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    運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠皮層-紋狀體突觸可塑性受損的機(jī)制研究

    2022-03-10 03:57:32陳慧敏張凌韜劉曉莉喬德才
    中國(guó)體育科技 2022年1期
    關(guān)鍵詞:紋狀體可塑性皮層

    馬 婧,陳慧敏,張凌韜,劉曉莉,喬德才

    運(yùn)動(dòng)疲勞(exercise-induced fatigue,EF)在競(jìng)技運(yùn)動(dòng)中普遍存在,它不僅嚴(yán)重影響運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)技能的執(zhí)行,并且影響運(yùn)動(dòng)員的注意力和信息處理等認(rèn)知功能(閆東旭等,2019)。長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)疲勞導(dǎo)致神經(jīng)肌肉功能下降,從而增加運(yùn)動(dòng)員的損傷風(fēng)險(xiǎn)(郭浩等,2021),并可能對(duì)其身心健康造成嚴(yán)重危害。因此,探究運(yùn)動(dòng)疲勞的中樞調(diào)控機(jī)制至關(guān)重要,但目前運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生或維持機(jī)制尚未被完全揭示。

    皮層-紋狀體突觸可塑性被認(rèn)為是隨意運(yùn)動(dòng)、運(yùn)動(dòng)技巧性學(xué)習(xí)以及習(xí)慣性行為的細(xì)胞機(jī)制(Di Filippo et al.,2009),運(yùn)動(dòng)技巧性學(xué)習(xí)能夠使人腦的突觸可塑性發(fā)生變化(劉展,2020;任占兵等,2019)。皮層-紋狀體突觸可塑性能夠調(diào)節(jié)基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路的功能,從而調(diào)控運(yùn)動(dòng)。其主要有兩種表現(xiàn)形式,即長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP)和長(zhǎng)時(shí)程抑 制(long-term depression,LTD)。紋狀體同時(shí)接受皮層和丘腦的Glu能神經(jīng)投射,以及黑質(zhì)的DA能神經(jīng)投射(Kreitzer et al.,2008;Kuhlmann et al.,2021),因此,皮層-紋狀體突觸可塑性同時(shí)受Glu能系統(tǒng)和DA能系統(tǒng)的調(diào)控。研究證實(shí),皮層-紋狀體通路LTP依賴于通過NMDA受體內(nèi)流的Ca2+,以及NMDA受體和多巴胺1型受體(dopamine 1 receptor,D1R)的共同激活(Chepkova et al.,2012,2013)。而皮層-紋狀體通路LTD依賴于通過L型Ca2+通道內(nèi)流的Ca2+,以及代謝型谷氨酸1型受體(metabotropic glutamate receptor 1,mGluR1)、多巴胺2型受體(dopamine 2 receptor,D2R)和大麻素1型(cannabinoid 1,CB1)受體的共同激活(Chepkova et al.,2012;Gubellini et al.,2004)。研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)動(dòng)能夠影響多巴胺能信號(hào)通路,增強(qiáng)多巴胺能系統(tǒng)的功能(馮俊鵬等,2019),并且多種運(yùn)動(dòng)功能障礙都與皮層-紋狀體的突觸可塑性異常有關(guān),如亨廷頓舞蹈?。℉untington’s disease,HD)、帕金森?。≒arkinson’s disease,PD)和肌張力障礙(dystonia)等模式動(dòng)物都表現(xiàn)出皮層-紋狀體通路的LTP和/或LTD受損(時(shí)凱旋 等,2021;Ghiglieri et al.,2019;Nouhi et al.,2017;Peterson et al.,2010)。運(yùn)動(dòng)疲勞后小鼠也會(huì)出現(xiàn)動(dòng)作不協(xié)調(diào)、遲緩僵硬等行為表現(xiàn),但鮮見關(guān)于運(yùn)動(dòng)疲勞后皮層-紋狀體突觸可塑性的變化研究。

    前期利用場(chǎng)電位和膜片鉗技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后皮層-紋狀體的LTP和LTD均受損,紋狀體中型棘狀神經(jīng)元(medium spiny neurons,MSNs)自發(fā)型興奮性突觸后電流(spontaneous excitatory postsynaptic currents,sEPSCs)的幅度不變,但sEPSCs的頻率升高,雙脈沖反應(yīng)比值(paired-pulse ratio,PPR)降低,NMDA/AMPA電流比值降低(Ma et al.,2018)。這些結(jié)果表明,小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后皮層-紋狀體通路的雙向突觸可塑性受損,突觸前Glu釋放的概率升高,AMPA受體的功能不變,但NMDA受體的功能降低。

