栽培一枝蒿粗多糖佐劑增強(qiáng)口蹄疫疫苗的皮下免疫效果

翁 翔，張愛蓮*，李泉曉，吳道澄，曹 輝

(1. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046； 2. 西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，西安 710000； 3. 天康生物股份有限公司，烏魯木齊 830000)

中草藥在人類和動(dòng)物傳染病防控過程中發(fā)揮著重要的作用，在流感、人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)、口蹄疫等疾病以及流行的埃博拉和新冠肺炎的治療過程中療效顯著[1-3]。中草藥的多種成分具有免疫調(diào)節(jié)活性，其中多糖能促進(jìn)免疫器官發(fā)育，增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DC)的吞噬能力，促進(jìn)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[4-5]。中草藥多糖作為疫苗佐劑已經(jīng)被系統(tǒng)和廣泛的研究，如，菊粉多糖AdvaxTM可作為流感、HIV、HBV、西尼羅河病毒和非洲馬熱病毒的疫苗佐劑，黃芪多糖可作為狂犬病滅活疫苗和口蹄疫疫苗的佐劑，人參水提物在H5N1禽流感疫苗和口蹄疫疫苗中具有良好的佐劑效果[6-9]。

口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)具有高度的傳染性，可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，接種疫苗是控制口蹄疫傳播的有效方法[10-11]。目前使用的是口蹄疫滅活疫苗(foot-and-mouth disease vaccine, FMDV)免疫原性較差，佐劑的應(yīng)用是提高疫苗效力的方法之一。現(xiàn)有口蹄疫滅活疫苗的佐劑主要有ISA-206、ISA-201、AS03、鋁佐劑[12]?，F(xiàn)有的口蹄疫商品疫苗中通常包含ISA-206油乳佐劑，雖然ISA-206能夠增強(qiáng)疫苗的效力，但是會(huì)引起注射部位壞死，肉芽腫和膿腫等不良反應(yīng)。由于口蹄疫疫苗佐劑的種類有限，隨著免疫協(xié)同概念的不斷深入，植物多糖佐劑與多種類型免疫激動(dòng)劑相結(jié)合的策略已被證明具有良好的免疫增強(qiáng)作用[9, 13]。因此，開發(fā)低副作用，低成本，高效的新型佐劑對(duì)口蹄疫的防治勢(shì)在必行。

新疆一枝蒿(ArtemisiarupestrisL.)是菊科蒿屬植物，作為中草藥具有抗病毒，抗炎，免疫調(diào)節(jié)等功能[14]。前期研究發(fā)現(xiàn)新疆野生一枝蒿粗多糖具有良好的佐劑效應(yīng)，作為流感疫苗，F(xiàn)MDV和OVA的佐劑可以增強(qiáng)抗原特異性的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答[15-17]。由于過度采集野生一枝蒿已經(jīng)成為瀕危物種，栽培一枝蒿已成功大面積種植，但是栽培一枝蒿活性成分的免疫調(diào)節(jié)作用還沒有進(jìn)行詳細(xì)研究。鑒于DC通過激活效應(yīng)T細(xì)胞啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答，中草藥及其活性成分可通過調(diào)節(jié)DC功能影響免疫應(yīng)答[18-19]。因此，本研究選用栽培一枝蒿粗多糖(cultivatedArtemisiarupestrisL. crude polysaccharides, CARCP)佐劑FMDV皮下免疫ICR小鼠，通過檢測(cè)小鼠體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，以及DC和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平，評(píng)價(jià)CARCP的佐劑活性，為CARCP作為FMDV的候選佐劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新疆栽培一枝蒿；口蹄疫滅活抗原(FMD-Ag)，ISA-206佐劑和口蹄疫滅活疫苗FMDV(FMD-Ag+ISA-206)均由天康生物股份有限公司提供；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、IgG2a和IgG1購(gòu)自Southbiotech公司；N-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購(gòu)買于藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自BI公司；青霉素/鏈霉素溶液購(gòu)自Hyclone公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購(gòu)自Biosharp公司；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒購(gòu)自eBioscience；流式抗體：異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD4、CD8a、MHC-Ⅱ，藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD3、CD44、Foxp3、CD11c，別藻藍(lán)蛋白(APC)標(biāo)記的CD4、CD25、CD86等均購(gòu)自BD公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 制備粗多糖

