Th1/Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)基因在巨噬細(xì)胞RAW264.7應(yīng)對細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴刺激時的表達(dá)譜研究

王正榮，馬 勛，張艷艷，孟季蒙,薄新文

(1.省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室/新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，石河子 832000； 2.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832000)

包蟲病是由棘球絳蟲幼蟲寄生于人或動物臟器引起的一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，該病是被世界衛(wèi)生組織嚴(yán)重忽視的疾病之一[1]。其中，細(xì)粒棘球絳蟲的幼蟲寄生導(dǎo)致的囊型包蟲病，是造成我國包蟲病流行的主要因素。同時由多房棘球絳蟲幼蟲寄生引起的泡型包蟲病在我國也有發(fā)生[1]。包蟲病給患者及其家庭造成嚴(yán)重的健康危害和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時給畜牧業(yè)帶來巨大損失。目前，該病已在全國二十幾個省份發(fā)生，主要分布在西北部分牧區(qū)，包括青海、西藏、新疆等地。據(jù)估計，我國包蟲病患者人數(shù)約為100萬，受威脅人口近6 600萬， 患者數(shù)量巨大。與現(xiàn)有的全球包蟲病流行數(shù)據(jù)相比，中國包蟲病受威脅人口數(shù)和患者人數(shù)仍居世界首位[1-2]。同時據(jù)農(nóng)業(yè)部門推算，全國每年患包蟲病的家畜在5 000萬頭以上，因家畜死亡和臟器廢棄造成的直接經(jīng)濟(jì)約30億元，是導(dǎo)致我國西部農(nóng)牧區(qū)群眾因病致貧、因病返貧的主要原因之一。

最近在免疫學(xué)方面的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些關(guān)于宿主應(yīng)對細(xì)粒棘球絳蟲固有免疫系統(tǒng)建立相關(guān)的一些證據(jù)。有學(xué)者利用流式細(xì)胞儀分析了感染細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴的BALB/c小鼠脾和血液中淋巴細(xì)胞亞群變化情況，為進(jìn)一步研究細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴感染的免疫機(jī)制提供試驗依據(jù)[3]。也有學(xué)者報道了宿主MHC-DRB1基因多態(tài)性與包蟲病抗性相關(guān)性方面的研究[4]。然而，有關(guān)棘球絳蟲與宿主動物相互作用的機(jī)制尚未被廣泛研究[5]。同時，由于細(xì)粒棘球絳蟲復(fù)雜的生命周期，以及各種免疫調(diào)節(jié)功能導(dǎo)致難以對其實施有效的控制措施，也阻礙了人用疫苗以及終末宿主疫苗的研發(fā)進(jìn)程。有文獻(xiàn)證明蠕蟲感染可以刺激宿主產(chǎn)生Th2型免疫保護(hù)反應(yīng)[6]。宿主對棘球絳蟲的免疫反應(yīng)可以經(jīng)典地分為適應(yīng)性免疫反應(yīng)和先天性免疫反應(yīng)[6]。先天性免疫反應(yīng)是宿主抵御各種寄生蟲感染的第一道防線[7]，寄生蟲通過模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，如toll樣受體(TOLLs)和核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體(NLRs)，識別與病原體相關(guān)的分子模式(PAMPs)。這些受體主要表達(dá)于宿主的免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，它們通過不同的機(jī)制調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)[7-9]。

巨噬細(xì)胞是一種重要的免疫細(xì)胞，在宿主固有免疫和適應(yīng)性免疫過程中均發(fā)揮著重要的作用。已有的研究表明，宿主巨噬細(xì)胞在抗細(xì)粒棘球絳蟲感染的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[10]。但目前仍未見系統(tǒng)解析巨噬細(xì)胞應(yīng)對細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴感染時其基因差異表達(dá)及調(diào)控機(jī)制的文獻(xiàn)報道。因此，本研究采用RNA-seq測序技術(shù)系統(tǒng)分析了巨噬細(xì)胞RAW264.7應(yīng)對細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴刺激過程中其基因的表達(dá)譜特性，以期篩選鑒定巨噬細(xì)胞RAW264.7抗細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴感染相關(guān)的功能分子。這些數(shù)據(jù)將為進(jìn)一步研究這些功能分子在巨噬細(xì)胞應(yīng)對細(xì)粒棘球絳蟲感染過程中發(fā)揮的作用及其調(diào)控機(jī)制提供新的視角，同時有望為控制包蟲病提供新的藥物以及疫苗靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

