同的酶水解豆粕發(fā)現(xiàn)，對大豆球蛋白水解效果較好的酶為胰蛋白酶。de Castro等［7］采用多種微生物蛋白酶水解大豆分離蛋白，結(jié)果表明大豆分離蛋白肽抗氧化活性比水解前提高了7倍。de Oliveira等［8］采用蛋白酶組合方法水解大豆分離蛋白，能有效提高其抗氧化活性、乳化活性及起泡能力。利用生物工程技術(shù)對大豆蛋白進行發(fā)酵分解也是制備抗氧化肽的方法之一，如Amadou等［9］利用植物乳酸桿菌Lp6發(fā)酵脫脂大豆，獲得5種抗氧化活性較強的多肽。Chi等［10］測定了芽孢桿菌、乳酸菌及酵母菌發(fā)酵脫脂大豆后的抗氧化活性，其中芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性最強，酵母菌和乳酸菌發(fā)酵前后都沒有明顯改變。大豆發(fā)酵后的多肽抗氧化活性與其分子量、氨基酸成分以及空間結(jié)構(gòu)相關(guān)，但是大多數(shù)研究只是針對一個小肽進行驗證研究，對氨基酸成分和空間結(jié)構(gòu)研究較少。

本研究以由納豆芽孢桿菌發(fā)酵大豆后的納豆為原料發(fā)現(xiàn)，納豆中多肽抗氧化活性有所提高，推測與多肽的生成相關(guān)，并利用柱層析分離純化納豆多肽混合物并用LC-MS/MS技術(shù)，對納豆中的抗氧化肽進行了氨基酸序列鑒定，來探究抗氧化肽活性增強的原因，旨為進一步研究納豆抗氧化肽的性質(zhì)和食用功能性開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 納豆粉由河北省科學(xué)院生物研究 所 提 供；Na2HPO4·10H2O、KH2PO4、Na2CO3和DPPH等所有試劑均為國藥集團的AR純，甲醇、乙腈等試劑均為進口色譜純。T-AOC試劑盒（FRAP法）來自南京建成生物工程研究所；葡聚糖凝膠G50來自武漢匯研生物科技有限公司。

1.1.2 儀器 毛細(xì)管高效液相色譜儀（Thermo Fisher Scientific）（美國）；電噴霧-組合型離子阱Orbitrap質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific）（美國）；AKTA purifier10（美國GE公司）；液相色譜儀LC-20A（日本島津有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 納豆抗氧化活性肽的制備 取納豆粉10 g，溶于200 mL的PBS緩沖液中，在4℃下10 000 r/min高速離心30 min后，取上清液用50 kD超濾膜超濾，取分子量小于50 kD的部分分小管凍存。

1.2.2 納豆Tricine-SDS-PAGE電泳 參考 Schagger［11］報道的方法并略做修改。電泳條件：16.5%的分離膠、10%的間隙膠和4%的濃縮膠，樣品與4×樣緩沖液混合，每個凝膠孔里加入20 μL樣品，先在80V電壓下跑30 min，然后調(diào)到120V電壓下跑2h。電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍染色處理膠片，用去離子水脫色。

1.2.3 納豆抗氧化肽的分離純化 凝膠過濾色譜分離：將粗提液經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜過濾后，將Sephadex G-50凝膠柱連接到AKTA儀器進行分離純化。色譜分離條件為：進樣量為1 mL，以磷酸鹽緩沖液作為洗脫液，洗脫液流速1.0 mL/min，在波長280 nm處收集各分離峰組分，多次收集，冷凍干燥后測定其抗氧化活性。

RP-HPLC分離：取上一步分子篩層析分離所得抗氧化活性最高的組分，采用反相高效液相色譜C18半制備柱以進一步分離純化。色譜分離條件為：色譜柱：ShamiduC18（5 μm×150 mm），進樣量5 mL，流動相A為0.1%TFA水溶液，流動相B為含0.1%TFA的乙腈，流速為5 mL/min，柱溫30℃，檢測波長為280 nm，洗脫條件如表1。多次重復(fù)進樣收集各分離峰，對各組分進行濃縮。調(diào)整多肽濃度至0.1 mg/mL，比較DPPH自由基清除能力。