采用80 ℃水提醇沉法制備CARCP[20]，栽培一枝蒿粉末用無水乙醇脫色，以1∶20料液比加入蒸餾水，80 ℃浸提4 h，收集上清液，重復(fù)上述步驟，將上清液合并，真空旋蒸濃縮至200 mL，Sevag法除蛋白。最后加入4倍體積無水乙醇置于(4 ℃)過夜沉淀，收集沉淀烘干得到CARCP。苯酚/硫酸法測(cè)得多糖含量為35.65%。

1.3 疫苗配制

0.9% NaCl溶解CARCP配成50 mg·mL-1的多糖母液，疫苗配方是分別將FMD-Ag與ISA-206佐劑混勻或與添加CARCP的ISA-206按照體積比1∶1.1充分混合。將抗原和佐劑在自動(dòng)混合機(jī)中低速(300 r·min-1)混合攪拌10 min，最終形成水包油包水的雙乳狀液。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及免疫

SPF級(jí)雌性ICR小鼠(7～9周齡)購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。將小鼠隨機(jī)分為5組，每組6只，分別為0.9% NaCl組(空白對(duì)照)，F(xiàn)MDV組(試驗(yàn)對(duì)照)，F(xiàn)MDV-CARCP-L組(FMDV+CARCP 50 μg)，F(xiàn)MDV-CARCP-M組(FMDV+CARCP 300 μg)，F(xiàn)MDV-CARCP-H組(FMDV+CARCP 600 μg)。其中滅活抗原的劑量為0.3 μg，免疫總體積為150 μL，采用背部皮下2點(diǎn)免疫小鼠，共免疫兩次，間隔2周。初免后14 和21 d眼眶靜脈竇采血，收集血清用于抗體水平檢測(cè)，28 d收集小鼠脾和腹股溝淋巴結(jié)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群。用相同的免疫策略免疫小鼠后，用來檢測(cè)小鼠脾DC共刺激分子的表達(dá)和CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的表達(dá)。免疫后的小鼠每周稱量一次體重，監(jiān)測(cè)小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.5 血清IgG抗體及其亞類水平檢測(cè)

間接ELISA法檢測(cè)初免后14、21 d小鼠血清中IgG、IgG1和IgG2a抗體的水平。具體檢測(cè)方法：FMD-Ag用抗原包被液稀釋至0.125 μg·mL-1，每孔100 μL包被于ELISA板中，置于4 ℃過夜包被；用5%脫脂奶粉在37 ℃封閉1 h；將待測(cè)血清按照14 d血清1∶100稀釋，21 d血清1∶1 000稀釋，將稀釋后的血清加入ELISA板中，在37 ℃ 孵育1 h； 再加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG或IgG1或IgG2a，在37 ℃孵育1 h；最后用PBST洗滌3次，加入顯色液避光顯色15 min；加入2 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，檢測(cè)OD450 nm/OD655 nm吸光度(A)值。

1.6 淋巴結(jié)T細(xì)胞亞群以及脾DC與T細(xì)胞亞群檢測(cè)

無菌制備脾和淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞并將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×106個(gè)·mL-1，取100 μL單細(xì)胞懸液加入15 mL離心管，用含有0.5% FBS的PBS(PBSF)洗滌細(xì)胞，1 200 r·min-1離心7 min，棄上清，分別用CD3、CD8a、CD4、CD44熒光抗體染脾和淋巴結(jié)T細(xì)胞亞群；CD11c、MHC-Ⅱ、CD86熒光抗體染脾DC；加入熒光抗體避光染色30 min，PBSF終止染色，1 200 r·min-1離心7 min，棄上清，加入300 μL PBS吹散細(xì)胞，200目銅網(wǎng)過濾后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 脾調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)

