白及根腐病植株根際土壤微生物群落組成特征分析

趙林艷 官會(huì)林 向萍 李澤誠 柏雨龍 宋洪川 孫世中 徐武美

（1. 云南師范大學(xué) 高原特色中藥材種植土壤質(zhì)量演變退化與修復(fù)云南省野外科學(xué)觀測研究站，昆明 650500；2. 西南林業(yè)大學(xué)環(huán)境修復(fù)與健康研究院，昆明 650224；3. 昆明英武農(nóng)業(yè)科技有限公司，昆明 650500）

白及（Bletilla striata）為蘭科白及屬多年生草本植物，具有收斂止血、消腫生肌等功效，常用于咳血吐血、外傷止血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂、燙灼傷、肛裂等疾?。?］。我國有4種白及屬植物，其分布區(qū)北起江蘇、河南，南至我國臺(tái)灣，東起浙江，西至西藏東南部。白及人工種植區(qū)主要位于云南、貴州、四川等地，其中云南種植面積最大，約占全國種植面積的42%［2-3］。隨著白及種植年限的增加，土壤致病菌的積累也相應(yīng)增加，植物病害較為嚴(yán)重，特別是根腐病，以植物地下部分腐爛為特征，具體表現(xiàn)為塊莖呈水漬狀腐爛，隨后擴(kuò)散至根部，使其發(fā)黑壞死，葉片出現(xiàn)褐色長型枯斑，最終導(dǎo)致全株枯死［4］，嚴(yán)重影響白及產(chǎn)量與經(jīng)濟(jì)效益。

根腐病是根莖類藥用植物栽培過程中的一類高發(fā)病害，其致病因素較為復(fù)雜。病原真菌被認(rèn)為是導(dǎo)致根腐病的主要原因之一［5］。廖作清等［6］研究發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、腐皮鐮刀菌（F.solani）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、惡疫霉病菌（Phytophthora cactorum）等病原真菌可引起三七根腐?。划呂涞龋?］發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌、人參銹腐病菌（Cylindrocarpon destructans）等會(huì)導(dǎo)致西洋參根腐病。已有研究證實(shí)有絲核菌屬（Rhizoctonia）和腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）可導(dǎo)致白及根腐?。?-9］，但尚未發(fā)現(xiàn)更多與白及根腐病相關(guān)的病原微生物。

根際微生物群落組成特征對(duì)作物營養(yǎng)、生長與抗病害等均具有重要影響［10-11］。根際微生物多樣性、相對(duì)豐度與植物病害有著密切關(guān)聯(lián)性［12-13］，如黃芪根際土壤細(xì)菌群落多樣性降低會(huì)加重根腐病害，且在發(fā)病黃芪根際土壤中有益微生物豐度也呈下降趨勢［14］。同樣，大蒜根腐病發(fā)病土壤中細(xì)菌多樣性降低，鐮刀菌屬（Fusarium）和匍柄霉菌屬（Stemphylium）等病原真菌相對(duì)豐度增加，而硝化螺旋菌屬（Nitrospira）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、木霉屬（Trichoderma）等有益微生物相對(duì)豐度降低［15］。Wu等［16］研究發(fā)現(xiàn)，根腐三七根際土壤微生物群落與健康植株相比有明顯差異，其中患病三七根際土壤中放線菌、革蘭氏陽性菌、叢枝菌根真菌等的相對(duì)豐度顯著降低。此外，研究還發(fā)現(xiàn)西洋參根腐病株根際土壤真菌豐度顯著低于健康植株，且紅游動(dòng)菌屬（Rhodoplanes）、Kaistobacter、鞘脂菌屬（Sphingobium）等的相對(duì)豐度與西洋參根腐病害呈正相關(guān)［17-18］。然而，針對(duì)白及根腐病植株根際土壤微生物群落組成特征相關(guān)研究還未見報(bào)道。因此，本研究利用高通量測序技術(shù)分析了白及根腐病與健康植株根際土壤微生物群落組成與變化特征，并對(duì)土壤理化性質(zhì)與酶活性進(jìn)行了定量分析，旨在為了解白及根腐病發(fā)病機(jī)理，科學(xué)應(yīng)對(duì)白及根腐病害，提高白及產(chǎn)量與經(jīng)濟(jì)效益提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