表1 半制備RP-HPLC的洗脫條件Table 1 Elution conditions of semi preparative RP-HPLC

1.2.4 LC-MS/MS法鑒定抗氧化肽氨基酸序列 通過Semi-HPLC分離后的抗氧化肽樣品應(yīng)用LC-MS/MS法進行分析。分析柱：150 μm×150 mm，packed with Acclaim PepMap RPLC C18，1.9 μm，100?；流動相A：0.1%甲酸，2% CAN；流動相B：0.1%甲酸，80% CAN；洗脫條件如表2，流速600 NL/min。

表2 洗脫時間表Table 2 Elution schedule

質(zhì)譜條件：一級質(zhì)譜參數(shù)：分辨率 70 000；自動增益控制目標(biāo)（AGCtarget）3×106；最大駐留時間：40 ms；掃描范圍 100-15 00 m/z；二級質(zhì)譜參數(shù)：分辨率 17 500；自動增益控制目標(biāo) 1×105；最大駐留時間：60 ms；TopN 20；NCE/steppedNCE 27。

1.2.5 抗氧化活性的測定 FRAP測定還原力［12］：操作方法根據(jù)南京建成生物研究所總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒說明書，每個樣品作3個平行試驗。以硫酸亞鐵為標(biāo)準(zhǔn)物，得到線性方程y=0.301 3x-0.018 5，R2=0.999 9。樣品中的總抗氧化活性通過該方程計算得到。

DPPH清除能力實驗：用無水乙醇配制1×10-4mol/L DPPH溶液，取0.5 mL樣品和3.5 mL DPPH 溶液混合，避光靜置30 min，檢測波長517 nm，分光光度計測定OD值，DPPH清除能力按照下述公式進行計算，并以0.5 mL的無水乙醇做空白對照［13］。

式中：A1為樣品加入DPPH 溶液后的OD值；A2為樣品溶液的OD值；A3為乙醇加入DPPH溶液（空白對照）的OD值。

1.2.6 樣品中蛋白濃度的測定 利用Braford法對樣品中的總蛋白含量進行測定。先配制一系列濃度梯度的BSA溶液，在96孔板每個孔中加入20 μL樣品，然后在每個孔里加入200 μL的考馬斯染液。在室溫下充分混勻，放置5 min，在595 nm波長下檢測吸光度。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品進行測試，并得到線性方程y=0.002 1x-0.007 2，R2=0.994 0。樣品中的總蛋白含量通過該方程計算得到。

1.2.7 G1中肽段的合成及活性驗證 杭州專肽生物公司合成，活性測定采用DPPH清除率的方法。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)均由平行測試得到，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。顯著性差異通過GraphPad Prism 7的ANOVA-Tukey 計算得到，P＜0.05 表示結(jié)果具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 蛋白濃度的測定及Tricine-SDS-PAGE電泳圖

通過實驗，得到線性方程y=0.002 1x-0.007 2，R2=0.994 0。將測得的粗提液吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得納豆粗提液蛋白濃度為0.37 mg/mL。大豆發(fā)酵前后的蛋白分子量變化如圖1所示，發(fā)酵前蛋白的分子量大多在20 kD-66 kD之間，而發(fā)酵后大多集中在20 kD以下。由此可見，發(fā)酵后形成的多為小于20 kD的肽段。

圖1 Tricine-SDS-PAGE電泳圖Fig. 1 Tricine SDS PAGE electrophoretogram

2.2 凝膠過濾色譜分離及各組分活性分析

選擇制備好的納豆上清液予以分離純化，圖2為納豆提取上清液的凝膠過濾分離色譜圖。經(jīng)凝膠過濾分離后，主要富集得到3個組分峰，分別標(biāo)記為F1、F2和F3，其中F1組分出峰時間最早，表明其分子量最大，F(xiàn)3組分出峰時間最晚，表明其分子質(zhì)量最小。

圖2 SephadexG-50凝膠層析圖譜Fig. 2 SephadexG-50 chromatogram

將凝膠色譜分離所得各組分峰收集后冷凍干燥，分別溶于1 mL超純水中，結(jié)果如表3所示。比較各組分的FRAP值，F(xiàn)3組分的還原力顯著高于（P＜ 0.05）其它各組分，其值高達（8.4±0.6）mmol/g。綜合上述抗氧化活性結(jié)果可知，F(xiàn)3組分的抗氧化活性最強，可予以進一步分離純化，富集出高活性抗氧化肽。