每組隨機(jī)選取3只小鼠，制備1×107個(gè)·mL-1脾單細(xì)胞懸液，取100 μL細(xì)胞懸液加入PBSF 8 mL，1 200 r·min-1離心7 min，棄上清，獲得沉淀的細(xì)胞，加入CD25和CD4熒光抗體常溫避光染色30 min， PBSF終止染色，1 200 r·min-1離心7 min，棄上清后，使用Tregs檢測(cè)試劑盒處理細(xì)胞，F(xiàn)oxp3熒光抗體避光染色30 min，Wash buffer終止染色，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+T細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 CARCP對(duì)FMDV特異性IgG抗體及其亞類的影響

檢測(cè)初免后14和21 d血清IgG抗體水平，結(jié)果如圖1A所示：初免后14 d，CARCP中劑量組和高劑量組可以顯著提高血清IgG抗體水平(P<0.05)。初免后21 d，抗體水平較14 d有明顯提高，CARCP中劑量和高劑量組與FMDV組相比均可以顯著增加IgG抗體水平(P<0.05)。檢測(cè)IgG1抗體水平，結(jié)果如圖1B所示，CARCP中劑量和高劑量組能有效提高IgG1抗體亞類水平(P<0.05)。檢測(cè)IgG2a抗體水平，結(jié)果如圖1C所示，CARCP的三劑量均能極顯著增強(qiáng)IgG2a抗體水平(P<0.01)，其中CARCP中劑量為最優(yōu)劑量。

A. 14和21 d IgG抗體水平; B. 21 d IgG1抗體水平; C. 21 d IgG2a抗體水平。與FMDV免疫組相比, *.P<0.05, **.P<0.01, ***.P<0.001A. IgG antibody levels at 14 and 21 d; B. IgG1 antibody levels at 21 d; C. IgG2a antibody levels at 21 d;Compared with FMDV immune group, *.P<0.05, **.P<0.01;***. P<0.001圖1 CARCP對(duì)FMDV特異性IgG抗體及其亞類的影響(n=6)Fig.1 Effects of CARCP on FMDV-specific IgG antibody and subclass (n=6)

2.2 CARCP對(duì)淋巴結(jié)T細(xì)胞亞群的影響

二免后14 d，每組取3只小鼠，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴結(jié)T細(xì)胞亞群百分比，結(jié)果如圖2所示：與FMDV單獨(dú)免疫組相比，CARCP低劑量組和中劑量組CD3+CD4+T細(xì)胞百分比顯著提高(P<0.05)。CARCP中劑量組中CD3+CD8+T細(xì)胞百分比極顯著提高(P<0.01)。CARCP中劑量組CD4+CD44+效應(yīng)T細(xì)胞百分比極顯著提高(P<0.01)。CARCP中劑量組CD8+CD44+效應(yīng)T細(xì)胞百分比顯著提高(P<0.05)。

2.3 CARCP對(duì)脾T細(xì)胞亞群的影響

取二免后14 d小鼠脾，制備單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾T細(xì)胞亞群，結(jié)果如圖3所示： CARCP中劑量組CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞百分比顯著高于FMDV組(P<0.05)。CARCP中劑量組CD4+CD44+效應(yīng)T細(xì)胞百分比極顯著高于FMDV組(P<0.01)。CARCP低劑量組和CARCP中劑量組CD8+CD44+效應(yīng)T細(xì)胞百分比顯著高于FMDV組(P<0.05)。

2.4 CARCP對(duì)小鼠脾DC共刺激分子和對(duì)Tregs表達(dá)的影響

收集二免后14 d脾，制備單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫小鼠后CARCP對(duì)脾DC表面MHC-Ⅱ與CD86的表達(dá)，以及CD4+CD25+Foxp3+Tregs細(xì)胞的比例。結(jié)果如圖4所示，CARCP低、中、高3個(gè)劑量組與FMDV單獨(dú)免疫組相比，MHC-Ⅱ分子的表達(dá)顯著提高(P<0.05)。CARCP中劑量組CD86表達(dá)極顯著提高(P<0.01)。CARCP中劑量和高劑量組CD4+CD25+Foxp3+Tregs細(xì)胞的比例被顯著抑制(P<0.05)。