在屠宰場收集被細(xì)粒棘球絳蟲感染的帶有包囊的羊肝，帶回實驗室，無菌條件下抽取含有原頭蚴的包囊液，離心收集原頭蚴，用加有雙抗的PBS洗滌3～5次， 最后將收集的原頭蚴培養(yǎng)至含有10%胎牛血清以及雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液中，放至37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，待細(xì)胞生長穩(wěn)定時將其傳代培養(yǎng)至新的培養(yǎng)瓶，當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞交匯率達(dá)到80%時，接種細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴，接種濃度為每毫升2 000個， 設(shè)PBS為對照組，每組3個生物學(xué)重復(fù)，共培養(yǎng)6、24和72 h后，棄去培養(yǎng)上清液，然后胰酶消化收集RAW264.7細(xì)胞，將每組3個生物學(xué)重復(fù)做混池測序。

1.2 總RNA的提取、lncRNA庫的建立以及測序

使用美國Clontech 公司的SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing試劑盒進(jìn)行RAW264.7細(xì)胞的裂解和第一條cDNA鏈的合成，使用美國Beckman公司的AMPure XP beads試劑盒純化后，用美國Clontech 公司的Advantage 2 PCR kit試劑盒擴(kuò)增第一條cDNA鏈，并再次純化，最終得到雙鏈cDNA。Qubit 2.0定量檢測，合格后用Covaris系統(tǒng)超聲打斷雙鏈cDNA短片段進(jìn)行末端修復(fù)，加 A尾并連接測序接頭后，純化，選擇片段大小在200 bp左右的文庫進(jìn)行PCR富集得到最終的cDNA文庫。先使用 Qubit 2.0進(jìn)行文庫的初步定量，稀釋文庫至2 ng·μL-1，隨后用Agilent 2100對文庫的 insert size進(jìn)行檢測，符合預(yù)期后，使用qPCR方法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫有效濃度>2 nmol·μL-1)，以保證文庫質(zhì)量。文庫檢驗合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標(biāo)數(shù)據(jù)量的需求，進(jìn)行Hiseq/MiSeq測序。

使用Tophat v2.0.12將得到的原始測序序列比對到小鼠參考基因組上，用Cufflinks v2.1.1軟件組裝出高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄本，用Cuffcompare v2.2.1將其與已注釋的轉(zhuǎn)錄本信息進(jìn)行比較，得到潛在的轉(zhuǎn)錄本。

1.3 差異基因的表達(dá)分析

使用Stringtie v2.1.1軟件對轉(zhuǎn)錄本在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行表達(dá)量分析，皮爾遜相關(guān)系數(shù)表示樣品間基因的表達(dá)水平相關(guān)性，使用R語言的procmp函數(shù)，根據(jù)表達(dá)量對各樣品進(jìn)行PCA主成分分析。采用DESeq(1.18.0)對轉(zhuǎn)錄本表達(dá)進(jìn)行差異分析，篩選條件為表達(dá)差異倍數(shù)|log2Fold Change|>1，顯著性Pvalue<0.05。

使用R語言ggplots 2 v3.3.5軟件包繪制差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的火山圖，Pheatmap v1.0.12軟件包根據(jù)同一轉(zhuǎn)錄本在不同樣品中的表達(dá)水平和同一樣品中不同轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)模式進(jìn)行聚類，采用Euclidan方法計算距離，使用層次聚類最長距離法進(jìn)行聚類。

1.4 差異表達(dá)基因的GO分析

對于差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，利用GO(gene ontology，www.geneontology.org)對其進(jìn)行功能聚類分析。研究差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本在 Gene Ontology 中的分布狀況將闡明試驗中樣本差異在基因功能上的體現(xiàn)。

