3D打印多孔鈦合金植入物髕腱重建愈合效果動物實驗研究

劉曙光　許奎雪　夏超群　姜紅江　李 強　張朝鋒　王振國　史春寶

文章編號：1007-2373（2022）01-0042-12

摘要 本研究建立了羊髕腱缺損重建動物實驗模型，通過手術(shù)對動物實驗羊后肢肌腱進行剝離，分別使用均勻多孔結(jié)構(gòu)與仿生多孔結(jié)構(gòu)鈦合金植入體重建其臏腱附麗點，并在術(shù)后1、3、6個月后設置觀察點，采用活體運動觀察、大體觀察、X射線分析、組織學觀察、Micro-CT檢測、骨質(zhì)三維重建與生物力學檢測等手段，重點研究了不同結(jié)構(gòu)多孔鈦合金植入體對肌腱的愈合效果。結(jié)果表明均勻多孔結(jié)構(gòu)與仿生多孔結(jié)構(gòu)植入體均能使肌腱實現(xiàn)良好的愈合，新生肌腱組織可以長入鈦合金植入物的多孔結(jié)構(gòu)中，并且其結(jié)合強度隨術(shù)后恢復時間的延長而逐步增加。此外，本研究還探究了植骨與否對重建后各觀察點的肌腱結(jié)合強度，發(fā)現(xiàn)其影響較弱，但仿生多孔結(jié)構(gòu)抑制骨吸收的效果非常顯著。

關(guān) 鍵 詞 3D打印;多孔結(jié)構(gòu);多孔鈦植入物;組織長入;生物力學

中圖分類號 TG669;Q95-33? ? ?文獻標志碼 A

Animal experimental study on patellar tendon reconstruction and healing effect of 3D printed porous Ti-alloy implant

LIU Shuguang1，4， XU Kuixue1， XIA Chaoqun2， JIANG Hongjiang3， LI Qiang2， ZHANG Chaofeng1， WANG Zhenguo1， SHI Chunbao1

（1.Beijing Chunlizhengda Medical Instrucments Co.， Ltd.， Beijing 101112， China; 2.School of Materials Science and Engineering， Hebei University of Technology， Tianjin 300130， China; 3.Articular Surgery， Shandong Wendeng Orthopedic Hospital， Weihai， Shangdong 264400， China; 4. School of Materials Science and Engineering， University of Science and Technology Beijing， Beijing 100083， China）

Abstract This study established a scientific animal experimental model. Posterior-limb tendons of small fat-tail sheeps were stripped through surgery. Uniform and bionic porous structural Ti-alloy implants were used respectively to reconstruct the patellar tendon attachment points. The intravital motion observation， general observation， X-ray detection， histology observation， Micro-CT， 3D bone reconstruction， biomechanics and other methods were conducted at 1， 3， 6 months after the operation， focusing on the effects of healing between tendon and porous Ti-alloy implant with different pore structures. The results show that both of the homogeneous and bionic porous structural implants can achieve good tendon healing. The newborn tendon tissue can grow into the porous structure of the Ti-alloy implants， and its binding strength gradually increases with the postoperative recovery time. In addition， this study has also found that the bone graft has a weak effect on binding strength after tendon reconstruction， however， the inhibiting effect of bionic porous structure on bone resorption is more remarkable than that of the homogeneous porous structure.

Key words 3D printing; porous structure; porous Ti implant; tissue ingrowth; biomechanics

0 引言

隨著我國正逐漸步入老齡化社會，骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)軟骨磨損等骨功能退化已成為常見病癥，病患規(guī)模不斷擴大。除此之外，意外事故等多種原因造成的骨缺損、骨壞死及關(guān)節(jié)損傷均對患者生活造成了惡劣影響。因此，骨及骨關(guān)節(jié)的功能修復已成為廣大患者的迫切需求，持續(xù)激發(fā)著骨科植入醫(yī)療器械行業(yè)的市場發(fā)展?jié)摿1-2]。