表3 SephadexG-50組分抗氧化活性Table 3 Antioxidant activities of fractions from SephadexG-50 column

2.3 反相高效液相色譜（RP-HPLC）進一步分離及各組分的抗氧化活性

如圖3所示，0-15 min內(nèi)和60 min后出現(xiàn)的是溶劑峰，而樣品峰主要集中在20-60 min內(nèi)，樣品峰中存在較多雜峰，說明經(jīng)G50純化后樣品純度較低，根據(jù)各峰的分離效果和響應(yīng)值大小，收集4個主要的洗脫峰G1、G2、G3和G4，各洗脫峰的保留時間分別為20.87 min、25.3 min、37.0 min和42.4 min，洗脫峰與總峰面積比分別為6.44%、2.45%、17.59%和5.30%。從中可以看出G1、G3峰面積占比較大，從而推斷G1、G3組分含量高，且響應(yīng)值較高，可能為主要的效應(yīng)物質(zhì)，因此選擇收集G1和G3組分。

圖 3 F3 組分的 RP-HPLC圖Fig. 3 RP-HPLC analysis of fraction F3

多次收集G1和G3，冷凍干燥，用超純水溶解，濃縮成1 mg/mL的質(zhì)量濃度溶液，比較G1和G3的DPPH清除率。從圖4中可以看出G1組分的清除率顯著性高于（P＜ 0.05）G3組分，其清除率高達32.67%。綜上述可知，組分G1的抗氧化活性最強，可用于后續(xù)的質(zhì)譜鑒定和結(jié)構(gòu)分析。

圖 4 G1和G3的DPPH清除率Fig. 4 DPPH scavenging rates of G1 and G3

2.4 LC-MS/MS法鑒定抗氧化肽氨基酸序列

使用LC-MS/MS對G1進行肽序列鑒定，肽段斷裂之后形成的二級質(zhì)譜圖如圖5所示，橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比，縱坐標(biāo)為強度。圖中的各峰代表母離子斷裂成b、y離子形成的碎片離子峰，斷裂模式為HCD。圖5-A中y2代表PA離子，y3代表IPA離子，Y3-Y2的質(zhì)量差與異亮氨酸Ile相符，同理b2代表斷裂后的RA離子，b3代表斷裂后的RAE兩離子峰的質(zhì)量差與谷氨酸相符，依次類推就可得到氨基酸的序列為RAELSEDVFVIPA。每個質(zhì)譜圖右上角的數(shù)字代表了該肽段的斷裂方式，以及所能形成的b、y離子。

圖5 G1的各肽段二級質(zhì)譜圖Fig. 5 Secondary mass spectra of G1 peptides

FEEINRVLL、SLLNALPEEVIQH有Leu-Leu重復(fù)序列，與此研究結(jié)果一致，表明疏水性氨基酸對抗氧化活性的影響較大。如表4所示，G1的各肽段信息如下。從中可以看出其分子量在0.5-1.5 kD之間，與之前的凝膠過濾比分子量小了很多。

表4 G1的各肽段信息Table 4 Peptide information of G1

2.5 合成肽的驗證及抗氧化活性分析

稱取適量的多肽進行溶解，得到2.5 mg/mL的溶液。采用DPPH·清除率的方法對其進行測定，結(jié)果如圖6所示，其中肽段7的活性最強；其次是肽段10，分別為42.66%和31.02%。其中肽段7比起肽段10不同的是含有色氨酸，從實驗結(jié)果看，應(yīng)該是色氨酸起了增強活性的作用。

圖 6 各肽段抗氧化活性Fig. 6 Antioxidant activity of each peptide segment

3 討論

對納豆中的多肽成分進行一系列分離純化取得G1和G3組分，質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，DPPH自由基清除率分別為32.67%、10.67%，其中G1組分抗氧化活性最高。用ESI-MS/MS鑒定出了組分G1中含量最高的10種多肽，其中肽段7在IC50（2.5 mg/mL）時的DPPH清除率為46.66%，與合成的菜籽抗氧化肽 WDHHAPQLR的DPPH自由基清除率IC50（0.91 mg/mL）相比，活性較低。

