腦膜瘤組織中PTTG1、E2F3、EphA2蛋白水平與患者預后的關系研究

張 濤 張利通 羅文凱

腦膜瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，發(fā)病率為7.7例/10萬人[1]。腦膜瘤起源自蛛網(wǎng)膜細胞，通常從低級別腫瘤發(fā)展而來，其多數(shù)癥狀均由局部腫瘤擴張和腫瘤周圍腦水腫引起[2]。腦膜瘤可通過壓迫腦區(qū)或顱神經(jīng)引起神經(jīng)功能缺損。非典型性腦膜瘤與惡性腦膜瘤均具有高侵襲性、易復發(fā)的特點，且手術、放療等治療手段的效果有限[3]。因此，探討腦膜瘤的發(fā)病機制，早期診斷治療對于提高患者的生存質(zhì)量至關重要。垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1(pituitary tumor transforming gene 1，PTTG1)是一種多功能蛋白，參與細胞增殖分化、胚胎發(fā)育和免疫等生理活動，直接參與細胞的有絲分裂和基因調(diào)控，與腫瘤的預后密切相關[4]。E2F轉(zhuǎn)錄因子3(E2F transcription factor 3，E2F3)是E2F的轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞增殖過程，既往研究報道，腦膜瘤的發(fā)生可能與E2F3相關，但需要進一步研究確認[5]。上皮細胞激酶(epithelial cell kinase,EphA2)是受體酪氨酸激酶，能夠調(diào)節(jié)血管生成和遷移，參與組織細胞的增生和凋亡[6]。研究報道， EphA2在腦膜瘤組織中高表達，且與腦膜瘤的分級密切相關[7]。因此，在本研究中我們將探討腦膜瘤組織中垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1(PTTG1)、E2F轉(zhuǎn)錄因子3(E2F3)和上皮細胞激酶(EphA2)蛋白水平與患者預后的關系，以期為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年6月至2020年6月間我院收治的65例手術治療的腦膜瘤患者作為研究對象，其中男性37例，女性28例，年齡為46～67歲，平均年齡(56.3±9.2)歲，病程5～21個月，平均病程(10.3±2.2)個月，腫瘤部位：非顱底37例，顱底28例；根據(jù)WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級標準，其中Ⅰ級40例，Ⅱ級17例，Ⅲ級8 例。手術切除標本后進行病理檢查。選擇同期63例腦膜瘤瘤旁組織(距腫瘤邊緣2 cm以上)為對照組，其中男性30例，女性33例，年齡47～70歲，平均年齡(58.4±10.2)歲，病程3～22個月，平均病程(10.5±2.1)個月。兩組的一般資料無統(tǒng)計學意義。

納入標準：①患者或(直系親屬)簽署知情同意書；②患者術前未進行化療或放療；③預計生存期大于3個月。排除標準：① 嚴重心腦肝腎等器質(zhì)性病變者；②治療期間同步接收其他放化療者；③腫瘤外侵嚴重，手術困難者。

1.2 方法

酶聯(lián)免疫吸附法測定PTTG1：將腦膜瘤組織與癌旁組織解凍，各取0.1 g碾碎呈粉末狀，離心后取上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELLISA)(試劑盒購自上海恒源生物科技有限公司)測定PTTG1蛋白含量。并在V-130B10C高倍鏡(深圳市博視達光學儀器有限公司)下，取5個高倍視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)，并分別計算每個視野下陽性細胞占比，取平均值。將陽性細胞比例分為4級：<10%為0分；10%～40%為1分；40%～70%為2分；≥70%為3分。根據(jù)細胞染色深淺程度分為4級：0分為無著色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。取兩項評分的乘積，0～3分為陰性，其余均為陽性。

免疫組化法測定E2F3：采用免疫組化S-P法(E2F3單克隆抗體購自南京Bioworld Technology公司)測定E2F3。于400倍顯微鏡下隨機選擇5個視野，觀察100個腫瘤細胞中的陽性細胞，根據(jù)陽性表達細胞百分比和染色強度分為陰性(-)、弱陽性(+)、中度陽性(++)和強陽性(+++)，具體方法為：采用雙盲法隨即選取5個高倍視野，無色計為0分，淡黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分；3分或陽性細胞>50%為(+++)，2分或陽性細胞26%～50%為(++)，1分或陽性細胞6%～25%為(+)，0分或≤5%為(-)。

Western Blot法測定EphA2：將腦膜瘤組織與癌旁組織解凍，各取0.1 g碾碎呈粉末狀，破碎離心。取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，加入人EphA2多克隆抗體，孵育過夜后加入二抗孵育，采用ECL化學發(fā)光劑顯影，進行灰度分析測得目的蛋白的相對表達水平，具體方法為：采用Image J軟件，以β-action為內(nèi)參，將目的條帶和內(nèi)參條帶的比值計為蛋白相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料以率(%)表示，采用卡方檢驗。計量資料用(均值±方差)表示，采用t檢驗。P<0.05為有統(tǒng)計學意義。單因素分析采用χ2檢驗，并將P<0.10的因素進一步納入COX回歸模型進行多因素分析。

