毫針針刺對(duì)SD大鼠腧穴筋膜組織CSK、ATP和PCNA影響

胡鐵漢，李 程，司原成，陳 波，張 婷，賴(lài) 清

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省第二人民醫(yī)院中醫(yī)科，貴州 貴陽(yáng) 550004）

毫針針刺（filiform needling）對(duì)腧穴的刺激作用在本質(zhì)上是機(jī)械力刺激[1]。實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)研究證實(shí)，毫針針刺作用除了存在神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制外，還存在非神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制[1，2]。由于對(duì)腧穴非神經(jīng)組織細(xì)胞如何感受和傳遞針刺機(jī)械力學(xué)信號(hào)尚缺乏研究，因此，針刺非神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制還存在諸多未知環(huán)節(jié)。為此課題組前期通過(guò)離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，屏蔽掉神經(jīng)、體液各種環(huán)境因素，從始動(dòng)環(huán)節(jié)觀察了各種力學(xué)刺激對(duì)腧穴筋膜組織成纖維細(xì)胞的影響和力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)通路（整合素-細(xì)胞骨架-細(xì)胞效應(yīng)）的變化情況[3-5]。但是，活體生物的在體實(shí)際環(huán)境要復(fù)雜得多，因此，本實(shí)驗(yàn)以大鼠腧穴筋膜組織為研究對(duì)象，以毫針對(duì)腧穴進(jìn)行刺激，在體觀察腧穴筋膜組織CSK 在針刺力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)中的變化情況，并以ATP 和PCNA 為效應(yīng)指標(biāo)觀察腧穴筋膜組織能量代謝和細(xì)胞活力的改變情況，觀察細(xì)胞骨架在活體生物腧穴內(nèi)傳導(dǎo)力學(xué)信號(hào)時(shí)的變化，旨在為毫針針刺作用機(jī)理提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 16 只雄性SPF 級(jí)SD 大鼠，8 周齡，體重（190±10）g。購(gòu)自湖南長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（湘）2014-0011。實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核。

1.2 主要試劑和藥品 抗actin、vimentin、tubulin、PCNA 抗 體（Abcam；型 號(hào)：Ab52614、Ab92547、Ab108342、Ab92522）、EnVision 抗鼠/兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒（Dako，型號(hào)：K5007）、水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；批號(hào)：22011026）等。

1.3 主要器材 毫針（蘇州針灸用品有限公司；型號(hào)：13052）、電子天平（上海奧豪斯；型號(hào)：00000027）、半自動(dòng)脫水機(jī)（Leica；型號(hào)：TP1020）、全自動(dòng)石蠟包埋機(jī)（Leica；型號(hào)：EG1150）、全自動(dòng)石蠟切片機(jī)（Leica；型號(hào)：RM2235）、顯微鏡（Olympus 型號(hào)：1*71）、數(shù)碼照相機(jī)（Nikon；型號(hào)：DS-Fil）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)寶特公司，型號(hào)：ELX808IU-P）。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組處理 采用隨機(jī)數(shù)字表法將16 只SD大鼠分為空白對(duì)照組、毫針針刺組，每組8 只。兩組飼養(yǎng)條件一致，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。抓取空白對(duì)照組各只，用4%的水合氯醛按照4 ml/kg 進(jìn)行麻醉，首次麻醉成功后用脫毛劑以中脘穴為中心3 cm 范圍內(nèi)進(jìn)行脫毛，然后放回盒中飼養(yǎng)。麻醉1 次/d，共3 d。抓取毫針針刺組大鼠麻醉和脫毛成功后，將大鼠仰臥位固定于鼠臺(tái)上，然后用30 號(hào)1 寸毫針在中脘穴處向胸部平刺，進(jìn)針0.5 cm，以平補(bǔ)平瀉手法按照（60±3）r/min 均勻捻轉(zhuǎn)5 min，捻轉(zhuǎn)幅度在180°～360°，中間留針10 min，然后同樣的手法速率再捻轉(zhuǎn)5 min，留針10 min，共操作3 輪，然后出針，1 次/d，共3 d。

1.4.2 動(dòng)物取材 第3 天末次操作后，各組大鼠分別繼續(xù)固定進(jìn)行取材。以大鼠中脘穴穴點(diǎn)為中心，用外科剪剪取0.5 cm×0.5 cm 組織塊，切取其中一部分組織塊，迅速放入盛有4%多聚甲醛瓶中固定備測(cè)微絲、中間絲、微管和PCNA。另一部分組織塊（約200 mg）立即放入凍存管內(nèi)，放入液氮罐中保存，待檢ATP。取材完畢后將大鼠脫頸處死。