目前，臨床應用中常見的金屬植入體材料以鈦合金為主，由于受傳統(tǒng)加工方式限制，表面較為光滑，其骨整合性能不佳。主要依賴螺釘鈦纜的第三方固定來保持穩(wěn)定，無法完成骨長入過程，僅能滿足骨缺損或關(guān)節(jié)損傷的形態(tài)修復，難以保證植入后的穩(wěn)定性[3-5]。三維立體的孔隙結(jié)構(gòu)能維持成骨細胞形態(tài)并促進成骨細胞的黏附、增殖及增強細胞的生物活性，促進成骨相關(guān)的膠原的分泌與骨質(zhì)向內(nèi)生長，有利于植入后的初期及后期穩(wěn)定[6-7]。另外，多孔鈦合金的彈性模量更接近于人體骨骼，可有效減少“應力遮擋”現(xiàn)象的發(fā)生[8-9]。基于這項關(guān)鍵臨床需求，利用3D打印增材制造技術(shù)制備的多孔鈦合金假體具有互通微孔結(jié)構(gòu)，其關(guān)鍵特點包括孔隙度、孔隙大小和孔隙連通性，合理的多孔結(jié)構(gòu)參數(shù)設計可以在植入后誘發(fā)骨長入，形成穩(wěn)固的骨-假體結(jié)合界面。多孔結(jié)構(gòu)作為骨科植入物臨床應用的一個新概念，特別是具有模擬人體骨小梁的仿生結(jié)構(gòu)設計已成為研究和臨床關(guān)注的重點。

脛骨上端為人體腫瘤的好發(fā)部位，骨與軟組織腫瘤在切除后會造成巨大缺損，需要使用人工假體進行重建，相應的肌腱也需要重新附麗[10]。現(xiàn)有的方法是直接將肌腱縫合在假體上的孔、洞、環(huán)鎖等位置處，這種重建肌腱附麗的方式，長期愈合效果欠佳[11-13]。通過3D打印一體化成型技術(shù)制備出來的多孔鈦合金假體，可以為腫瘤假體的肌腱附麗提供新方式，肌腱與多孔鈦合金結(jié)構(gòu)能否愈合并重新建立滿足要求的附麗強度成為臨床所關(guān)注的問題。本工作擬通過動物實驗來完善多孔鈦合金假體重建肌腱附麗的臨床前研究。針對動物實驗模型選擇，受小動物體型限制，其肌腱較為細小，與正常人體肌腱的解剖結(jié)構(gòu)存在明顯的尺寸差異。因此，小動物模型常用于研究基因表達、機制、愈合和急性肌腱-骨修復的再生策略，不適于作為人類肌腱修復研究的參考[14-15]。大動物在解剖結(jié)構(gòu)的尺寸上能夠較好地模擬人體情況，由于體型較大、肌腱較粗、易于辨識和剝離，會增強手術(shù)的可行性和便利性[16]。本研究選擇大動物后肢髕腱下極附麗點作為肌腱剝離后的重建模型，主要探究了不同多孔結(jié)構(gòu)樣品植入后的愈合效果，分析了肌腱局部重建后的結(jié)合強度，為建立植入體多孔結(jié)構(gòu)的構(gòu)效關(guān)系提供參考依據(jù)，對多孔鈦合金假體在臨床上的廣泛應用具有指導作用。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗動物

健康普通級小尾寒羊用于位置骨組肌腱愈合試驗18只，用于植骨組肌腱愈合試驗25只。入選標準為年齡2～3歲，雌性，體重在35～50 kg范圍內(nèi)，生理指標正常，無其他隱性疾病，動物檢驗檢疫合格。試驗用羊源于寧夏博迪生物科技有限公司，實驗羊采取隔離檢疫、血清學檢測、免疫驅(qū)蟲、定期注射疫苗等措施，可保證實驗用羊的質(zhì)量。