1.5 差異表達(dá)基因的KEGG分析

采用KEGG(kyoto encyclopedie of genes and genomes，www.kegg.jp/kegg/pathway)數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)的基因進(jìn)行了信號通路分析，通過 Pathway 顯著性富集能確定特異基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。具體分析方法是以 KEGG Pathway 為單位，應(yīng)用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在特異基因中顯著性富集的pathway，最終將FDR≤0.05的pathway定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的pathway。

1.6 部分差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄水平分析

將無菌采集的細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴保存于液氮中，備用。總RNA提取采用美國Invitrogen公司的 Trizol Reagent 試劑，提取方法參照試劑說明書實驗步驟進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄采用康為世紀(jì)公司10 μL反轉(zhuǎn)錄體系的CW2582 cDNA合成試劑盒。靶標(biāo)基因的qRT-PCR擴(kuò)增引物由本實驗室采用Primer 3.0在線軟件設(shè)計，詳細(xì)情況見表1。

表1 實時定量PCR試驗相關(guān)引物

以上述cDNA為模板，以gapdh為內(nèi)參基因，對隨機(jī)篩選的差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：SYBR PremixExTaqMix(2×) 10 μL， 上游引物(10 mmol·L-1)0.4 μL，下游引物(10 mmol·L-1)0.4 μL ， cDNA1 μL，加ddH2O 至20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。每個基因做三個重復(fù)，采用相對比較△Ct(Qr=2-△△Ct)[11]法計算目的基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 巨噬細(xì)胞RAW264.7與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴共培養(yǎng)6 h差異基因表達(dá)分析

當(dāng)巨噬細(xì)胞RAW264.7與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴共培養(yǎng)6 h時，和PBS對照組相比，原頭蚴處理組的RAW264.7細(xì)胞共有848個基因的表達(dá)出現(xiàn)顯著變化，其中415個基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，433個基因出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。GO分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集在GO功能聚類的生物過程(BP)中的細(xì)胞代謝過程等；細(xì)胞組分(CC)中的細(xì)胞以及細(xì)胞組分等；分子功能(MF)中的DNA、RNA、蛋白及各種酶的結(jié)合等。KEGG信號通路的分析結(jié)果表明差異表達(dá)的基因主要參與自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、病毒致癌物形成、HIF-1信號通路、AMPK信號通路、胰島素信號通路以及FoxO等信號通路。詳見圖1。

圖1 原頭蚴(PSC)與RAW264.7共培養(yǎng)6 h差異表達(dá)基因的火山圖、GO分析以及KEGG分析圖Fig.1 Volcano plot，heatmap and KEGG of differentially expressed genes in RAW264.7 co-cultured with Echinococcus granulosus protoscoleces(PSC)for 6 hours

2.2 巨噬細(xì)胞RAW264.7與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴共培養(yǎng)6 h Th1、Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)基因的差異表達(dá)

當(dāng)巨噬細(xì)胞RAW264.7與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴共培養(yǎng)6 h時，共有31個Th1、Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)出現(xiàn)顯著變化，其中16個基因出現(xiàn)顯著上調(diào)，15個出現(xiàn)顯著下調(diào)。包括8個germline-encode receptor，其中3個上調(diào)，5個下調(diào)；15個PRRs下游相關(guān)分子，其中5個上調(diào)，10個下調(diào)；以及8個PRRs下游相關(guān)效應(yīng)分子，其中7個上調(diào)，1個 下調(diào)。詳見圖2、表2。

2.3 巨噬細(xì)胞RAW264.7與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴共培養(yǎng)24 h差異基因表達(dá)分析