2 結果

2.1 兩組PTTG1、E2F3、EphA2蛋白表達水平比較

觀察組PTTG1表達水平，E2F3和EphA2表達陽性率顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，具體結果見表1。

表1 兩組PTTG1、E2F3、EphA2蛋白水平比較/例

2.2 腦膜瘤中PTTG1和E2F3表達強度相關因素分析

PTTG1和E2F3在不同病理分級的腦膜瘤間表達具有差異性(P<0.01)，且與病理級別呈正相關(γ=0.521，P<0.05)。不同性別、年齡、部位和大小的腦膜瘤，PTTG1和E2F3表達無差異，具體結果見表2。

表2 PTTG1和E2F3表達與患者臨床病理特征的關系/例

2.3 不同級別腦膜瘤組織中EphA2的水平

免疫組化染色分析顯示，病理分級較高的腦膜瘤中EphA2表達強度顯著增強，與病理分級呈正相關(χ2=28.152，P<0.05)，具體結果見表3。

表3 不同級別腦膜瘤中EphA2的表達強度比較

2.4 PTTG1、E2F3、EphA2蛋白水平與患者的預后分析

PTTG1、E2F3、EphA2蛋白表達陰性組3年無進展生存率顯著高于陽性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，具體結果見表4。

表4 PTTG1、E2F3、EphA2蛋白水平與患者的預后分析(例，%)

3 討論

腦膜瘤是常見的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，占原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的15%左右[8]。隨著外科手術技術的發(fā)展，腦膜瘤的全切手術率顯著提高，但鑒于腦膜瘤的高復發(fā)、轉(zhuǎn)移性，外科手術仍面臨諸多限制。因此，探索腦膜瘤發(fā)生和發(fā)展的分子生物學機制，可能會為腦膜瘤的診斷和治療提供新方法[9]。此外，選擇合適的生物標志物作為特定人群的篩選條件，可能會有有效改善特定人群的預后和生存情況。腫瘤的增殖和侵襲需要血管提供充足的營養(yǎng)，靶向血管新生的機制成為諸多靶向藥物的理論依據(jù)，多靶點的抗腫瘤血管新生藥物是治療腫瘤的熱點方向[10]。在本研究中，我們研究了多種與腫瘤增長和侵襲相關的因子，探究其與腦膜瘤患者預后的相關性，從而為臨床提供參考。

在本研究中，我們對比了腦膜瘤組織和癌旁組織中PTTG1、E2F3、EphA2的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)，這三種因子在腦膜瘤組織中的表達水平顯著高于癌旁組織。PTTG1是由450個氨基酸組成的垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因，可參與調(diào)控胚胎發(fā)育、細胞增殖分化和病毒感染等生理活動[11]。研究表明，PTTG1蛋白在正常人腦中正常表達，但在腦膜瘤患者中其表表達異常增加，且隨著T分期的進展，PTTG1蛋白的表達逐漸升高，這與本研究結果一致[12]。E2F3由465個氨基酸組成，是E2F家族的一員， E2F3在不同腫瘤的異常增殖過程中表達水平各異[13]。既往研究發(fā)現(xiàn)[14]，E2F3在腦膜瘤中的表達水平顯著高于正常腦膜組織，與本次研究結果相似。EphA2是與血管新生相關的酪氨酸激酶，可參與血管生成擬態(tài)的形成[15]。

此外，我們還觀察到，PTTG1和E2F3蛋白水平在不同性別、年齡、發(fā)病部位和尺寸的腦膜瘤中表達無顯著差異性，但PTTG1、E2F3、EphA2在不同病理分級的腦膜瘤組織中表達水平有顯著差異，且與病理分級呈正相關，這表明PTTG1、E2F3、EphA2可用于反應腦膜瘤的分化程度，可能與腦膜瘤細胞惡性增殖相關，對臨床診療有一定借鑒意義。對患者進行跟蹤隨訪，比較PTTG1、E2F3、EphA2陽性表達組和陰性表達組之間的3年生存率，結果發(fā)現(xiàn)，陰性組的患者3年生存率顯著高于陽性組，說明PTTG1、E2F3、EphA2表達陰性的患者預后更好。

雖然本研究結果明確了PTTG1、E2F3、EphA2表達與腦膜瘤病理分級和預后的關系，并驗證了以往的研究結果，但尚存在一定局限性。由于樣本量限制，無法進行精細的分層分析；因機制研究的缺乏，尚需明確PTTG1、E2F3、EphA2 3種因子間是否存在協(xié)同作用或相互影響，這期待后續(xù)研究深入探索。

綜上所述，PTTG1、E2F3、EphA2在腦膜瘤組織中呈高表達，與腦膜瘤的病理分級呈正相關，且PTTG1、E2F3、EphA2表達陰性的腦膜瘤患者預后更好，值得進一步研究，以為臨床診療提供參考。