1.2 實驗材料與設備

3D打印多孔鈦植入物樣品由北京市春立正達醫(yī)療器械股份有限公司提供，Ti-6Al-4V （TC4 ELI）粉末粒徑為45～106 μm （AP&C Company），其化學成分如表1所示。3D打印設備用于多孔鈦植入樣品的制備 （EBM Arcam Q10 PLUS），數(shù)字化醫(yī)用X射線攝影系統(tǒng)用于活體及取樣后的X射線檢測 （南京華東電子集團有限公司），恒溫水浴鍋用于樣品恒溫水浴加熱 （SG-4050C，上海碩光電子科技有限公司），全自動顯微鏡用于樣品觀察 （Leica-LA，Leica Microsystems Ltd.），超聲清洗儀用于樣品清洗（濟寧天華超聲電子儀器有限公司），顯微鏡用薄片切片機用于硬組織切片處理 （Leica SP 1600，Wetzlar），微型磨削機用于檢測樣品制備 （RF-1，瑞豐儀器有限公司），Micro-CT系統(tǒng)用于顯微CT檢測 （Inveon CT Scanner，Siemens），萬能試驗機用于力學性能測試 （INSTRON 5982，Instron Corporation）。實驗藥品包含陸眠靈Ⅱ （鹽酸賽拉嗪注射液，吉林省華牧動物保健品有限公司），陸醒寧 （吉林省華牧動物保健品有限公司），硫酸阿托品注射液、惠可寧 （注射用硫酸頭孢喹肟，齊魯動物保健品有限公司），其他為雙氧水、生理鹽水、福爾馬林固定液等常規(guī)實驗藥品，組織染色采用自配Stevenels'Blue & Van Gieson's Picrofuchsin染色劑。另外，手術(shù)普通耗材包括醫(yī)用普通縫合線、明膠海綿、醫(yī)用刀片等，專用器械包括電鉆、擺鋸、骨刀、骨鑿及磨銼等。

1.3 實驗動物

1.3.1 羊脛骨的重建

實驗羊的后肢CT數(shù)據(jù)通過實際測量獲得，數(shù)據(jù)如下，正常髕腱附麗點范圍約為10 mm×10 mm，髕腱長約50 mm，髕腱下極韌帶橫截面約15 mm寬、7 mm厚，局部變薄并向下延伸約10 mm。測量過程如圖1所示。基于該測試結(jié)果設計植入物尺寸，并確定手術(shù)采用膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路，以脛骨結(jié)節(jié)為中心，上下長約6 cm。

1.3.2 多孔鈦合金植入物設計及其結(jié)構(gòu)參數(shù)

多孔鈦合金植入物依據(jù)成年小尾寒羊后肢髕腱及其脛骨結(jié)節(jié)的解剖結(jié)構(gòu)尺寸進行設計。依據(jù)羊髕腱下極肌腱附麗點以及脛骨結(jié)節(jié)處骨骼解剖形態(tài)確定試件外形，大小約為10 mm×10 mm×13 mm，與肌腱結(jié)合面采用多孔鈦合金，其余面為實體面，使用3枚骨螺釘固定，肌腱與試件采用縫合方式固定，結(jié)構(gòu)如圖2所示。植入物樣品設計為2種多孔結(jié)構(gòu)，1種為均勻多孔結(jié)構(gòu)（HOM），1種為仿生（非均勻）多孔結(jié)構(gòu)（BIO），除多孔結(jié)構(gòu)設計外，其他工藝參數(shù)完全一致，多孔結(jié)構(gòu)參數(shù)的實測數(shù)據(jù)如表2所示。2種多孔結(jié)構(gòu)樣品中不植骨型試件的多孔結(jié)構(gòu)在試件上表面處平齊，肌腱縫合后直接與多孔結(jié)構(gòu)接觸;植骨型試件凹槽內(nèi)底部為多孔結(jié)構(gòu)，上部空置，用于自體骨植骨，植骨后再將肌腱縫合于其上，肌腱與植骨相接觸。植骨空間體積為450 mm3。2種樣品的上表面與肌腱接觸，除該面與外界相通外，其余面均為實體壁，不與外界相通，以此模擬臨床實際環(huán)境中人工假體局部無活體組織及血供的情況。