當(dāng)巨噬細(xì)胞RAW264.7與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴共培養(yǎng)24 h時，和PBS對照組相比，原頭蚴處理組的RAW264.7細(xì)胞共有3 745個基因的表達(dá)出現(xiàn)顯著變化，其中1 159個基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，2 586個基因 出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。GO分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集在GO功能聚類的生物過程(BP)中的代謝過程、初級代謝過程、有機(jī)物代謝過程以及細(xì)胞代謝過程等；細(xì)胞組分(CC)中的細(xì)胞內(nèi)組分、細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞器以及膜結(jié)構(gòu)細(xì)胞器等。KEGG信號通路的分析結(jié)果表明差異表達(dá)的基因主要參與代謝通路、核糖體通路、剪接體通路、RNA轉(zhuǎn)運以及泛素介導(dǎo)的蛋白水解等通路。詳見圖3。

圖2 原頭蚴(PSC)與RAW264.7共培養(yǎng)6 h Th1、Th2免疫反應(yīng)相關(guān)基因差異表達(dá)聚類熱圖及部分基因的qRT-PCR驗證Fig.2 The heatmap of the differential expression genes in the RAW264.7 related to Th1 and Th2 immune response during the protoscoleces(PSC)and RAW264.7 co-cultured for 6 hours and validation of the differntially expressed genes by qRT-PCR

表2 巨噬細(xì)胞RAW264.7與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴共培養(yǎng)6 h Th1、Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)基因的差異表達(dá)

2.4 巨噬細(xì)胞RAW264.7與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴共培養(yǎng)24 h Th1、Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)基因的差異表達(dá)

當(dāng)巨噬細(xì)胞RAW264.7與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴共培養(yǎng)24 h時，共有111個Th1、Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)出現(xiàn)顯著變化，其中34個基因出現(xiàn)顯著上調(diào)，78個出現(xiàn)顯著下調(diào)。包括50個germline-encode receptor，其中18個上調(diào)，32個下調(diào)；53個 PRRs下游相關(guān)分子，其中12個上調(diào)，41個下調(diào)；以及8個PRRs下游相關(guān)效應(yīng)分子，其中4個上調(diào)，4個下調(diào)。詳見圖4、表3。

2.5 巨噬細(xì)胞RAW264.7與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴共培養(yǎng)72 h差異基因表達(dá)分析

當(dāng)巨噬細(xì)胞RAW264.7與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴共培養(yǎng)72 h時，和PBS對照組相比，原頭蚴處理組的RAW264.7細(xì)胞共有7 009個基因的表達(dá)出現(xiàn)顯著變化，其中2 237個基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，4 772個基因出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。GO分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集在GO功能聚類的生物過程(BP)中的代謝過程、初級代謝過程、有機(jī)物代謝過程以及細(xì)胞代謝過程等；細(xì)胞組分(CC)中的細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞內(nèi)組分、細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞器以及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器等。KEGG信號通路的分析結(jié)果表明差異表達(dá)的基因主要參與代謝通路、老年癡呆癥通路、亨廷頓氏病通路、癌癥通路、PI3K-Akt通路、內(nèi)吞通路以及MAPK等通路。詳見圖5。

圖3 原頭蚴(PSC)與RAW264.7共培養(yǎng)24 h差異表達(dá)基因的火山圖、GO分析以及KEGG分析圖Fig.3 Volcano plot，heatmap and KEGG of differentially expressed genes in RAW264.7 co-cultured with Echinococcus granulosus protoscoleces(PSC)for 24 hours

圖4 原頭蚴(PSC)與RAW264.7共培養(yǎng)24 h Th1、Th2免疫反應(yīng)相關(guān)基因差異表達(dá)聚類熱圖及部分基因的qRT-PCR驗證Fig.4 The heatmap of the differential expression genes in the RAW264.7 related to Th1 and Th2 immune response during the protoscoleces(PSC)and RAW264.7 co-cultured for 24 hours and validation of the differntially expressed genes by qRT-PCR

表3 巨噬細(xì)胞RAW264.7與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴共培養(yǎng)24 h Th1、Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)基因的差異表達(dá)

圖5 原頭蚴(PSC)與RAW264.7共培養(yǎng)72 h差異表達(dá)基因的火山圖、GO分析以及KEGG分析圖Fig.5 Volcano plot，heatmap and KEGG of differentially expressed genes in RAW264.7 co-cultured with Echinocolcus granulosus protoscoleces(PSC)for 72 hours