    由于皮層-紋狀體突觸可塑性受Glu能系統(tǒng)和DA能系統(tǒng)的雙重調(diào)控,因此,在前期研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠皮層-紋狀體突觸可塑性受損的基礎(chǔ)上,本研究從Glu能系統(tǒng)和DA能系統(tǒng)入手,分別采用高效液相色譜分析(high performance liquid chromatography,HPLC)和免疫印跡(Western Blot)技術(shù),檢測(cè)紋狀體腦區(qū)Glu、DA的濃度,以及Glu受體和DA受體的表達(dá)含量,以期進(jìn)一步揭示小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后皮層-紋狀體突觸可塑性受損的分子機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

    2月齡雄性C57BL/6小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)分籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食飲水,自然光照,室溫(22±2)℃,相對(duì)濕度(50±10)%。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后,隨機(jī)分為對(duì)照組(Control,n=24)和運(yùn)動(dòng)疲勞組(EF,n=26)。

    1.2 運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠模型的建立

    運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠模型的創(chuàng)建方法同前期研究(馬婧等,2018)。首先,對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)3天的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練,15 min/天,跑臺(tái)速度為10 m/min。檢測(cè)每只小鼠的最大運(yùn)動(dòng)速度,檢測(cè)方法:小鼠以5 m/min的速度熱身運(yùn)動(dòng)3 min后,將速度提高至10 m/min運(yùn)動(dòng)1 min,隨后速度提高1 m/min,直到小鼠跟不上跑臺(tái)速度,持續(xù)退落至跑臺(tái)后方,該速度即為小鼠的最大運(yùn)動(dòng)速度。其次,進(jìn)行連續(xù)7天的重復(fù)力竭跑臺(tái)運(yùn)動(dòng):以5 m/min的速度熱身運(yùn)動(dòng)3 min后,將跑臺(tái)速度設(shè)定為小鼠最大運(yùn)動(dòng)速度的85%,以此速度使小鼠持續(xù)運(yùn)動(dòng)至力竭。力竭的判定標(biāo)準(zhǔn):小鼠不能維持預(yù)定速度,長(zhǎng)期滯留于跑道后方不動(dòng),使用手連續(xù)觸碰驅(qū)趕仍無效,并伴有呼吸急促、腹臥跑臺(tái)、垂頭不起等行為表現(xiàn)。Control小鼠暴露在相同的環(huán)境中,但不進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。

    1.3 高效液相色譜分析實(shí)驗(yàn)

    1.3.1 小鼠紋狀體勻漿樣品制備

    小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞建模完成后即刻,對(duì)小鼠腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉處死。冰浴中快速分離雙側(cè)紋狀體,以1∶10(組織質(zhì)量/高氯酸體積)的體積比加入0.1 N的高氯酸,冰浴中勻漿,4℃14 000 r/min離心15 min后取上清液,用0.22 μm的濾膜過濾,再次4℃14 000 r/min離心15 min后取上清液,置于-80℃冰箱中保存待測(cè)。

    1.3.2 柱前衍生熒光檢測(cè)法測(cè)定Glu濃度

    稱取Glu標(biāo)準(zhǔn)品,利用0.1 N的高氯酸溶解分別配制濃度為10、1、0.1、0.01、0.001 μmol/L的Glu標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制流動(dòng)相A(0.1 mol/L磷酸二氫鉀溶液,pH 6.6)和流動(dòng)相B(40%純甲醇)溶液,真空抽濾,超聲波震蕩脫氣。首先進(jìn)行儀器管道的清洗,設(shè)定流動(dòng)相的速度為1 mL/min,排空管內(nèi)的氣體。調(diào)節(jié)流速為0.1~0.2 mL/min,連接色譜柱(QU-3C18-15021)和熒光檢測(cè)器(RF-20A),柱溫箱溫度設(shè)定為25℃,熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為357 nm,發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)為455 nm。吸取20 μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液/樣品勻漿液,加入10 μl鄰苯二甲醛(OPA)衍生試劑和10 μl Na2CO3緩沖液,充分混勻后靜置30 s,微量進(jìn)樣針抽取20 μl進(jìn)樣到HPLC系統(tǒng)中檢測(cè)。