1.3.3 動物實驗模擬

動物實驗優(yōu)先通過計算機模擬脛骨結(jié)節(jié)處試件安裝，效果如圖3a）所示，確認試件設計合理。再采用3D打印技術(shù)制備出多孔鈦合金植入物，通過體外實驗預安裝論證后（圖3b）～c）），確認手術(shù)操作的可行性。體外模擬植入實驗及后續(xù)動物實驗中使用的手術(shù)高值耗材包括醫(yī)用鈦合金皮質(zhì)骨螺釘和松質(zhì)骨螺釘，配備不同長度規(guī)格以滿足實驗需求;醫(yī)用不可吸收肌腱縫合線，用于術(shù)中肌腱附麗重建縫合。

1.3.4 動物實驗流程

實驗用羊術(shù)前24 h始禁食水，分別稱重并進行編號，隨機分入2組。第1組為非植骨組，使用非植骨型試件，手術(shù)操作直接將肌腱縫合至多孔鈦合金試件上，第2組為植骨組，使用植骨型試件，手術(shù)操作先在試件內(nèi)的多孔鈦合金上的空置部位植骨，再將肌腱縫合至試件上。部分羊可使用雙側(cè)后肢進行試驗，但不得同期進行雙側(cè)手術(shù)。術(shù)后再分為3個觀察時間點，分別為1個月、3個月、6個月，按計劃數(shù)量將實驗動物處死，取出樣品及相連的髕腱，剔除肌肉組織用于檢測。用于組織學及Micro-CT檢測的標本分別浸入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、正丁醇、無水乙醇和二甲苯中各2 h，進行脫水處理;再使用甲基丙烯酸甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯、二甲苯、過氧化苯甲酰包液固定7 d;取出標本并置于包埋瓶中，在真空環(huán)境下（-64 kPa）保持5～6 h，取出標本后在50 ℃水浴鍋內(nèi)至包埋液發(fā)生聚合反應;硬組織切片于樣本正中冠狀面切割，將切片磨至80～100 μm，使用染色劑染色。用于Micro-CT檢測的樣品，掃描數(shù)據(jù)采用VG Studio Max 3.0軟件進行三維重建處理，根據(jù)骨組織與鈦合金的不同CT值分別為其賦予不同偽色，區(qū)別觀察試件中植骨的生長情況以及多孔鈦合金中骨長入的情況。在標本取樣后，采用深低溫冷凍的方式保存生物力學檢測的樣品。實驗流程如圖4所示。

1.3.5 手術(shù)操作

按照常規(guī)動物實驗手術(shù)方法，采用陸眠靈肌注麻醉，羊側(cè)臥于平臺手術(shù)桌上，手術(shù)側(cè)肢體在上，其余肢體及頭部捆綁固定，后肢膝關(guān)節(jié)術(shù)區(qū)剃毛后碘伏消毒，全手術(shù)過程在無菌實驗手術(shù)室進行，手術(shù)過程如圖5所示。1） 切口及游離髕腱（見圖5b））：以脛骨結(jié)節(jié)為中心，采用前內(nèi)側(cè)縱行切口，長度約6 cm，顯露髕腱后自髕腱下緣向外頓性分離，不進入關(guān)節(jié)腔，游離髕腱后，使用骨刀將髕腱自脛骨結(jié)節(jié)處剝離，保持髕腱的完整性，并標記髕腱的位置。2） 制備骨槽與樣品埋植（見圖5c））：依據(jù)埋植樣品的大小，使用擺鋸及磨鉆制備相匹配的骨槽，埋入試件，使用骨螺釘固定，通常遠端使用1枚長的皮質(zhì)骨螺釘固定，近端使用2枚長度合適的松質(zhì)骨螺釘固定。3） 髕腱縫合及髕腱附麗點重建（見圖5d））：對于非植骨組，將髕腱依據(jù)游離前標記的位置縫合至試件上，使髕腱與多孔鈦合金緊密相貼，不可移動。對于植骨組，利用制作骨槽時所取的松質(zhì)骨填充植骨部分，取出的自體骨需要破碎至綠豆粒大小，填充到試件的預留位置壓實，使植骨與下層的多孔結(jié)構(gòu)緊密貼合，再將髕腱縫至樣品上，植骨組樣品制作如圖6所示。4） 關(guān)閉切口：雙氧水、生理鹽水分別沖洗后檢查無活動出血，逐層逢合（圖5e））。5） 術(shù)后處理：術(shù)后羊清醒后開始進食，自由活動。術(shù)后連續(xù)5 d肌內(nèi)注射惠可寧0.5 g，傷口每日進行噴碘伏消毒處理。

