基于生物信息學篩選肝癌組織自噬相關基因并建立風險預測模型

楊育華 于飛 梁善雄 杜梅珍 黃天壬

摘要：目的： 利用生物信息學分析TCGA數據庫中肝癌組織與癌旁組織中表達具有差異性的自噬基因并建立肝癌預后風險預測模型。? 方法? 從癌癥基因圖譜（TCGA）數據庫獲取肝癌患者臨床信息與mRNA表達信息，利用R語言DEseq2、Limma、EdegR軟件包分析374例肝癌組織及50例癌旁組織中自噬相關差異表達基因（ARGs），對三個軟件包獲取的結果取交集作為差異基因結果;隨后對ARGs進行基因本體論（GO），京都基因與基因組百科全書（KEGG）功能富集分析。采用單因素與多因素COX回歸分析建立肝癌預后風險預測模型。結果：差異分析分別獲取32，35，32個自噬相關基因，對結果取交集后得到19個自噬相關差異表達基因，其中包括11個上調基因和8個下調基因; 基因富集化結果顯示19個ARGs主要參與了ErbB信號通路、自噬、細胞凋亡、Hippo信號通路等;經單因素與多因素COX回歸分析后確定了BIRC5與CLN3基因表達量與肝癌患者預后生存時間相關，由此建立以自噬基因為基礎的多因素風險預測模型;對風險預測模型的驗證表明該模型的風險評分是肝細胞癌患者預后的獨立危險因素（HR=1.27，95%CI=1.15～1.41，p=0.001），該模型高風險組患者生存時間顯著低于低風險組患者（p<0.001），提示該模型在肝癌患者預后生存時間預測上具有較高的準確性。 結論? 本研究基于TCGA數據庫構建的自噬基因相關的肝癌預后評估模型可獨立預測肝癌患者預后，有助于臨床醫(yī)生選擇精準化的肝癌預防和治療策略。

關鍵詞： 肝癌;自噬 ;預后模型;自噬基因

【中圖分類號】R322.4+7 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2022）04--03

Objective To analyze the differentially expressed autophagy genes in hepatocellular carcinoma tissues and adjacent tissues in TCGA database and establish a prognostic risk prediction model for hepatocellular carcinoma. Methods Clinical information and mRNA expression information of HCC patients were obtained from cancer Gene Mapping （TCGA） database. Autophagy-related differentially expressed genes （ARGs） in 374 HCC tissues and 50 paracancer tissues were analyzed using R language DEseq2， Limma and EdegR software packages. The intersection of the results obtained by the three software packages was taken as differential gene results. ARGs were then analyzed by gene Ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） for functional enrichment. Univariate and multivariate COX regression analysis were used to establish the prognostic risk prediction model of liver cancer. Results： 32，35，32 genes related to autophagy were obtained by differential analysis， and 19 differentially expressed genes related to autophagy were obtained by intersection of the results， including 11 up-regulated genes and 8 down-regulated genes. The results of gene enrichment showed that 19 ARGs were mainly involved in ErbB signaling pathway， autophagy， apoptosis and Hippo signaling pathway. After univariate and multivariate COX regression analysis， it was determined that the expression levels of BIRC5 and CLN3 genes were correlated with the prognosis and survival time of HCC patients， and a multi-factor risk prediction model based on autophagy genes was established. Validation of the risk prediction model showed that the risk score of the model was an independent risk factor for the prognosis of HCC patients （HR=1.27， 95%CI= 1.15-1.41， P =0.001）， and the survival time of patients in the high-risk group was significantly lower than that in the low-risk group （P &lt;0.001）. It suggests that the model has high accuracy in predicting the survival time of HCC patients. Conclusion It is suggested that the autophagy gene related hepatocellular carcinoma prognosis assessment model constructed in this study can independently predict the prognosis of HCC patients， which is helpful for clinicians to select accurate prevention and treatment strategies for HCC.

Key words：Liver cancer; Autophagy. Prognostic model; Autophagy genes

肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma ，HCC）是全球排名第三的癌癥死因，是世界范圍內的主要健康問題，嚴重威脅人類的健康與安全。根據最新統(tǒng)計[1]，全球大約有四億人感染了乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus， HBV）;中國的肝癌患者大約占全球50%以上;據估計，每年在中國因肝癌死亡的病例達到42.21萬，新發(fā)病例46.61萬，在惡性腫瘤中的發(fā)病率與死亡率分別排在第四位和第三位[2]。目前在臨床上肝癌的治療主要依靠化療與手術切除，但由于腫瘤耐藥性，肝癌患者的預后生存率依然不樂觀;因此研究尋找更有效的臨床預測肝癌患者預后指標變得十分關鍵，有助于解決肝癌這個全球公共衛(wèi)生難題。