1.4.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞骨架微絲、中間絲、微管和PCNA 表達(dá) 組織塊脫水、透明、浸蠟、包埋和切片（4 μm）后經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精至水化，PBS 洗滌；再用pH6.0 的0.01 mol/L 檸檬酸鈉抗原修復(fù)液修復(fù)，3%H2O2抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶室溫孵育；加入抗actin、vimentin、tubulin、PCNA 抗體4 ℃孵育過(guò)夜；經(jīng)EnVision 抗鼠/兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒（二抗）37 ℃孵育、顯色、復(fù)染、封片后，在顯微鏡下觀察，應(yīng)用Image pro plus6.0 軟件在同等參數(shù)設(shè)置下分別測(cè)定微絲、中間絲、微管的積分光密度值（integrated option density，IOD）和陽(yáng)性區(qū)域面積（area），通過(guò)計(jì)算（IOD/area）平均光密度（mean density，MD）反應(yīng)目標(biāo)物質(zhì)的單位面積濃度；PCNA 實(shí)驗(yàn)圖片用直接觀察法計(jì)數(shù)PCNA 陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)量和圖片中總的細(xì)胞核數(shù)量，PCNA 的陽(yáng)性百分率=PCNA 細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，觀察各組的變化。

1.4.4 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)腧穴穴區(qū)組織塊中ATP 的含量 將備存的腧穴穴區(qū)組織塊進(jìn)行勻漿，3000 g×10 min，取上清，在嚴(yán)格按照ATP 的檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明及流程進(jìn)行操作，觀察各組腧穴穴區(qū)組織塊中的含量變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，所有數(shù)據(jù)均以（）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2 結(jié)果

2.1 毫針針刺對(duì)腧穴筋膜組織CSK 表達(dá)的影響 針刺組腧穴穴區(qū)局部組織CSK 微絲、微管的表達(dá)低于空白組，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P＜0.01）；針刺組腧穴穴區(qū)局部組織CSK 中間絲的表達(dá)高于空白組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.203），見(jiàn)表1、圖1。

圖1 兩組微絲、中間絲和微管表達(dá)情況（免疫組化，×400）（續(xù)）

表1 針刺對(duì)腧穴筋膜組織CSK 微絲、中間絲、微管表達(dá)的影響（，MD）

表1 針刺對(duì)腧穴筋膜組織CSK 微絲、中間絲、微管表達(dá)的影響（，MD）

注：與空白組比較，＊P＜0.01

圖1 兩組微絲、中間絲和微管表達(dá)情況（免疫組化，×400）

2.2 毫針針刺對(duì)腧穴穴區(qū)局部組織ATP 含量和PCNA 表達(dá)的影響 針刺組腧穴穴區(qū)局部組織ATP 含量及PCNA 陽(yáng)性計(jì)數(shù)率均高于空白組，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P＜0.01），見(jiàn)表2、圖2。

表2 毫針針刺對(duì)腧穴筋膜組織ATP 含量和PCNA 表達(dá)的影響（）

表2 毫針針刺對(duì)腧穴筋膜組織ATP 含量和PCNA 表達(dá)的影響（）

注：與空白組比較，＊P＜0.01

圖2 兩組PCNA 表達(dá)情況（免疫組化，×400）

3 討論

力學(xué)微環(huán)境是調(diào)節(jié)生命形態(tài)和功能的重要因素之一[6]?，F(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)研究證實(shí)，細(xì)胞能夠感知力的大小和時(shí)域（time scales），并且把機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為化學(xué)響應(yīng)，進(jìn)一步影響到細(xì)胞的DNA 轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)[7-9]。目前，關(guān)于細(xì)胞如何將胞外力信號(hào)傳遞到胞內(nèi)并且引起細(xì)胞反應(yīng)應(yīng)答的力信號(hào)傳導(dǎo)通路目前認(rèn)為主要有3 種途徑：一是力敏感離子通道（stretch-sensitive ion channels），通過(guò)力敏感離子通道將力信號(hào)轉(zhuǎn)化成跨膜的電信號(hào)或胞內(nèi)的化學(xué)信號(hào)[10]。針刺作用的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制在闡釋針刺機(jī)械信號(hào)的導(dǎo)入和轉(zhuǎn)換時(shí)大多采用這一理論進(jìn)行描述[1，11]；二是胞外基質(zhì)和粘連分子，這些胞外基質(zhì)和粘連分子將細(xì)胞和細(xì)胞，胞外和胞內(nèi)聯(lián)系起來(lái)，形成一個(gè)整體，并將力信號(hào)從胞外傳遞到胞內(nèi)，引起細(xì)胞的下游反應(yīng)[12]。在針灸推拿作用的機(jī)制研究中，有研究證實(shí)體外模擬推拿之壓力刺激能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的Integrinβ1、α1、α2、α3、αv表達(dá)量增加，Integrinβ3表達(dá)下降[13]；而毫針針刺對(duì)SD 大鼠腧穴穴區(qū)筋膜結(jié)締組織integrinβ1和integrinβ3的表達(dá)變化情況呈現(xiàn)不同趨向：中等強(qiáng)度毫針針刺時(shí)腧穴筋膜結(jié)締組織中integrinβ1的表達(dá)增強(qiáng)，有顯著差異，然而高強(qiáng)度毫針針刺時(shí)integrinβ1的表達(dá)卻下降。integrinβ3除部分大小血管可見(jiàn)少量表達(dá)外，在腧穴筋膜結(jié)締組織中始終為陰性表達(dá)[14]；三是細(xì)胞骨架的重新組建，當(dāng)細(xì)胞受到外界機(jī)械力刺激以后，細(xì)胞骨架在一些調(diào)節(jié)因子作用下解聚重組，并進(jìn)一步引起細(xì)胞反應(yīng)應(yīng)答。其中，針灸學(xué)領(lǐng)域以細(xì)胞骨架變化重組這一機(jī)械力信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究尚需深入。