1.4 評價與統(tǒng)計學方法

動物存活期內(nèi)采用活體運動觀察、X線檢查。動物處死取材后進行大體觀察、組織學觀察、Micro-CT檢查、生物力學檢測。主要觀察指標為樣品植入后肌腱是否愈合，組織是否長入等?；铙w觀察可觀測術(shù)后實驗動物羊的手術(shù)部位恢復情況，切口情況及關(guān)節(jié)的活動情況，X線檢查評價植入試件的在位情況。大體觀察可評價肌腱的完整性、粗細程度及肌腱的愈合情況。Micro-CT檢查可根據(jù)骨組織與鈦合金的不同偽色，區(qū)別觀察植骨樣品的骨生長情況及多孔結(jié)構(gòu)中的骨長入情況。硬組織染色可以評價肌腱在多孔鈦合金孔隙中的長入愈合情況。生物力學檢測可分析肌腱與試件分離時的最大拉力，評估肌腱與試件的愈合強度。依據(jù)分析問題的實際需求，本研究采用描述性統(tǒng)計的方法對數(shù)據(jù)進行直觀呈現(xiàn)，采用差異性檢驗的方法（獨立樣品t檢驗）挖掘數(shù)據(jù)之間的內(nèi)在關(guān)系，分析不同術(shù)后恢復時長中，骨組織體積在HOM與BIO的差異狀況，以及重建后髕腱附麗點的最大拉力值在非植骨組與植骨組的差異狀況。相關(guān)數(shù)據(jù)在SPSS 24.0中生成導出。

2 結(jié)果與討論

2.1 活體運動觀察

術(shù)后實驗動物均順利存活，精神和生理行為活動無異常，進食良好，切口無紅腫、滲出，達到甲級愈合。抗生素注射部位皮膚無感染、過敏及異常反應。非植骨組與植骨組動物術(shù)后1個月內(nèi)均主動減輕手術(shù)側(cè)肢體負重，運動中減少使用該側(cè)肢體活動。術(shù)后1至2個月內(nèi)，觀察實驗動物的活動情況可發(fā)現(xiàn)，其手術(shù)側(cè)肢體運動逐漸增多，但仍保有肢體跛行現(xiàn)象。2個月后，實驗動物的手術(shù)側(cè)肢體可承受負重，并恢復至正?；顒铀健＝Y(jié)果表明，動物實驗術(shù)后不同時間段的活體觀察與實際臨床恢復情況基本相符。

2.2 大體觀察與X射線檢測分析

所有標本取材時觀察顯示，所有手術(shù)部位，包括髕腱止點部位、肌腱與多孔鈦合金樣品均愈合良好。與手術(shù)當時重建的髕腱較為飽滿的情況相比，有明顯的肉眼可辨識差別，表現(xiàn)為肌腱位置變薄、發(fā)生萎縮等現(xiàn)象。此外，肌腱縫線有松弛現(xiàn)象，上端的縫線隨肌腱向肢體近端移位。表明重建肌腱附麗后，肌腱在萎縮變薄的同時有向近端回縮的現(xiàn)象，如圖7c）所示。一般臨床上患者完成肌腱重建后，會臥床靜養(yǎng)約1個月，該時間段內(nèi)會避免肢體主動受力。但實驗動物羊不能像臨床患者一樣靜臥休息，難以保證重建初期的肌腱與局部假體穩(wěn)定愈合，過早的患肢運動可能導致手術(shù)重建后肌腱的萎縮。

術(shù)后6周的活體與術(shù)后3個月的標本取材后X射線檢測結(jié)果（圖7a）和b））均顯示，所有實驗動物的植入樣品在體內(nèi)均在位良好，植入樣品與骨面結(jié)合緊密，未見明顯間隙，無明顯脫出、移位現(xiàn)象，固定螺釘未見松動。