    利用Glu標(biāo)準(zhǔn)品的不同濃度(10、1、0.1、0.01、0.001μmol/L)及色譜中對(duì)應(yīng)的峰面積,設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)x,峰面積為縱坐標(biāo)y,計(jì)算得到Glu的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。將小鼠紋狀體勻漿液色譜圖中與標(biāo)準(zhǔn)品具有相同保留時(shí)間(±0.1 s)的色譜峰的峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而計(jì)算小鼠紋狀體勻漿液中的Glu濃度。

    1.3.3 電化學(xué)檢測(cè)法測(cè)定DA濃度

    稱取DA標(biāo)準(zhǔn)品,利用0.1 N的高氯酸溶解,分別配制成10、1、0.1、0.01、0.001 μmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)液。流動(dòng)相 A:將0.09 mol/L二水合磷酸二氫鈉溶液、0.001 7 mol/L辛烷基磺酸鈉、0.05 mol/L一水合檸檬酸和50 μmol/L的EDTA混合后,利用磷酸將其pH調(diào)至3.0。流動(dòng)相B:純甲醇(10%恒流洗脫),使用前經(jīng)0.22 μm有機(jī)膜過濾,超聲波震蕩脫氣,設(shè)置流動(dòng)相的速度為0.2 mL/min。采用QU-3C18-15021色譜柱,柱溫箱溫度設(shè)定為30℃,工作電壓0.52 V,靈敏度為0.1 nA。微量進(jìn)樣針抽取20 μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液/樣品勻漿液進(jìn)樣到HPLC系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)。

    利用DA標(biāo)準(zhǔn)品的不同濃度(10、1、0.1、0.01、0.001μmol/L)及色譜中對(duì)應(yīng)的峰面積,設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)x,峰面積為縱坐標(biāo)y,計(jì)算得到DA的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。將小鼠紋狀體勻漿液色譜圖中與標(biāo)準(zhǔn)品具有相同保留時(shí)間(±0.1 s)的色譜峰的峰面積,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而計(jì)算小鼠紋狀體勻漿液中的DA濃度

    1.4 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

    小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞建模完成后即刻,對(duì)小鼠腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉處死。冰浴中快速分離紋狀體,利用膜蛋白提取試劑盒提取紋狀體膜蛋白。將蛋白質(zhì)樣品置于95℃下,煮沸5 min,使蛋白變性。濃縮膠恒壓80 V電泳約30 min,待樣品進(jìn)入分離膠后,恒壓110 V電泳約100 min。4℃恒流0.25 A的條件下,采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜3 h。隨后用5%脫脂奶粉-TBST室溫下封閉PVDF膜1 h。TBST洗3次,每次10 min。加入2.5%脫脂奶粉-TBST配置的各一抗溶液,4℃孵育過夜。TBST洗3次,每次10 min。5%脫脂奶粉-TBST配置辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶10 000,Sigma,R4880)室溫孵育1 h。TBST洗3次,每次10 min(馬婧等,2018)。利用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影定影,Quantity One軟件掃描目的蛋白以及內(nèi)參的灰度值,將Control小鼠中目的蛋白與內(nèi)參的比值標(biāo)準(zhǔn)化為100%,EF以與Control小鼠的比值表示。

    目的蛋白和內(nèi)參的一抗?jié)舛燃靶吞?hào)信息如下:GluR1,1∶1 000,Abcam ab109450;GluR2,1∶1 000,Abcam ab52932;mGluR1,1∶1 000,CST 12551S;D1R,1∶1 000,Abcam ab81296;D2R,1∶1 000,Millipore AB5084P;β-actin,1∶10 000,Sigma A2066)。

    1.5 數(shù)據(jù)處理

    所有數(shù)據(jù)均以Mean±SEM表示。利用Student’s t-test分析組間差異。雙側(cè)*P<0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,**P<0.01為差異顯著,***P<0.001為差異極顯著。