細(xì)胞骨架[15，16]包括微絲、中間絲和微管3 種成分，是維持細(xì)胞形態(tài)功能的支柱性、剛性結(jié)構(gòu)，同時(shí)也是許多蛋白激酶附著的位點(diǎn)。微絲由肌動(dòng)蛋白組成，單個(gè)微絲直觀呈雙股、右手螺旋狀，實(shí)心，在細(xì)胞中成平行、二維、三維分布，處于高動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，與細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)有密切關(guān)系；中間絲化學(xué)成分復(fù)雜且性質(zhì)較為穩(wěn)定，呈實(shí)心狀，其直徑在微絲和微管之間；微管主要由α、β 兩種微管蛋白組成，呈中空的管狀，它的直徑和微絲、中間絲比較是最大的，也處于高動(dòng)態(tài)平衡狀，對(duì)細(xì)胞起著支撐的作用和參與胞內(nèi)物質(zhì)輸送的作用。細(xì)胞的形態(tài)需要依靠細(xì)胞骨架這些呈網(wǎng)狀的蛋白來(lái)維持，同時(shí)細(xì)胞骨架對(duì)細(xì)胞的很多重要生命活動(dòng)如生長(zhǎng)、分裂、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)纫彩株P(guān)鍵。此外，細(xì)胞骨架[17]是細(xì)胞主要的力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)位點(diǎn)，可以直接將作用于細(xì)胞表面的應(yīng)力傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)各區(qū)。由此可以推測(cè)細(xì)胞骨架在針刺機(jī)械信號(hào)細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)過(guò)程中也可能發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)中，針刺組腧穴穴區(qū)局部組織CSK 中間絲的表達(dá)高于空白組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.203），而針刺組腧穴穴區(qū)局部組織CSK 微絲、微管的表達(dá)低于空白組，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P＜0.01），這說(shuō)明中間絲的結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)固，不易受到外來(lái)因素的干擾，當(dāng)毫針針刺時(shí)，中間絲沒(méi)有發(fā)生表達(dá)量的變化。微絲、微管由于本身是處于高動(dòng)態(tài)平衡狀的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在毫針針刺這一過(guò)程中，針刺機(jī)械力能使微絲、微管原有的動(dòng)態(tài)平衡遭到打破，部分微絲解聚重構(gòu)趨勢(shì)明顯，以適應(yīng)來(lái)自針刺的機(jī)械外力刺激和傳導(dǎo)調(diào)整的信號(hào)。因此，細(xì)胞骨架中微絲、微管可能是細(xì)胞內(nèi)傳遞針刺機(jī)械刺激的主要力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

越來(lái)越多的證據(jù)顯示[18]，線(xiàn)粒體以細(xì)胞骨架蛋白為軌道而得以運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞骨架通過(guò)各種非特異性的途徑調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體的形態(tài)和功能；而線(xiàn)粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成ATP 的主要場(chǎng)所，為細(xì)胞的活動(dòng)提供能量，是細(xì)胞生命活動(dòng)的控制中心。本實(shí)驗(yàn)中，針刺組腧穴穴區(qū)局部組織ATP 含量高于空白組，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P＜0.01），說(shuō)明針刺可以提高腧穴能量代謝水平，可能激發(fā)針刺效應(yīng)啟動(dòng)。

另外，細(xì)胞骨架跨核膜聯(lián)系細(xì)胞核，可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。其中，PCNA 與細(xì)胞DNA 合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用，是反映細(xì)胞活力的特征性指標(biāo)[19]。本次研究，針刺組腧穴穴區(qū)局部PCNA 陽(yáng)性計(jì)數(shù)率均高于空白組，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P＜0.01），說(shuō)明針刺可能可以調(diào)節(jié)腧穴穴區(qū)細(xì)胞核基因和蛋白表達(dá)水平，提高腧穴活力。

綜上所述，毫針針刺時(shí)腧穴筋膜組織成纖維細(xì)胞的細(xì)胞骨架中微絲和微管是主要的細(xì)胞內(nèi)力學(xué)信息傳導(dǎo)通路；通過(guò)細(xì)胞骨架通路，腧穴組織能量代謝增強(qiáng)、腧穴細(xì)胞活力增加，這可能是毫針刺激腧穴，激發(fā)針刺治療作用啟動(dòng)的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)機(jī)理之一。雖然本次研究可能進(jìn)一步揭示針刺作用原理提供了新的思路，但這也還需要更深入地研究進(jìn)一步驗(yàn)證。