2.3 組織學評價

對于非植骨組標本，經(jīng)過對標本固定、包埋、脫水、切片、染色等步驟后，其術(shù)后3個月的硬組織切片觀察結(jié)果如圖8所示。組織學樣品使用Stevenels' Blue & Van Gieson's Picrofuchsin試劑染色，包含全貌圖和局部細節(jié)圖，圖中組織染色部分呈黃綠色與淡黃色，紅色部分為骨組織，黑色部分為多孔鈦樣品。由圖可見，所有的標本中均顯示出肌腱與鈦合金多孔結(jié)構(gòu)愈合良好，肌腱和其周圍形成的纖維組織向多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)生長，并將多孔結(jié)構(gòu)基本填滿。從組織學檢測結(jié)果分析可得，HOM（見圖8a））與BIO（見圖8b））樣品中組織長入情況相近，無顯著差異。位于多孔結(jié)構(gòu)上部1～3層孔內(nèi)的染色組織與肌腱組織結(jié)構(gòu)相同，多孔結(jié)構(gòu)底部中雖然有纖維組織生長形成，但與肌腱的纖維組織在組織學觀察上存在區(qū)別，尚不能確定為成熟的肌腱組織。同時，在組織學圖像中可以觀察到，重建的髕腱在附麗點處肌腱較未進行手術(shù)的區(qū)域更薄，該結(jié)果與大體觀察所見一致。組織長入通過植入物表面或內(nèi)部的孔隙結(jié)構(gòu)與人體組織結(jié)合完成。影響多孔植入物組織長入的因素很多，如孔隙率、孔徑、孔隙連通性、材料的生物相容性、生物活性、應力刺激等[17]。一般認為孔徑大于200 μm，孔隙率較高時有利于組織長入[18]。劉路坦等[14]將孔徑為600 μm，孔隙率分別為35%、55%、75%的多孔鈦板植入新西蘭大白兔股骨干位置，術(shù)后16周發(fā)現(xiàn)75%孔隙率樣品較其他兩組更有利于骨長入，實現(xiàn)了良好的骨性融合。本研究中涉及的兩種多孔結(jié)構(gòu)孔徑均大于200 μm，且孔隙率保持在50%以上，為營養(yǎng)物質(zhì)和氧交換提供了充分的空間，促進細胞增殖和干細胞成血管化，實現(xiàn)組織長入。

由于HOM與BIO樣品中組織長入情況相近，不同術(shù)后時間的組織長入情況以BIO樣品為例進行討論。根據(jù)圖9結(jié)果所示，術(shù)后1個月的組織長入深度約為6 mm，新生組織長滿假體表面孔隙并交織成非均勻網(wǎng)狀，與上層鈦絲緊密結(jié)合。術(shù)后3個月組織長入基體填滿整個多孔結(jié)構(gòu)區(qū)域，長入深度約為10 mm，但上層組織更接近于成熟肌腱組織，底層組織尚不能認定。術(shù)后6個月成熟肌腱組織長入整個多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)，充盈率更顯著。臏腱附麗點處肌腱組織較薄，隨術(shù)后時間增加，該處組織呈增厚的趨勢。在這種模擬封閉、缺少血供給的環(huán)境下，肌腱與鈦合金多孔結(jié)構(gòu)愈合良好，肌腱和其周圍形成的纖維組織可以向多孔結(jié)構(gòu)中生長，結(jié)果表明多孔金屬結(jié)構(gòu)可以為肌腱的附麗提供良好的附著位置及必要的營養(yǎng)物質(zhì)交換空間。

對于植骨組標本，主要分析討論了不同術(shù)后時長條件下HOM與BIO樣品里骨組織剩余體積量的差異情況，還有肌腱與2種多孔結(jié)構(gòu)間愈合情況，植骨后術(shù)后3個月的硬組織切片觀察結(jié)果如圖10所示。由圖可見，術(shù)后3個月肌腱及其周圍形成的纖維組織包裹骨組織并向多孔結(jié)構(gòu)中生長，新生組織填滿至多孔結(jié)構(gòu)底部。同時，2種結(jié)構(gòu)樣品中仍保留部分植入的骨組織，其仍然位于原始植骨位置處，但植骨組織體積減小，剩余體積的骨組織已不能填滿整個植骨空間，并且植入的松質(zhì)骨有極少部分向下長入多孔結(jié)構(gòu)中。結(jié)果表明，所有標本中肌腱與骨組織及鈦合金多孔結(jié)構(gòu)愈合良好，2種結(jié)構(gòu)在植骨后均顯示出骨組織吸收現(xiàn)象。