一些研究表明氨基酸組成對多肽抗氧化活性起到關(guān)鍵性作用，氨基酸結(jié)構(gòu)是抗氧化肽的活性位點。例如，Agrawal等［14］從米粟蛋白酶解產(chǎn)物中分離純化出一條新型的抗氧化活性多肽序列SDRDLLGPNNQYLPK，分析結(jié)果表明，疏水氨基酸包括甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）以及亮氨酸（Leu）等的含量較高，同時序列里重復(fù)出現(xiàn) Leu-Leu，推測Gly、Pro和Leu可能是活性位點。Ghassem等［15］認(rèn)為含苯環(huán)的氨基酸（如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）能夠為自由基提供質(zhì)子，減緩自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，此類氨基酸能夠通過共振作用維持自身穩(wěn)定。張暉等［16］認(rèn)為堿性氨基中的賴氨酸是電子受體，能夠接受不飽和脂肪酸氧化過程中產(chǎn)生的自由基的電子，還有組氨酸中咪唑基的降解，使得其也具有自由基清除能力。該研究結(jié)果顯示含有疏水性氨基酸的多肽具有較高的自由基清除能力，主要包括亮氨酸（Leu）、纈氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）。例如，經(jīng)鑒定出的肽段FEEINRVLL、SLLNALPEEVIQH有Leu-Leu重復(fù)序列，與Agrawal的研究結(jié)果一致。

目前所研究的抗氧化肽大多是少于20個氨基酸殘基的分子，且分子質(zhì)量小于6 kD［17］。Li等［18］的研究表明，具有強抗氧化活性的肽的分子質(zhì)量分布在0.5-1.5 kD之間。Moure等［19］研究的豆渣蛋白水解產(chǎn)物的4個不同分子質(zhì)量組分（5-10 kD、10-30 kD、30-50 kD和＞50 kD）中，低分子質(zhì)量組分具有較高的抗氧化活性，分子質(zhì)量＞10 kD的組分抗氧化活性最低。Chen等［20］水解大豆7S蛋白，獲得6種多肽，其分子量＜1 kD的組分抗氧化活性較強。本實驗的抗氧化肽分子量在0.4-1.5 kD之間，由3-14個氨基酸組成，其中肽段RAELSEDDVFVIPA的相對豐度最高。

另外，本實驗用超微液相（UHPLC/Nano LC）與二級質(zhì)譜（Orbitrap-Orbitrap等）聯(lián)用技術(shù)，對多肽氨基酸序列實現(xiàn)了高靈敏度、高分辨率的測定。高分辨率質(zhì)譜的是多肽鑒定的重要技術(shù)手段，如Liu等［21］采用電噴霧-四級桿飛行時間質(zhì)譜（LC-ESIQ-TOF）技術(shù)從榛子蛋白水解產(chǎn)物中鑒定出6種抗氧化多肽序列，分別為ADGF、AGGF、ETTL、SGAF、AWDPE和DWDPK，得出含有色氨酸的肽段活性最強。本研究從納豆水解上清液中鑒定出了10種抗氧化肽，其氨基酸序列為RAELSEDDVFVIPA、LSEDDVFVIPA、DVFRAIPSEVL、FEEINRVLL、SLLNALPEEVIQH、LAVLI、SFEWVLEH、GIFGM、QVFL和FPF；其分子量分布范圍為0.4-1.6 kD。經(jīng)過Uniport查庫分析，這些肽段大多來自7S球蛋白（β-伴大豆球蛋白）和11S球蛋白（大豆球蛋白），也是納豆芽孢桿菌的發(fā)酵過程中蛋白酶主要分解原料。

4 結(jié)論

本研究探索了納豆中抗氧化肽的分離純化方法，利用分子篩層析和高效液相色譜分離純化得到4個組分（G1、G2、G3和G4），選取含量最高的G1和G3進行DPPH清除率測定，其中G1組分抗氧化活性最強，質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時，DPPH 自由基清除率達到32.67%，利用ESI-MS/MS對G1組分抗氧化肽進行一級序列鑒定，得到含量最高和活性最強的10種抗氧化肽序列，其序列為RAELSEDDVFVIPA、LSEDDVFVIPA、DVFRAIPSEVL、FEEINRVLL、SLLNALPEEVIQH、LAVLI、SFEWVLEH、GIFGM、QVFL、FPF，得出SFEWVLEH的活性最強，其DPPH清除率為46.66%。