A. 淋巴結(jié)CD4+T細(xì)胞; B. 淋巴結(jié)CD8+T細(xì)胞; C. 淋巴結(jié)CD4+CD44+T細(xì)胞; D. 淋巴結(jié)CD8+CD44+T細(xì)胞。與FMDV免疫組相比, *.P<0.05, **.P<0.01A. Detection of lymph node CD4+T lymphocyte; B. Detection of lymph node CD8+T lymphocyte; C. Detection of lymph node CD4+CD44+T lymphocyte; D. Detection of lymph node CD8+CD44+T lymphocyte. Compared with FMDV immune group, *.P<0.05, **.P<0.01圖2 FACS檢測(cè)淋巴結(jié)T細(xì)胞亞群比例(n=3)Fig.2 Effect of CARCP on T cell subsets in lymph nodes (n=3)

2.5 CARCP處理對(duì)小鼠平均體重的影響

為評(píng)價(jià)CARCP對(duì)小鼠生長(zhǎng)是否造成影響，每周稱量1次小鼠體重，如圖5所示，發(fā)現(xiàn)小鼠體重的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。觀察FMDV組小鼠的注射部位，可以明顯發(fā)現(xiàn)在注射部位產(chǎn)生了皮下肉芽腫，2周之后肉芽腫未消退，添加CARCP組在注射部位未觀察到明顯的肉芽腫等局部反應(yīng)。免疫后也未發(fā)現(xiàn)CARCP對(duì)小鼠的飲食，活動(dòng)和毛發(fā)生長(zhǎng)造成不良的影響。

3 討 論

佐劑輔助疫苗在傳染病防治中發(fā)揮重要作用。由于對(duì)新型佐劑及其作用機(jī)制的探索有限，目前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)用于疫苗中的佐劑僅有鋁佐劑、MF59、AS03、AS04、AS01和CpG ODN等[21-22]。佐劑在增強(qiáng)疫苗效力的同時(shí)，安全性是很重要的問題，佐劑應(yīng)該足夠安全，以減少臨床應(yīng)用的副作用，因此，開發(fā)安全有效的新型佐劑很有必要[23]。中草藥多糖具有良好的免疫增強(qiáng)作用和低毒性成為新型佐劑篩選的理想材料，為此，本研究選用CARCP作為FMDV的候選佐劑，與ISA-206油乳劑相比，栽培一枝蒿粗多糖為水劑，可以與抗原任意比互溶，無需乳化，使用方便。在小鼠免疫后整個(gè)試驗(yàn)過程中，CARCP在注射部位的反應(yīng)原性更低，沒有出現(xiàn)ISA-206油乳劑注射小鼠后產(chǎn)生的皮下肉芽腫。試驗(yàn)組的小鼠，未見異常行為或副作用，對(duì)小鼠生長(zhǎng)也沒有影響，證實(shí)了CARCP提高了疫苗的安全性。

佐劑與疫苗免疫效果之間存在量效關(guān)系。合適劑量的佐劑與疫苗配伍才能誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答，發(fā)揮佐劑的效果[24]。因此，為了探討CARCP的最佳作用劑量，選用了CARCP的3個(gè)劑量，采用皮下注射進(jìn)行動(dòng)物免疫試驗(yàn)，通過對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答的檢測(cè)，確定CARCP的最佳劑量。抗體檢測(cè)結(jié)果表明，CARCP的中劑量和高劑量均可增強(qiáng)FMDV特異性抗體水平，初免后21 d的IgG抗體水平比初免后14 d有明顯升高。這些研究結(jié)果顯示：CARCP作為FMDV的水佐劑可以顯著提高體液免疫應(yīng)答。