2.4 Micro-CT分析及三維重建

依據(jù)計劃對標本進行取材，按檢測方法對標本進行處理后，進行Micro-CT掃描，將獲取的數(shù)據(jù)進行三維重建，分割興趣區(qū)域，計算出骨組織的體積，植骨組術(shù)后3、6個月的Micro-CT掃描三維重建結(jié)果如圖11所示。圖中紅色部分為骨組織，可見骨組織仍位于預留的植骨位置處，同時，剩余骨組織并未展示出明顯地向底部多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)生長的跡象。所有標本三維重建后骨組織體積測量值結(jié)果見表3。從表可以看出，相較于手術(shù)植骨450 mm3，在術(shù)后植骨的骨組織體積有明顯的丟失，并且隨術(shù)后時間增加骨組織體積逐漸降低，并且殘留的骨組織也基本保持在植骨空間的原位，該結(jié)果與上述組織學觀察結(jié)果一致。因此，在肌腱附麗點位置植骨，未顯示出促進骨愈合的效果，可為實際臨床應用中是否需要植骨作為參考。然而，在相同骨吸收趨勢下，仿生結(jié)構(gòu)樣品的骨組織體積減少量明顯低于相同術(shù)后時間下的HOM樣品，仿生結(jié)構(gòu)的抑制骨吸收、骨溶解效果優(yōu)于HOM。一方面由于BIO設計具有短程不均勻性，其彈性模量會展現(xiàn)出孔隙率最大、絲徑最小截面位置的性能，相較于HOM，其彈性模量較低，可有效避免“應力遮擋”效應發(fā)生，進而減少骨吸收。另一方面由于HOM與BIO受幾何因素影響具有不同的摩擦系數(shù)。有研究[19-21]證實了增加植入體表面粗糙度利于人體組織在植入體表面的機械嵌合，利于表面成骨細胞的黏附、增殖和分化，還可以提高植入初期的穩(wěn)定性，減少植入后與骨界面間的相對運動。本研究中的BIO樣品與動物皮質(zhì)骨在不同載荷下實測的靜摩擦系數(shù)范圍為1.52～1.96，而HOM樣品為0.99～1.26。BIO表面摩擦力顯著大于HOM，可以為植入體初期植入后提供更大的骨-植界面摩擦，能夠大幅減少磨損微粒的數(shù)量，降低植入體周圍結(jié)締組織界膜內(nèi)慢性炎癥反應侵蝕作用，進而抑制骨溶解。

2.5 生物力學分析

圖12分別展示了肌腱組織與植入樣品間結(jié)合力拉伸測試示意圖、非植骨組與植骨組典型標本髕腱附麗點的拉力-位移圖。通過觀察拉伸試驗的拉力-位移曲線變化可以發(fā)現(xiàn)，典型的拉伸測試所獲得的曲線，有2個峰值。這是因為在拉伸過程中，當肌腱與試件的多孔結(jié)構(gòu)結(jié)合部位開始分離時，拉力曲線達到第1個峰值;隨著附麗點的分離，拉力值開始下降，當完全分離后，肌腱縫合線開始承受載荷時，拉力值開始回升并逐漸達到第2個峰值;當縫線從肌腱中拉出或斷裂后，拉力值再次開始下降。因此，重建肌腱附麗點分離失效時的最大拉力值可以判定為拉力-位移曲線的第1個峰值（即圖中的綠色標記位置）。同時，作為參照組，取2個正常羊髕腱附麗點標本處理后按測試方法進行拉伸試驗，記錄每個標本拉伸測試數(shù)據(jù)中第1個峰值為髕腱附麗點最大拉力值，所有測試結(jié)果的平均值見表4。結(jié)果顯示非植骨組和植骨組的標本均在1個月時抗拉強度最差，平均拉力分別為62.6 N和66.5 N。隨著術(shù)后恢復時間增加，最大拉力逐步增強，術(shù)后6個月時抗拉強度最高，平均拉力分別為204.0 N和163.2 N，但仍然低于正常羊的腱骨結(jié)合部位的最大拉力（452.1 N）。因此，是否植骨對髕腱附麗點最大拉力影響較小。