白及根際土壤樣品采自位于昆明市呈貢新區(qū)的昆明英武農(nóng)業(yè)科技有限公司科研基地，土壤類型為旱地紅壤，白及連作8年。白及品種為廣泛栽種的三叉白及，產(chǎn)量高、具有較強(qiáng)的耐寒性，其田間種植密度為50株/m2。按照隨機(jī)均衡原則，在科研基地內(nèi)選擇已移栽2年的根腐發(fā)病和健康白及各5株，利用無菌試管采集粘附在根莖上的土壤，隨即保存于-80℃超低溫冰箱，用于微生物群落分析，并采集距離根莖3 cm內(nèi)的土樣，去除石礫、殘根等雜物，自然風(fēng)干用于土壤理化性質(zhì)與酶活性分析。

1.2 方法

1.2.1 土壤DNA的提取與高通量測序 稱取1 g白及根際土壤，用DNA提取試劑盒（NucleoSpin Kit，Macherey-Nagel GmbH，Germany）提取樣品總DNA。使 用 引 物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′） 對(duì)細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對(duì) 真 菌ITS片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用AMPure XP試 劑 盒（Beckman Coulter Life Sciences，USA）和QuantiFluorTM-ST熒光定量系統(tǒng)（Promega，USA）進(jìn)行純化和定量，利用Illumina HiSeq 2500 PE250進(jìn)行高通量測序。

1.2.2 土壤理化性質(zhì)與酶活性的測定 土壤自然風(fēng)干后研磨過20目和100目篩，分別用于理化性質(zhì)和酶活性的測定。土壤理化性質(zhì)的測定方法參照《土壤農(nóng)化分析》［19］：土壤pH使用pH計(jì)（雷磁PHS-25）測定；電導(dǎo)率使用EC計(jì)（COMBI 5000）測定；氨態(tài)氮（NH4+-N）和硝態(tài)氮（NO3--N）含量使用連續(xù)流動(dòng)分析儀（Seal Analytical AA3）測定；有效磷（AP）含量使用鉬銻抗比色法，結(jié)合紫外可見分光光度計(jì)（元析UV-8000）測定；有效鉀（AK）含量使用連續(xù)流動(dòng)火焰分光光度計(jì)（AA3，Model 410）測定；有機(jī)質(zhì)含量使用濃硫酸-重鉻酸鉀溶液消解法，用硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定。土壤脲酶和蔗糖酶活性，分別用3，5-二硝基水楊酸比色法與靛酚藍(lán)比色法進(jìn)行測定［20］；磷酸酶活性用磷酸苯二鈉比色法進(jìn)行測定［21］；蛋白酶活性用茚三酮比色法進(jìn)行測定［22］。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 利用FLASH V1.2.7［23］和Trimmomatic［24］軟件對(duì)Illumina HiSeq雙端測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接與過濾，使用UCHIME v4.2［25］去除嵌合體，并用UPARSE［26］軟件按97%的序列相似性獲得OTU（operational taxonomic units）。使用RDP軟件以細(xì)菌16S rRNA Silva數(shù) 據(jù) 庫（http://www.arb-silva.de）和真菌ITS UNITE數(shù)據(jù)庫（https://unite.ut.ee/）為參照對(duì)不同OTU的代表性序列進(jìn)行分類學(xué)注釋。使用MOTHUR［27］軟件計(jì)算各土樣微生物OTU豐富度、Chao1與Shannon多樣性指數(shù)。

基于Bray-Curtis距離指數(shù)在OTU分類水平進(jìn)行不同微生物群落的UPGMA聚類分析，并利用冗余分析（RDA）探索健康與根腐白及根際土壤微生物群落的分化。利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析不同土壤因子的差異顯著性。以上分析利用R軟件包“vegan”［28-29］與SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL）進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 根腐病對(duì)白及根際微生物群落組成的影響