A. 脾CD4+T細(xì)胞; B. 脾CD8+T細(xì)胞; C. 脾CD4+CD44+T細(xì)胞; D. 脾CD8+CD44+T細(xì)胞。與FMDV免疫組相比, *.P<0.05, **.P<0.01A. Detection of spleen CD4+T lymphocyte; B. Detection of spleen CD8+T lymphocyte; C. Detection of spleen CD4+CD44+T lymphocyte; D. Detection of spleen CD8+CD44+T lymphocyte. Compared with FMDV immune group, *.P<0.05, **.P<0.01圖3 FACS檢測(cè)脾T細(xì)胞亞群比例(n=3)Fig.3 Effect of CARCP on T cell subsets in spleen (n=3)

FMDV特異性的體液免疫對(duì)于保護(hù)易感動(dòng)物免受口蹄疫的威脅至關(guān)重要。但是，T細(xì)胞在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫對(duì)抗感染中發(fā)揮重要作用[25]。因此，本研究檢測(cè)了小鼠次級(jí)淋巴組織中T細(xì)胞亞群的表型，發(fā)現(xiàn)CARCP中劑量組可以增強(qiáng)小鼠脾和引流淋巴結(jié)中CD4、CD8、CD44 T細(xì)胞亞群的表達(dá)水平。這些結(jié)果提示，抗體水平的增強(qiáng)和效應(yīng)T細(xì)胞亞群水平的升高有關(guān)。雖然T細(xì)胞的活化在保護(hù)機(jī)體免受某些感染的作用中至關(guān)重要，理想的佐劑應(yīng)該能夠誘導(dǎo)Th1和Th2反應(yīng)，Th1反應(yīng)可以產(chǎn)生保護(hù)性免疫，Th2反應(yīng)可以激活B細(xì)胞增殖和分化，從而病毒和細(xì)菌感染時(shí)發(fā)揮防治作用[26]。T細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)抗體亞類的產(chǎn)生，IgG1抗體的產(chǎn)生與Th2免疫相關(guān)，IgG2a抗體的產(chǎn)生與Th1應(yīng)答有關(guān)。本研究抗體亞類IgG1和IgG2a的結(jié)果顯示，CARCP中劑量組可顯著升高IgG1和IgG2a水平，表明CARCP作為FMDV的佐劑可以促進(jìn)Th1和Th2免疫應(yīng)答。

以上研究結(jié)果表明，CARCP作為FMDV的佐劑可以顯著增強(qiáng)FMDV特異性的免疫應(yīng)答，促進(jìn)初始T細(xì)胞活化成為效應(yīng)T細(xì)胞。因此，可以推測(cè)CARCP佐劑FMDV也可能誘導(dǎo)DC成熟，降低Tregs頻率。DC成熟可啟動(dòng)對(duì)初始T細(xì)胞的適應(yīng)性免疫應(yīng)答[18]。Tregs減少可增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，保持機(jī)體的免疫平衡。本研究對(duì)免疫后小鼠的DC成熟和脾Tregs進(jìn)行了進(jìn)一步的探究，結(jié)果顯示，3個(gè)劑量的CARCP作為佐劑均可提高脾中DC表面CD86和MHC Ⅱ分子的表達(dá)，表明CARCP佐劑FMDV能夠活化DC并促進(jìn)其成熟，這些結(jié)果與T細(xì)胞亞型結(jié)果相關(guān)。此外，CARCP免疫小鼠后，CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的頻率受到抑制，表明CARCP佐劑FMDV通過促進(jìn)DC成熟和降低Tregs頻率來增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答。

免疫后相同時(shí)間各組之間體重差異不顯著，P>0.05No statistical difference between groups at the same time (P>0.05)圖5 CARCP對(duì)小鼠體重的影響(n=6)Fig.5 Effect of CARCP on body weight of mice(n=6)

4 結(jié) 論

通過小鼠體內(nèi)試驗(yàn)評(píng)價(jià)CARCP對(duì)FMDV特異性免疫應(yīng)答的特點(diǎn)，表明CARCP作為FMDV的水佐劑可以增強(qiáng)Th1和Th2免疫應(yīng)答，促進(jìn)T細(xì)胞活化，誘導(dǎo)DC成熟，抑制Tregs，并具有一定的安全性。這些研究結(jié)果為CARCP作為FMDV新型佐劑的研究提供重要試驗(yàn)參考。