2.6 巨噬細(xì)胞RAW264.7與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴共培養(yǎng)72 h Th1、Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)基因的差異表達(dá)

我們的分析結(jié)果顯示，當(dāng)巨噬細(xì)胞RAW264.7與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴共培養(yǎng)72 h時，共有212個Th1、Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)出現(xiàn)顯著變化，其中50個基因出現(xiàn)顯著上調(diào)，162個出現(xiàn)顯著下調(diào)。包括78個germline-encode receptor，其中20個上調(diào)，58個下調(diào)；97個PRRs下游相關(guān)分子，其中16上調(diào)，81下調(diào)；以及37個PRRs下游相關(guān)效應(yīng)分子，其中14個上調(diào)，23個下調(diào)。詳見圖6、表4。

圖6 原頭蚴(PSC)與RAW264.7共培養(yǎng)72 h Th1、Th2免疫反應(yīng)相關(guān)基因差異表達(dá)聚類熱圖及部分基因的qRT-PCR驗證Fig.6 The heatmap of the differential expression genes in the RAW264.7 related to Th1 and Th2 immune response during the protoscoleces(PSC)and RAW264.7 co-cultured for 72 hours and validation of the differntially expressed genes by qRT-PCR

表4 巨噬細(xì)胞RAW264.7與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴共培養(yǎng)72 h Th1、Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)基因的差異表達(dá)

3 討 論

迄今為止，研究者已經(jīng)對先天免疫系統(tǒng)控制1型免疫反應(yīng)抵抗病原微生物做了大量研究。宿主體內(nèi)有一組胚系基因編碼受體，也稱為模式識別受體(PRRs)，可以識別病原體相關(guān)的分子模式(PAMPs)，這些分子是來自病原體的保守分子[12]。PRRs對PAMPs的識別可以激活下游信號通路，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄[13]。相比之下，寄生蟲已經(jīng)發(fā)展出復(fù)雜的策略，可以將宿主的免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡仔缘?型免疫反應(yīng)[14-16]，而人們對先天免疫系統(tǒng)如何控制2型免疫卻知之甚少。一些來自蠕蟲的產(chǎn)物可以作為免疫調(diào)節(jié)劑被宿主PRRs識別。TLR4可以識別嚙齒類絲蟲的排泄分泌產(chǎn)物ES-62，使宿主的免疫反應(yīng)偏向于抗炎的Th2表型[17]。由曼氏血吸蟲卵可溶性提取物制備的碳水化合物免疫調(diào)節(jié)劑LNFPIII通過激活非典型NF-κB家族成員BCL3，以DC-SIGN和TLR4依賴的方式驅(qū)動Th2極化[18-19]。此外，來源于曼氏血吸蟲蟲卵和成蟲的脂質(zhì)，可以激活TLR2并使樹突狀細(xì)胞成熟極化，導(dǎo)致機(jī)體偏向Th2免疫反應(yīng)[20-21]。