門水平上，Ascomycota和Mortierellomycota為白及根際土壤優(yōu)勢真菌類群，在發(fā)病組中的占比為73.43%和11.78%（表1），Ascomycota相對(duì)豐度顯著高于健康組（40.92%），而Mortierellomycota相對(duì)豐度顯著低于健康組（42.50%）。Proteobacteria和Bacteroidetes為優(yōu)勢細(xì)菌類群，在發(fā)病組中的占比分別為24.71%和28.24%，在健康組中的占比分別為28.36%和22.57%，無顯著差異。屬水平上，發(fā)病組Fusarium、Erysiphe等真菌的相對(duì)豐度顯著高于健康組，而Microscypha、Hannaella等真菌的相對(duì)豐度顯著降低（圖1）。發(fā)病組中，Akkermansia、IMCC26134與Larkinella等細(xì)菌的相對(duì)豐度顯著低。

圖1 白及根腐病和健康植株根際土壤微生物屬分類水平的相對(duì)豐度Fig. 1 Relative abundance of rhizospheric microorganisms at the genus level in the rhizospheric soils of root-rot and healthy B. striata

表1 白及根腐病和健康植株根際土壤微生物門水平的相對(duì)豐度Table 1 Relative abundance of microorganisms at the phylum level in the rhizospheric soils of root-rot and healthy B. striata

2.2 根腐病對(duì)白及根際微生物群落alpha多樣性的影響

原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、過濾與嵌合體檢測，并按97%的序列相似性進(jìn)行劃分，共得到真菌OTU 924個(gè)，隸屬于9門、24綱、60目、120科、207屬與214種，得到細(xì)菌OTU 1 690個(gè)，隸屬于25門、65綱、139目、227科、451屬與476種。根腐白及根際土壤中特有真菌和細(xì)菌的OTU數(shù)為 82和1個(gè)，而健康植株根際土壤特有真菌和細(xì)菌的OTU數(shù)為18和2個(gè)（圖2），表明與健康植株相比較，根腐白及根際土壤真菌群落差異較大，而細(xì)菌群落組成差異相對(duì)較小。根腐白及根際土壤真菌OTU豐富度顯著高于健康植株，而細(xì)菌OTU豐富度無顯著差異，表明白及患根腐病后，真菌alpha多樣性呈升高趨勢（表2）。

表2 白及根腐病和健康植株根際土壤微生物群落alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity of microbial community in the rhizospheric soils of root-rot and healthy B. striata

圖2 白及根腐病和健康植株根際土壤共有和特有的OTU數(shù)量Fig. 2 Numbers of shared and unique OTUs in the rhizospheric soils of root-rot and healthy B. striata

2.3 根腐病對(duì)白及根際微生物群落beta多樣性的影響

UPGMA聚類分析表明，發(fā)病組與健康組土壤真菌和細(xì)菌群落具有明顯聚類特征（圖3-a，c），冗余分析表明，發(fā)病組與健康組真菌群落在第二排序軸具有明顯的分化特征（圖3-b），而細(xì)菌群落在第一排序軸具有明顯的分化特征（圖3-d）；與細(xì)菌群落相比較，真菌群落分化更明顯。

圖3 基于聚類與冗余分析的白及根腐病和健康植株根際土壤微生物群落差異特征Fig. 3 Differences in the rhizospheric soil microbial community of root-rot and healthy B.striata based on clustering and redundancy analyses

2.4 白及根腐病和健康植株根際土壤理化性質(zhì)與酶活性

與健康植株相比較，白及根腐病植株根際土壤有效鉀含量較低，pH、有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮與硝態(tài)氮含量較高（P＜0.05），而有效磷含量無顯著差異（P＞0.05）；土壤脲酶、蛋白酶和蔗糖酶的活性較低。因此，土壤養(yǎng)分失衡、酶活性降低可能促進(jìn)了白及根腐病的發(fā)生（表3）。

表3 白及根腐病和健康植株根際土壤理化性質(zhì)與酶活性Table 3 Physicochemical properties and enzyme activities in the rhizospheric soils of root-rot and healthy B.striata

3 討論

土壤微生物在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)和肥力維持等方面發(fā)揮著重要作用，且對(duì)植物健康生長具有直接或間接的影響［30-31］。土壤微生物群落組成特征在一定程度上反映了土壤健康狀況，當(dāng)土壤中病原微生物大量生長，有益微生物數(shù)量減少時(shí)，常引起作物病害的發(fā)生［32-33］。在本研究中，白及根腐病植株根際土壤Fusarium、Erysiph等菌群相對(duì)豐度顯著增加，且與健康植株相比較，真菌和細(xì)菌群落具有明顯的分化特征，表明白及根腐病的發(fā)生與土壤微生物群落組成變化密切相關(guān)。