    2 結(jié)果

    2.1 運(yùn)動(dòng)疲勞后小鼠紋狀體Glu能系統(tǒng)的變化

    2.1.1 紋狀體Glu含量的變化

    Glu標(biāo)準(zhǔn)品和小鼠紋狀體勻漿液的色譜圖如圖1所示。根據(jù)Glu標(biāo)準(zhǔn)品濃度(橫坐標(biāo)x)和對(duì)應(yīng)的色譜圖中峰面積(縱坐標(biāo)y),計(jì)算得到Glu的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=369 845x+1 406 929(R2=0.978 3)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,與Control小鼠相比,EF小鼠紋狀體Glu的濃度增加[Control:(8.86±1.57)×10-6mol/L,n=7;EF:(14.23±1.33)×10-6mol/L,n=7;Student’s t-test,P<0.05;圖2],表明小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后紋狀體腦區(qū)Glu的含量增加。這與前期研究利用膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)的運(yùn)動(dòng)疲勞后小鼠紋狀體突觸前Glu的釋放概率升高結(jié)果一致(Ma et al.,2018)。

    圖1 Glu標(biāo)準(zhǔn)品和紋狀體勻漿液的高效液相色譜圖Figure 1.The HPLC Chromatograms of Glu Standards and Striatal Homogenates

    圖2 運(yùn)動(dòng)疲勞組與對(duì)照組小鼠紋狀體Glu的濃度對(duì)比Figure 2.Comparison of Striatal Glu Concentration between EF and Control Mice

    2.1.2 紋狀體Glu受體表達(dá)含量的變化

    2.1.2.1 紋狀體AMPA受體表達(dá)含量的變化

    AMPA受體是離子通道型Glu受體的一種,介導(dǎo)哺乳動(dòng)物大腦中的快速興奮性突觸傳遞。AMPA受體在紋狀體腦區(qū)表達(dá)豐富,GluR1亞基和GluR2亞基是紋狀體AMPA受體的主要組成亞基,在MSNs和中間神經(jīng)元中廣泛存在(Mao et al.,2013)。

    利用Western Blot技術(shù),檢測(cè)紋狀體膜蛋白中GluR1亞基和GluR2亞基的表達(dá)含量。結(jié)果顯示,EF小鼠紋狀體GluR1的表達(dá)含量與Control小鼠相比無差異[Control:(100.00±10.60)%,n=6;EF:(98.85±8.90)%,n=7;Student’s t-test,P>0.05;圖3A、圖3B],GluR2的表達(dá)也正常[Control:(100.00±5.07)%,n=7;EF:(98.93±4.57)%,n=7;Student’s t-test,P>0.05;圖3C、圖3D]。EF小鼠紋狀體GluR1亞基和GluR2亞基的表達(dá)正常,提示,運(yùn)動(dòng)疲勞不影響紋狀體AMPA受體的表達(dá)。

    圖3 運(yùn)動(dòng)疲勞組與對(duì)照組小鼠紋狀體GluR1、GluR2的蛋白表達(dá)比較Figure 3.Comparison of Expression of GluR1 and GluR2 in Striatum between EF and Control Mice

    2.1.2.2 紋狀體mGluR1表達(dá)含量的變化

    mGluR1為代謝型Glu受體的一種,已有研究證實(shí),皮層-紋狀體LTD依賴于mGluR1(Gubellini et al.,2001)。因此,為了檢測(cè)mGluR1是否參與運(yùn)動(dòng)疲勞對(duì)小鼠皮層-紋狀體LTD的損害,利用Western Blot技術(shù)檢測(cè)了紋狀體mGluR1的表達(dá)含量。結(jié)果顯示,EF小鼠紋狀體膜蛋白中mGluR1的含 量 顯 著降低[Control:(100.00±9.88)% ,n=6;EF:(47.27±8.90)%,n=7;Student’s t-test,P<0.01;圖4]。提示,小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后紋狀體mGluR1的表達(dá)下調(diào),mGluR1的表達(dá)下調(diào)貢獻(xiàn)于運(yùn)動(dòng)疲勞對(duì)小鼠皮層-紋狀體LTD的損害。

    圖4 運(yùn)動(dòng)疲勞組與對(duì)照組小鼠紋狀體mGluR1的蛋白表達(dá)比較Figure 4.Comparison of Expression of mGluR1 in Striatum between EF and Control Mice