本研究結(jié)果表明，當(dāng)細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7時，可引起巨噬細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的差異表達(dá)。并且不同的時間點，差異表達(dá)的基因也在發(fā)生變化，進(jìn)而調(diào)控不同的免疫反應(yīng)。當(dāng)細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7 6 h后，上調(diào)表達(dá)的基因主要參與MAPK通路、TNF通路、Rap1通路、TGF-beta通路、趨化因子通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路以及Fc受體介導(dǎo)的吞噬通路等。其中MAPK通路在細(xì)胞將外界刺激轉(zhuǎn)化為一系列細(xì)胞反應(yīng)過程起著關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞生長、遷移、增殖、分化和凋亡[22-23]。而TNF是由活化的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞表達(dá)的一種強(qiáng)有力的促炎性細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)不同的細(xì)胞反應(yīng)，參與調(diào)控從細(xì)胞凋亡到早期炎癥和獲得性免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)。TNF可以誘導(dǎo) NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞存活(和促炎癥)途徑，或者根據(jù)細(xì)胞情況誘導(dǎo)凋亡反應(yīng)[24]。研究發(fā)現(xiàn)克氏錐蟲、弓形蟲、惡性瘧原蟲等的感染，都能激活NF-κB的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)寄生蟲的復(fù)制[25-28]。同時研究還表明，胞內(nèi)寄生的旋毛蟲的感染，可以誘導(dǎo)機(jī)體感染肌肉細(xì)胞中TNF、TNFR1、TRADD、caspase-3、caspase-8、TRAF-2以及RIP 的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或者誘導(dǎo)肌肉細(xì)胞轉(zhuǎn)化為滋養(yǎng)細(xì)胞[29]。而FcγR受體是機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫的重要紐帶，表達(dá)于淋巴細(xì)胞的FcγR受體具有介導(dǎo)細(xì)胞吞噬、抗體依賴性細(xì)胞毒性、釋放炎癥介質(zhì)、產(chǎn)生氧自由基和調(diào)節(jié)抗體產(chǎn)生等免疫效應(yīng)功能[30]。Rap1屬于RAS家族中小的GTPases，它參與了多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)。Rap1在哺乳動物細(xì)胞中的功能相對保守，包括細(xì)胞極性、底物和細(xì)胞-細(xì)胞黏附以及其他涉及細(xì)胞骨架動力學(xué)調(diào)節(jié)的過程[31]。當(dāng)細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7 24 h后，上調(diào)表達(dá)的基因主要富集在代謝通路、核糖體通路、Rap1通路、HIF-1通路、PI3K-Akt通路、MAPK通路以及泛素介導(dǎo)的蛋白水解等通路。當(dāng)細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7 72 h后，上調(diào)表達(dá)的基因主要富集在代謝通路、HIF-1通路、剪切體及泛素介導(dǎo)的蛋白水解等通路，但與細(xì)胞炎性免疫相關(guān)的MAPK通路、TNF通路和Fc受體介導(dǎo)的吞噬通路等均出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的趨勢，在整個過程中，泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路一直處于上調(diào)表達(dá)的狀態(tài)。綜上，從細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7不同時間點差異表達(dá)基因的KEGG富集結(jié)果可以得出以下結(jié)論，在蟲體刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7 6、24 h時，巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)主要以炎性反應(yīng)為主，而當(dāng)互作72 h，巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)則變?yōu)橐砸盅追磻?yīng)為主。