土壤中存在著大量植物病原真菌，F(xiàn)usarium可引起白及、三七、西洋參等根莖類藥用植物發(fā)生根腐?。?-9］，且這些藥用植物根腐病的發(fā)生伴隨著土壤Fusarium豐度的快速增加。如Dong等［34］研究發(fā)現(xiàn)，三七根腐病致病菌F. oxysporum豐度與三七死亡率呈顯著正相關(guān)，Zhao等［35］研究發(fā)現(xiàn)太子參連作后，根腐病發(fā)病土壤中F. oxysporum豐度顯著高于健康組。本研究發(fā)現(xiàn)，白及發(fā)病土壤中Fusarium豐度顯著升高，可能是引起其根腐病的重要原因。此外，Erysiph豐度也顯著升高，其已證實(shí)是引起多種植物白粉病的關(guān)鍵致病菌［36-37］。同樣，土壤中還存在著許多具有良好生防潛力的有益微生物，如Hannaella coprosmaensis、Subramaniula cristata等可作為生防菌，抑制植物病原真菌的生長［38-39］，Larkinella bovis具有促進(jìn)植物生長的功能［40］。此外，生防菌在土壤中的相對(duì)豐度與植物發(fā)病率呈顯著負(fù)相關(guān)［41］，Liu等［42］研究發(fā)現(xiàn)，在西洋參連作土壤中施加有益微生物叢枝菌根真菌可顯著降低F. oxysporum、F. solani等病原真菌的豐度，并有效促進(jìn)西洋參生長。Zhang等［43］在三七根腐病株根部接種益生菌后，根際土壤中病原菌的相對(duì)豐度顯著降低，并降低了三七的死亡率。在本研究中，白及根腐病植株根際土壤Microscypha、Hannaella等真菌，以及Akkermansia，IMCC26134，Larkinella等細(xì)菌的相對(duì)豐度顯著降低，但其與白及根腐病的關(guān)聯(lián)性尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)健康白及根際土壤脲酶、蛋白酶與蔗糖酶活性和有效鉀含量較高，pH、有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮與硝態(tài)氮含量較低。已有研究表明，隨著白及種植年限的增加，土壤pH升高，有機(jī)質(zhì)含量增加，土壤脲酶和蔗糖酶活性降低［44］，這與本研究結(jié)果相似，表明白及連作可能會(huì)導(dǎo)致土壤養(yǎng)分失衡，酶活性降低。土壤養(yǎng)分失衡會(huì)影響微生物群落組成，營養(yǎng)元素富集可促使病原微生物數(shù)量增加，從而導(dǎo)致植物病害率上升［33，45］。在本研究中，冗余分析表明根腐病組與健康組微生物群落結(jié)構(gòu)具有明顯分化特征，根腐病組具有更高的NH4+-N和NO3--N含量。研究表明，土壤中NH4+-N含量是影響植物根際微生物群落組成的重要因素，常與病原菌豐度呈正相關(guān)［46］。當(dāng)土壤中氮含量較低時(shí)，小麥根腐病發(fā)病率顯著降低，且與鐮刀菌數(shù)量的減少密切相關(guān)［47］。Zhao等［48］研究發(fā)現(xiàn)，施用煙稈炭改善了白及連作土壤理化性質(zhì)與微生物群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了連作地白及的生長。因此，土壤養(yǎng)分失衡與酶活性降低也可能促進(jìn)白及根腐病害的發(fā)生。本研究為理解白及根腐病發(fā)病機(jī)理并針對(duì)性地開展防治措施提供了科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

病原菌積累、微生物群落結(jié)構(gòu)變化、土壤養(yǎng)分失衡與酶活性降低可能是導(dǎo)致白及根腐病害的主要原因，可采取有效措施抑制鐮刀菌、白粉菌等致病菌群的生長，改良土壤理化環(huán)境與微生物群落結(jié)構(gòu)，從而消減白及根腐病害。