    2.2 運(yùn)動(dòng)疲勞后小鼠紋狀體DA能系統(tǒng)的變化

    除了Glu能系統(tǒng),皮層-紋狀體突觸可塑性也受DA能系統(tǒng)的調(diào)控。激活紋狀體DA能系統(tǒng)對(duì)于自主運(yùn)動(dòng)以及誘導(dǎo)皮層-紋狀體突觸可塑性均為必需(Centonze et al.,2003)。因此,為了探究運(yùn)動(dòng)疲勞是否還通過影響DA能系統(tǒng),進(jìn)而影響皮層-紋狀體突觸可塑性,本研究對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞后小鼠紋狀體DA能系統(tǒng)的變化也進(jìn)行了探究。

    2.2.1 紋狀體DA含量的變化

    DA標(biāo)準(zhǔn)品和小鼠紋狀體勻漿液的色譜圖如圖5所示。根據(jù)DA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(橫坐標(biāo)x)和對(duì)應(yīng)的色譜圖中峰面積(縱坐標(biāo)y),計(jì)算得到DA的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=114 473x+248 273(R2=0.948 3)。結(jié)果顯示,與Control小鼠相比,EF小鼠紋狀體DA的濃度顯著降低[Control:(6.76±0.88)×10-6mol/L,n=5;EF:(2.36±0.90)×10-6mol/L,n=5;Student’s t-test,P<0.01;圖6],表明小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后紋狀體DA的含量降低。

    圖5 DA標(biāo)準(zhǔn)品和紋狀體勻漿液的高效液相色譜圖Figure 5.The HPLC Chromatograms of DAStandards and Striatal Homogenates

    圖6 運(yùn)動(dòng)疲勞組與對(duì)照組小鼠紋狀體DA的濃度對(duì)比Figure 6.Comparison of Striatal DAConcentration between EF and Control Mice

    2.2.2 紋狀體DA受體表達(dá)含量的變化

    紋狀體中DA受體主要有兩種類型,即D1R和D2R,兩者具有不同的作用。其中,D1R位于直接通路的MSNs中,對(duì)于誘導(dǎo)皮層-紋狀體LTP為必需,而D2R位于間接通路的MSNs中,對(duì)于誘導(dǎo)皮層-紋狀體LTD為必需(Calabresi et al.,2019)。

    采用Western Blot技術(shù),檢測(cè)兩組小鼠紋狀體膜蛋白中D1R和D2R的表達(dá)含量。統(tǒng)計(jì)顯示,EF小鼠紋狀體D1R的表達(dá)含量顯著降低[Control:(100.00±2.44)%,n=6;EF:(60.46±5.85)% ,n=7;Student’s t-test,P<0.001;圖7A、圖7B]。并且,EF小鼠D2R的表達(dá)含量也顯著降低[Control:(100.00±5.45)%,n=6;EF:(54.70±7.85)%,n=7;Student’s t-test,P<0.001;圖7C、圖7D]。提示,小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后紋狀體D1R、D2R的表達(dá)均下調(diào),D1R的表達(dá)下調(diào)可能與皮層-紋狀體LTP受損有關(guān),而D2R的表達(dá)下調(diào)可能與皮層-紋狀體LTD受損有關(guān)。

    圖7 運(yùn)動(dòng)疲勞組與對(duì)照組小鼠紋狀體D1R、D2R的蛋白表達(dá)比較Figure 7.Comparison of Expression of D1R and D2R in Striatum between EF and Control Mice

    3 討論

    3.1 Glu能系統(tǒng)在運(yùn)動(dòng)疲勞損害皮層-紋狀體突觸可塑性中的作用

    前期研究發(fā)現(xiàn),EF小鼠MSNs的sEPSC頻率升高、PPR降低,兩者一致表明,小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后紋狀體突觸前Glu的釋放概率升高(Ma et al.,2018)。本研究采用HPLC技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)紋狀體Glu的濃度,發(fā)現(xiàn)小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后紋狀體Glu的濃度升高。運(yùn)動(dòng)疲勞后,小鼠紋狀體Glu的含量以及釋放增多,提示,紋狀體接受來自皮層椎體神經(jīng)元的興奮性Glu能神經(jīng)投射增強(qiáng)。本研究認(rèn)為,運(yùn)動(dòng)疲勞造成紋狀體Glu能神經(jīng)投射增強(qiáng),可能形成天花板效應(yīng),已經(jīng)使突觸強(qiáng)度達(dá)到了飽和,因此給予皮層重復(fù)高頻刺激時(shí),無法使突觸強(qiáng)度再進(jìn)一步增強(qiáng),從而抑制了皮層-紋狀體LTP的形成,這可能是運(yùn)動(dòng)疲勞后小鼠皮層-紋狀體LTP受損的分子機(jī)制之一。而且,紋狀體Glu能神經(jīng)投射增強(qiáng),Glu的過度累積也可能是直接導(dǎo)致皮層-紋狀體LTD受損的機(jī)制之一。