細胞自噬是細胞自身為調節(jié)細胞代謝與細胞器更新提供原料及能量的過程，自噬參與了細胞內炎癥反應、細胞死亡以及免疫在內的生理病理過程以維持細胞穩(wěn)態(tài)。自噬受到自噬相關基因（Autophagy-related genes，ARGs）以及多種信號傳導途徑的調控。現有研究表明HBV能夠誘導自噬反應，但自噬在肝癌中體現出促進與抑制的雙重作用，一方面自噬具有保護肝細胞免受內外環(huán)境的應激，清除細胞內不必要的蛋白質等成分及微生物病原體的作用[3]。目前研究提示自噬相關基因與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關，但大多數集中在單一自噬基因上，對肝癌中總體的自噬基因表達水平及預測價值仍不明確，基于目前相關研究，本研究分析癌癥基因組圖譜 （the cancer genome atlas，TCGA）肝癌數據，獲取肝癌組織與癌旁組織中整體的自噬相關基因表達水平，并通過分析自噬基因差異表達與臨床特征的關系，探索自噬基因是否是肝癌患者預后的獨立危險因素，提升自噬相關基因的預測價值，有助于臨床上更加精準預測肝癌患者的生存時間。

1. 材料與方法

1.1數據收集與整理分析

從TCGA 肝癌數據庫（https：//www.cancer.gov/about-nci/organization/research/structural-genomics/tcga， tcga-lihc）下載424例肝癌患者原始RNA測序信息與臨床信息，樣本包含374例肝癌組織與50例癌旁組織。從人類自噬數據庫（http：//www.autophagy.lu/clustering/index.html）獲取222個人類自噬相關基因，經過與mRNA表達數據比對，最終納入210個有效的人類自噬相關基因;然后將210個ARGs與mRNA表達信息匹配，采用R語言 DEseq2、Limma、edgeR軟件包分別對mRNA表達數據進行基因表達差異分析，以腫瘤組織中基因表達量為正常組織1倍以上（log2FC ≥1）且 P<0.05定義差異表達基因，獲得差異表達ARGs后采用R語言軟件包pheatmap包繪制熱圖，ggplot包繪制火山圖。

1.2評估ARGs的相關生物過程和通路

為了更好的探索自噬相關差異基因在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用，我們對19個自噬相關差異基因的主要分子功能，細胞組分，生物學功能進行了富集分析，通過R軟件包enrichplot進行分析，并繪制富集分析條形圖、氣泡圖和弦圖對結果進行可視化。

1.3自噬基因差異分析與影響患者預后生存的因素

通過分析篩選納入374例肝癌樣本臨床信息;為了探索基因表達水平對肝癌患者預后生存時間的影響，我們對在肝癌組織中表達具有差異性的ARGs進行單因素與多因素Cox回歸分析，獲取到與肝癌患者預后顯著相關的ARGS后，根據回歸分析的結果建立肝癌風險評分模型，對模型繪制森林圖，并根據模型計算樣本風險評分，按照平均值將風險評分對應的樣本分為高風險組與低風險組，進一步采用COX回歸分析計算風險預測模型與其他臨床信息特征對肝癌患者預后生存時間的影響，并通過Kaplan-Meier繪制高風險組與低風險組五年生存曲線，評估肝癌風險評分模型對患者預后的預測效果，探索自噬基因對肝癌患者預后的關系。

1.4統(tǒng)計學分析方法

分析基于4.0.5版本R軟件，只有當P ≤0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1數據獲取和基因差異分析

在TCGA數據庫獲取的374例樣本臨床信息如表1，本研究分析了210個ARGs在TCGA肝癌數據庫中的表達差異并獲取到19個差異具有顯著性的基因，其中DEseq2包分析得到32個差異表達基因，上調基因數為22個，下調基因數為8個;Limma包分析得到25個差異表達基因，下調基因數為14個，上調基因數為11個;edgeR包分析得到34個差異表達基因，下調基因數為 8個，上調基因個數為26個。三個R包分析均定義為log2FC ≥1 和矯正 P<0.05。對三個R包分析結果取交集得到19個差異表達基因，分別為BIRC5，CCL2，CDKN2A，CLN3，DAPK2，DIRAS3，DLC1，FOS，FOXO1，ITGA6，MYC，NAMPT，NRG1，NRG2，PEA15，RAB24，SPHK1，TMEM74，TP73;圖1顯示了差異ARGs交集和在TCGA數據集中的分布熱圖及火山圖

圖1 肝癌組織與癌旁組織自噬相關基因表達情況? ①-②分別為火山圖與熱圖，其中火山圖中紅色點表示上調基因，藍色點表示下調基因。

2.2差異表達ARGs基因富集分析

利用KEGG和GO富集分析對ARGs的分子功能、生物學過程、細胞組分進行深入分析，如圖3所示，分析發(fā)現KEGG富集的通路主要包括自噬、ErbB信號通路、細胞凋亡和 p53 信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路。GO 富集的結果包括MAPK活性激活，ERBB2信號通路，自噬調節(jié)，轉錄激活等。