2.6 統(tǒng)計學分析

對于相同術(shù)后時間植骨組的Micro-CT三維重建結(jié)果，HOM與BIO標本內(nèi)剩余骨組織體積的變化趨勢一致，均隨術(shù)后時長的增加而降低。但仿生結(jié)構(gòu)的骨量平均值多于HOM，其抑制骨吸收效果更佳明顯。2種結(jié)構(gòu)的差異狀況采用差異性檢驗方法進行統(tǒng)計分析（見圖13a））。獨立樣本t檢驗結(jié)果顯示，在手術(shù)1個月（t=-0.030，p=0.978>0.05）、3個月（t=-0.555，p=0.608>0.05）以及6個月（t=-0.259，p=0.809>0.05）后，HOM與BIO的骨組織體積無顯著差異。對于生物力學試驗，非植骨組與植骨組髕腱附麗點拉力平均值均隨術(shù)后時長增加而增加，非植骨組樣品與肌腱間的結(jié)合力在術(shù)后3個月、6個月時大于植骨組。兩組間的差異狀況同樣采用差異性檢驗方法進行統(tǒng)計分析（見圖13b））。獨立樣本t檢驗結(jié)果顯示，在手術(shù)1個月（t=-0.469，p=0.663>0.05）以及3個月（t=1.039，p=0.357>0.05）后，非植骨組與植骨組的髕腱附麗點最大拉力值均無顯著差異;手術(shù)6個月后非植骨組的髕腱附麗點最大拉力值顯著大于植骨組（t=2.907，p=0.044<0.05），具有統(tǒng)計學意義。獨立樣本t檢驗結(jié)果顯示，當術(shù)后恢復時間較短時，非植骨組與植骨組髕腱附麗點最大拉力的均值無顯著差異，當術(shù)后時間達到6個月時，非植骨組與植骨組的髕腱附麗點最大拉力值呈現(xiàn)顯著差異，非植骨組顯著大于植骨組。

3 結(jié)論

本研究采用大動物模型探究了3D打印HOM與BIO鈦合金植入物重建試驗羊后肢臏腱附麗點的愈合情況，并通過植骨的方式來評估術(shù)中植骨對生物力學的影響。研究結(jié)果表明，HOM與BIO植入體術(shù)后均能與肌腱實現(xiàn)良好的愈合，新生肌腱組織可以長入鈦合金植入物的多孔結(jié)構(gòu)中，達到機械嵌合的效果，2種多孔結(jié)構(gòu)的組織學觀察結(jié)果相近，BIO抑制骨吸收的作用更加明顯。重建的肌腱附麗點可以承受拉力，最大拉力隨術(shù)后恢復時間的延長而逐步增加。在肌腱與鈦合金多孔結(jié)構(gòu)結(jié)合的局部植骨后，不同觀測時間點HOM與BIO的骨組織體積無顯著差異，但是骨質(zhì)會隨術(shù)后時間的增加而吸收減少，植骨與否對重建后的肌腱抗拉強度沒有明顯的影響。非植骨組與植骨組髕腱附麗點最大拉力的均值在術(shù)后6個月時呈現(xiàn)顯著差異，非植骨組顯著大于植骨組（t=2.907，p=0.044<0.05）。本研究涉及的動物實驗對于多孔鈦合金植入物的臨床前研究意義重大，可為3D打印定制個體化關(guān)節(jié)假體的實際臨床應用提供參考依據(jù)。

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收稿日期：2019-09-09

基金項目：北京市博士后科研活動經(jīng)費資助（2021-ZZ-075）;國家重點研發(fā)計劃（2020YFC1107502）

通信作者：劉曙光（1991—），男，博士，lsg_lsglsg@hotmail.com;許奎雪（1986—），男，高級工程師，xukuixue@126.com。