    AMPA受體是紋狀體腦區(qū)介導(dǎo)快速興奮性突觸傳遞的一種離子通道型Glu受體(陳艷清等,2020)。采用Western Blot檢測(cè)紋狀體AMPA受體GluR1亞基和GluR2亞基的表達(dá)含量,發(fā)現(xiàn)EF小鼠紋狀體GluR1亞基和GluR2亞基的表達(dá)含量均正常,運(yùn)動(dòng)疲勞不影響紋狀體AMPA受體的表達(dá)。前期膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,EF小鼠sEPSCs的幅度正常(Ma et al.,2018)。由于記錄的sEPSCs為AMPA受體介導(dǎo)的突觸后電流,因此sEPSCs的幅度正常表示小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后紋狀體AMPA受體的功能正常。結(jié)合這兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,運(yùn)動(dòng)疲勞后紋狀體AMPA受體的表達(dá)含量和功能均未見改變,表明小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后皮層-紋狀體突觸可塑性的異常并非是由于AMPA受體異常導(dǎo)致的。

    NMDA受體是另一種離子通道型Glu受體,NMDA受體的激活,以及通過NMDA受體內(nèi)流的Ca2+對(duì)于誘導(dǎo)皮層-紋狀體 LTP為必需(Kuhlmann et al.,2021;Shen et al.,2008)。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,EF小鼠紋狀體NMDA/AMPA電流比值降低,提示,小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后紋狀體NMDA受體的功能下調(diào)(Ma et al.,2018)。NMDA受體的功能下調(diào)使內(nèi)流的Ca2+較少,胞內(nèi)Ca2+較低,不足以成功誘導(dǎo)LTP,這可能是運(yùn)動(dòng)疲勞損害皮層-紋狀體通路LTP的另一個(gè)原因。

    mGluR1是一種代謝型Glu受體,皮層-紋狀體LTD依賴于mGluR1。本研究采用Western Blot檢測(cè)mGluR1的表達(dá)含量,發(fā)現(xiàn)EF小鼠紋狀體mGluR1的表達(dá)含量顯著降低。皮層椎體神經(jīng)元釋放的Glu與紋狀體MSNs突觸后膜上的mGluR1結(jié)合,激活G蛋白,與通過L型Ca2+通道內(nèi)流的Ca2+兩者共同作用,促使磷脂酰肌醇在磷脂酶C的作用下,經(jīng)過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),合成內(nèi)源性大麻素2-AG(張凌韜等,2018)。釋放到突觸間隙后,2-AG逆行回突觸前膜,與突觸前膜上的內(nèi)源性大麻素受體——CB1受體結(jié)合,激活CB1受體,繼而通過下游一系列分子的作用,最終減少突觸前Glu的釋放,形成內(nèi)源性大麻素依賴的LTD(endocannabinoid-dependent LTD,eCB-LTD)(Robbe et al.,2002),這就是皮層-紋狀體eCB-LTD的形成過程。內(nèi)源性大麻素2-AG的合成依賴于mGluR1。因此,本研究認(rèn)為,運(yùn)動(dòng)疲勞后小鼠紋狀體mGluR1的表達(dá)下調(diào)造成內(nèi)源性大麻素2-AG的合成減少,從而不利于突觸前Glu釋放的減少,使皮層-紋狀體LTD受損。前期研究發(fā)現(xiàn),EF小鼠紋狀體CB1受體的表達(dá)上調(diào)(馬婧等2018),這可能是機(jī)體對(duì)于Glu過度積累、LTD受損做出的一種代償反應(yīng)。