圖2? 差異表達自噬基因的KEGG、GO通路富集功能顯示ARGs主要參與自噬、ErbB信號通路、細胞凋亡和 p53 信號通路

2.3 ARGs表達與肝癌患者預后生存分析

通過對差異表達的19個ARGs進行單因素COX生存分析發(fā)現BIRC5、CDKN2A、TP73、CLN3四個自噬基因與肝癌患者生存時間關系密切，（p<0.05，HR>1 為高?；?，HR<1 為低?；颍?進一步對差異基因進行多因素COX生存分析發(fā)現BIRC5、CLN3對肝癌患者生存時間顯著相關，見表2;為獨立預測肝癌患者預后，根據COX回歸分析結果構建基于加權風險評分的肝癌預后模型，風險評分計算公式：0.198*BIRC5表達量+ 0.0902*CLN3表達量;繪制K_M生存曲線圖顯示高風險組與低風險組的生存時間差異，以此檢驗該風險模型的預測能力;如表3所示，與其他臨床信息相比，該風險模型是肝癌預后的獨立危險因素（p<0.05）;圖4顯示該模型高風險組的生存率明顯高于低風險組（p<0.05），隨著風險評分升高，HCC患者的生存率顯著降低。

圖3? ?①在分析了不同風險分數與患者的隨訪時間、事件及各個基因的表達變化的關系后，可以觀察到患者的生存率隨著風險分數的增加明顯下降。

②該模型森林圖顯示BIRC5是肝癌預后的獨立危險因素，模型整體具有顯著意義，③生存分析曲線顯示高風險組生存力顯著低于低風險組。

3.討論

目前自噬與HCC的發(fā)生發(fā)展關系研究主要集中通路抑制，基因突變，耐藥等多方面，但ARGs對肝癌的具體作用仍不明確，臨床意義也有待研究;大部分基于生物信息學分析ARGs的研究更多的是研究單基因的表達差異與肝癌預后的影響，預測能力有限;本研究從TCGA數據庫中獲取肝癌數據集并采用三種R軟件包分析了肝癌組織與癌旁組織中表達具有差異性的ARGs，避免了單一R軟件包對ARGs的漏篩，更好的展現ARGs在肝癌中的表達情況;由此基于差異表達ARGs構建了HCC風險預測模型對肝癌患者生存時間進行預測，最終納入2個與肝癌患者預后生存時間顯著相關的ARGs，有效的提升了ARGs的臨床預測價值。

本研究分析了TCGA數據庫中肝癌數據集的表達譜數據，研究結果顯示了ARGs在肝癌中的表達水平以及預測肝癌預后的作用。研究共得到19個差異ARGs，其中11個基因在肝癌組織的表達量上調，8個基因表達下調。通多單因素COX回歸分析發(fā)現BIRC5、CDKN2A、TP73、CLN3與肝癌患者預后生存時間顯著相關，為進一步縮小范圍，采用多因素COX分析ARGs表達量與生存時間的關系，最終確定了BIRC5與CLN3兩個差異ARGs，并利用這兩個基因建立了肝癌風險預測評分模型。隨后對模型的預測能力進行檢驗，生存分析顯示通過該風險模型計算所得高風險組生存時間顯著低于低風險組，表明該模型在HCC患者生存時間預測上具有一定的臨床價值。

BIRC5（baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing protein 5）是一種凋亡抑制蛋白，主要參與細胞凋亡抑制[4]，BIRC5在多數腫瘤中高表達，通過調控細胞凋亡與細胞轉化影響腫瘤遷移、復發(fā)，同時也參與血管生成，細胞有絲分裂與腫瘤耐藥等，BIRC5是所有凋亡抑制的調控因子中功能最強的因子[5]，基于這些特性BIRC5成為抑制凋亡靶向因子的研究熱點，有研究表明BIRC5在腫瘤組織中表達量升高并對HCC患者的預后預測有著顯著影響[6]，與本研究得到的結果類似;CLN3是定位于核內體和溶酶體上的抗凋亡蛋白，CLN3通過抑制內源性神經酰胺作用而表達抗凋亡作用[7]，Marcel Klein等[8]研究發(fā)現其與細胞內運輸和調控自噬有關，在CLN3基因敲除的細胞中，溶酶體活性與溶酶體數量都出現了降低，而自噬體數量升高，提示CLN3可能通過溶酶體系統(tǒng)影響細胞 自噬。但BIRC5與CLN3對肝癌預后生存的影響尚未明確，有待進一步研究。

綜上所述，本研究基于TCGA數據庫肝癌數據集確定了ARGs的表達水平與分布狀況，并對差異ARGs的生物學功能及對肝癌患者預后影響進行了深入探索，發(fā)現了19個在肝癌組織中表達具有差異性的自噬基因，并確定了2個與肝癌患者預后生存時間顯著相關的自噬基因，建立了HCC風險預測模型，該模型有待在臨床一線中進一步驗證其準確性，幫助臨床醫(yī)生制定更加精準的治療策略。

參考文獻：

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課題名稱：HBX基因突變調控PI3K/Akt/mTOR通路對肝癌細胞自噬的作用及其機制研究

課題編號：2019GXNSFDA245001

課題類型：廣西自然科學基金