模式識別受體(PRRs)能識別病原體相關(guān)的分子模式，激活下游信號通路，調(diào)節(jié)宿主對病原體的免疫反應(yīng)。PRRs包括Toll樣受體(TLR)、NOD樣受體(NLR)、RIG樣受體(RLR)、C型凝集素受體(CLR)、甘露糖受體以及清道夫受體等。因此，為了解析巨噬細(xì)胞中PRRs在應(yīng)對細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴刺激時功能，本研究系統(tǒng)分析了不同作用時間點巨噬細(xì)胞PRRs及其相關(guān)分子的差異表達(dá)情況。結(jié)果表明，原頭蚴刺激可引起巨噬細(xì)胞中PRRs及其相關(guān)分子的差異表達(dá)，并隨著刺激時間的不同而不同。當(dāng)原頭蚴刺激巨噬細(xì)胞6 h時，清道夫受體CD36以及G蛋白偶聯(lián)受體Adgre5的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，同時PRRs下游相關(guān)效應(yīng)分子Tnfrsf1a和Ifnar1的表達(dá)也出現(xiàn)上調(diào)。其中，CD36是一種膜蛋白，存在于各種類型的細(xì)胞中，包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。是一種多配體受體，參與葡萄糖和脂質(zhì)代謝、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、血栓形成和纖維化等過程[32]。巨噬細(xì)胞CD36通過與氧化型低密度脂蛋白的相互作用，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)[33]。Tnfrsf1a屬于腫瘤壞死因子超家族，其編碼的受體可以調(diào)控炎型細(xì)胞因子的活性[34]。而Ifnar1是一種可以激活細(xì)胞表達(dá)一型干擾素的受體，該受體表達(dá)于所有的有核細(xì)胞[35]。當(dāng)原頭蚴刺激巨噬細(xì)胞24 h時，C型凝集素受體Reg1、Reg2、Reg3b、Reg3d、Reg3a和Reg3g的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，研究表明，C 型凝集素受體作為模式識別受體的重要成員，通過識別和結(jié)合微生物表面的碳水化合物，在區(qū)分自我和非自我的先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[36]。近期的研究表明，有3個宿主來源的C 型凝集素受體可以識別弓形蟲卵囊壁抗原，可能在宿主的先天免疫中起到重要作用[37]。同時，研究發(fā)現(xiàn)宿主來源的C 型凝集素受體Mgl-1和 mcl 是犬弓首蛔蟲感染過程中潛在的免疫調(diào)節(jié)基因[38]。PRRs下游相關(guān)效應(yīng)分子Fam132a、Cbln2和Tnfrsf12a的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，其中Fam132a和Cbln2屬于腫瘤壞死因子樣的結(jié)構(gòu)域，而Tnfrsf12a屬于腫瘤壞死因子受體12，都屬于炎型細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子。當(dāng)原頭蚴刺激巨噬細(xì)胞72 h時，有12個富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白LRRCs包括Lrrc7、Fbxl22、Lrrc4b、Lrrc63、Epyc、Xrra1、Snrpa1、Atp5s、Anp32a、Lrrc28、Anp32b和Lrrc40的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，LRRCs是一種與先天免疫反應(yīng)相關(guān)的蛋白，在許多物種中相對保守。國內(nèi)的研究者發(fā)現(xiàn)長角血蜱體內(nèi)表達(dá)LRRCs，此蛋白可以抑制蜱蟲體內(nèi)寄生巴貝斯蟲的生長[39]。弓形蟲的感染可以激活宿主LRRCs的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控宿主對感染的抵抗[40]。同時有6個G蛋白偶聯(lián)受體GPCRs，包括Olfr456、Olfr837、Olfr600、Olfr1170、Olfr933和Olfr482的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)。GPCRs是細(xì)胞表面最大的受體家族，它們負(fù)責(zé)細(xì)胞外信號的傳導(dǎo)，幾乎調(diào)節(jié)哺乳動物生理的所有方面[41]。Olfr型的受體可以被短鏈脂肪酸乙酸酯和丙酸酯激活，此類受體可以介導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)[42]。對PRRs下游效應(yīng)分子分析結(jié)果顯示，IL-4和IL-6的表達(dá)呈上調(diào)趨勢，這兩個細(xì)胞因子是典型的Th2型免疫反應(yīng)調(diào)控細(xì)胞因子，而Th2型免疫反應(yīng)屬于炎癥抑制反應(yīng)[43]。綜上所述，細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴的刺激，可以使巨噬細(xì)胞中部分C型凝集素受體、G蛋白偶聯(lián)受體GPCRs以及富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白LRRCs的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)。由此推測，上述受體可能在巨噬細(xì)胞免疫識別細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴的過程過發(fā)揮作用，但其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。同時，對PRRs下游效應(yīng)分子的分析結(jié)果提示，細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴刺激巨噬細(xì)胞6、24 h，細(xì)胞主要以炎癥反應(yīng)為主，而當(dāng)細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴刺激巨噬細(xì)胞72 h，巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)則以炎癥抑制反應(yīng)為主，此結(jié)果與差異表達(dá)基因KEGG分析結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

系統(tǒng)解析了巨噬細(xì)胞RAW264.7應(yīng)對細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴刺激時其免疫相關(guān)基因的差異表達(dá)譜規(guī)律，篩選鑒定出了大量與巨噬細(xì)胞抗細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴感染相關(guān)的模式識別受體PRRs以及其下游效應(yīng)分子。為進(jìn)一步揭示宿主巨噬細(xì)胞與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴免疫互作調(diào)控機(jī)制提供了理論數(shù)據(jù)，同時為囊型包蟲病疫苗和藥物的研發(fā)提供了新的視角。