    3.2 DA能系統(tǒng)在運(yùn)動(dòng)疲勞損害皮層-紋狀體突觸可塑性中的作用

    除了接受來自皮層的Glu能神經(jīng)投射,紋狀體還接受來自黑質(zhì)的DA能神經(jīng)投射(王炳蔚等,2016)。黑質(zhì)DA神經(jīng)元釋放DA,與紋狀體MSNs突觸后膜上的D1R和D2R結(jié)合。在背內(nèi)側(cè)紋狀體微量注射D1R和D2R的拮抗劑,能夠顯著損害運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)行為,提示,DA能系統(tǒng)在直接和間接通路上的調(diào)節(jié)作用為必需(Diao et al.,2021)。DA與D1R結(jié)合,激活D1R對(duì)于誘導(dǎo)皮層-紋狀體LTP為必需。使用D1R的拮抗劑或者D1R被敲除的小鼠紋狀體均不能成功誘導(dǎo)出 LTP(Kerr et al.,2001;Lovinger et al.,2003)。激活D1R后能夠增強(qiáng)環(huán)磷酸腺苷和蛋白激酶A的活性,從而促進(jìn)LTP的產(chǎn)生(Miranda-Barrientos et al.,2014)。DA與D2R結(jié)合,激活D2R對(duì)于誘導(dǎo)皮層-紋狀體LTD為必需(Kreitzer et al.,2007)。DA能系統(tǒng)異常能夠損害皮層-紋狀體突觸可塑性。例如,在PD模式動(dòng)物中,紋狀體DA能神經(jīng)投射的缺失導(dǎo)致紋狀體LTP和LTD的雙向受損(Calabresi et al.,2007)。

    為了探究運(yùn)動(dòng)疲勞后小鼠皮層-紋狀體LTP和LTD的受損,是否與DA能系統(tǒng)異常有關(guān),本研究對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞后小鼠紋狀體的DA能系統(tǒng)進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,EF小鼠紋狀體DA的濃度降低,D1R和D2R的表達(dá)含量也降低,提示,小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后紋狀體接受的DA能神經(jīng)投射減少。這與侯莉娟等(2018)采用免疫組織化學(xué)染色觀察到的大鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后D1R和D2R蛋白表達(dá)下調(diào)的結(jié)果一致。小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后,紋狀體接受的DA能神經(jīng)投射減少,DA的含量降低,D1R的表達(dá)下調(diào),可能是導(dǎo)致皮層-紋狀體LTP受損的分子機(jī)制之一;而紋狀體DA的含量降低,D2R的表達(dá)下調(diào),可能是導(dǎo)致皮層-紋狀體LTD受損的分子機(jī)制之一。

    李科等(2019)利用光遺傳技術(shù)激活DA能系統(tǒng)改善大鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后紋狀體α和β頻段震蕩的異常,證實(shí)DA能系統(tǒng)在調(diào)控運(yùn)動(dòng)疲勞中發(fā)揮重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn),小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后MSNs的內(nèi)在膜特性不變、突觸前Glu的釋放增多、NMDA受體的功能下調(diào)(Ma et al.,2018)。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后紋狀體DA能神經(jīng)投射減少。這與已有研究報(bào)道的DA能神經(jīng)投射缺失不影響紋狀體MSNs的內(nèi)在膜特性,但是卻增加皮層-紋狀體突觸終末的Glu濃度和釋放(Calabresi et al.,1993;Lindefors et al.,1990),以及下調(diào)NMDA受體的功能(Steiner et al.,2010)相一致。提示,在正常的生理狀況下,內(nèi)源的DA能神經(jīng)投射對(duì)Glu能突觸傳遞起著負(fù)向的調(diào)節(jié)作用(余鋒 等,2020;Pisani et al.,2005)。因此,本研究認(rèn)為,運(yùn)動(dòng)疲勞導(dǎo)致小鼠紋狀體DA能神經(jīng)投射減少,DA含量降低,D1R和D2R的表達(dá)降低,DA能系統(tǒng)功能下調(diào),進(jìn)而引起紋狀體Glu的濃度和釋放增多、NMDA受體的功能降低,從而損害了小鼠皮層-紋狀體通路的LTP和LTD,造成了小鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙。

    4 結(jié)論

    探討小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后皮層-紋狀體突觸可塑性受損的神經(jīng)分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后紋狀體Glu能系統(tǒng)出現(xiàn)異常,具體表現(xiàn)為Glu的含量增多,mGluR1的表達(dá)下調(diào);小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后紋狀體DA能神經(jīng)投射減少,DA能系統(tǒng)的功能下調(diào),具體表現(xiàn)為DA的含量降低,D1R和D2R的表達(dá)下調(diào)。Glu能系統(tǒng)和DA能系統(tǒng)的雙重異??赡苁菍?dǎo)致小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后皮層-紋狀體突觸可塑性受損的原因之一。

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