化膿隱秘桿菌肝素結(jié)合蛋白的提取及鐵結(jié)合蛋白的黏附特性分析

沈克飛，許國(guó)洋，付利芝，楊 柳，牟 豪，張素輝*

(1. 重慶市畜牧科學(xué)院, 重慶 402460； 2. 重慶市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，重慶 402460)

化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogenes)是家養(yǎng)和野生動(dòng)物化膿性感染的常見病原菌，感染造成組織器官膿腫、化膿性炎癥、纖維化、壞死及流產(chǎn)、死胎等[1]。近年來(lái)，化膿隱秘桿菌相關(guān)疾病在豬、牛、羊等動(dòng)物上的發(fā)病率逐漸增加，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)較大經(jīng)濟(jì)損失[2-8]?；撾[秘桿菌是一種革蘭陽(yáng)性菌，常見于動(dòng)物上呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道黏膜，是動(dòng)物和人的條件性致病菌[1, 9]。

病原體與宿主硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans, HSPGs)的相互作用能增進(jìn)微生物黏附和侵入宿主細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)發(fā)病[10-12]。HSPGs是廣泛分布于宿主細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)的一類黏多糖，由與核心蛋白連接的硫酸乙酰氨基葡聚糖(glycosaminoglycans, GAGs)組成。GAGs是一種陰離子線性多糖，由重復(fù)的二糖組成，包括肝素、硫酸乙酰肝素等。研究發(fā)現(xiàn)，肝素可劑量依賴性地抑制化膿隱秘桿菌黏附HeLa細(xì)胞[13]，提示化膿隱秘桿菌能利用自身的肝素結(jié)合蛋白黏附宿主細(xì)胞。最近，利用肝素瓊脂糖凝膠從化膿隱秘桿菌菌體蛋白中提取到包含鐵結(jié)合蛋白(iron-binding protein, IBP)在內(nèi)的多種ATP結(jié)合盒(ATP binding cassette, ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物結(jié)合蛋白(substrate binding proteins, SBPs)。IBP是化膿隱秘桿菌的1種抗原[14]，在化膿隱秘桿菌自然感染的山羊血清中能檢測(cè)到針對(duì)IBP的抗體，提示其在感染中會(huì)表達(dá)。目前尚無(wú)關(guān)于IBP參與化膿隱秘桿菌黏附宿主細(xì)胞的研究報(bào)道。因此，本研究在IBP黏附肝素、宿主細(xì)胞及IBP抗血清抑制黏附方面進(jìn)行了分析，為化膿隱秘桿菌與宿主細(xì)胞的相互作用提供了新認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、菌株、抗血清 MDBK細(xì)胞、山羊源化膿隱秘桿菌、含pGEX-4T-1-IBP重組質(zhì)粒的BL21(DE3)重組菌株及小鼠抗rIBP血清[14]、GST及其小鼠抗血清、自然感染化膿隱秘桿菌山羊血清[15]由重慶畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存和提供。

1.1.2 主要試劑 新生胎牛血清、Roswell Park Memoria Institute-1640(RPMI-1640)培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購(gòu)自Hyclone公司；小鼠抗GST單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的驢抗山羊IgG抗體或山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自EarthOx公司；Gluthathione-Sepharose 4B購(gòu)自Pharmacia公司；肝素、還原性谷胱甘肽購(gòu)自Sigma-Alorich公司；BCTP/NBT購(gòu)自上海生工；肝素瓊脂糖珠購(gòu)自索萊寶公司；Quick Start Bradford購(gòu)自BioRad公司。

1.2 肝素結(jié)合蛋白的提取與質(zhì)譜鑒定

化膿隱秘桿菌單菌落接種于含8%小牛血清的TSB培養(yǎng)基，37 ℃振搖培養(yǎng)48 h。7 000 ×g離心10 min，菌體沉淀用 Tris-HCl (0.02 mol·L-1，pH8.0)懸浮，洗3次。每300 mL培養(yǎng)物所得菌體沉淀用20 mL Tris-HCl 懸浮，加入蛋白酶抑制劑。冰水浴中超聲裂解菌懸液(超聲功率為300 W，工作4 s間歇5 s，超聲裂解15 min)。12 000 ×g離心30 min，上清用0.22 μm濾膜過(guò)濾，即為菌體蛋白。吸取200 μL充分混懸的肝素瓊脂糖凝膠，用Tris-HCl 洗3次，加入1.2 mL菌體蛋白，4 ℃下?lián)u動(dòng)孵育2 h，用含0.15 mol·L-1NaCl的Tris-HCl 洗3次， 用含0.5 mol·L-1NaCl的Tris-HCl洗脫。采用SDS-PAGE檢測(cè)提取的蛋白質(zhì)。采用LC-MS/MS方法對(duì)肝素瓊脂糖凝膠提取的樣品進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.3 重組蛋白的制備

質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示所提取的蛋白中存在IBP，按參考文獻(xiàn)[14]所描述的方法制備重組蛋白rIBP。簡(jiǎn)單步驟如下：37 ℃下振搖培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)OD600 nm約為1時(shí)，加入終濃度0.1 mmol·L-1IPTG，37 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)3 h。培養(yǎng)物4 ℃5 000 ×g離心30 min，每100 mL培養(yǎng)液加20 mL PBS以懸浮菌體沉淀，冰水浴中超聲裂解菌懸液(超聲功率為300 W，工作4 s間歇5 s，超聲裂解15 min)。裂解物12 000 ×g離心10 min，向裂解物中加入終濃度1% Trition X-100，4 ℃振搖孵育30 min，5 000 ×g離心30 min，收集上清。每20 mL上清加入300 μL Gluthathione-Sepharose 4B，4 ℃攪動(dòng)孵育1 h。PBS洗滌3次后用10 mmol·L-1還原性谷胱甘肽洗脫。采用SDS-PAGE分析純化效果，采用透析法去除其中的還原性谷胱甘肽，使用Bradford法定量蛋白質(zhì)濃度。

1.4 免疫印跡檢測(cè)IBP

純化的rIBP經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，采用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗3次后與自然感染化膿隱秘桿菌山羊血清或rIBP免疫小鼠血清(1∶1 00稀釋)孵育，TBST洗3次后與堿性磷酸酶標(biāo)記的驢抗山羊IgG抗體或山羊抗小鼠IgG抗體(1∶2 000稀釋)孵育，最后置于BCTP/NBT顯色，以檢測(cè)血清中存在抗IBP抗體。

將化膿隱秘桿菌菌體蛋白及肝素瓊脂糖凝膠提取的菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，采用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗3次后與自然感染化膿隱秘桿菌山羊血清或小鼠抗rIBP血清(1∶100稀釋)孵育，TBST洗3次后與堿性磷酸酶標(biāo)記的驢抗山羊IgG抗體或山羊抗小鼠IgG抗體(1∶2 000稀釋)孵育，最后置于BCTP/NBT顯色，以驗(yàn)證化膿隱秘桿菌菌體蛋白及肝素瓊脂糖凝膠提取的蛋白中存在IBP。

1.5 rIBP肝素結(jié)合與結(jié)合抑制分析

充分混勻肝素瓊脂糖凝膠，吸取懸浮液30 μL加入離心管中，用預(yù)冷的100 μL PBS洗滌3次。向洗好的肝素瓊脂糖凝膠加入30 μL 0.3 mg·mL-1rIBP，顛倒混勻，4 ℃下緩慢搖動(dòng)孵育1 h。4 ℃下3 000 ×g離心5 min，肝素瓊脂糖凝膠沉淀用200 μL 預(yù)冷NaCl溶液洗3次，NaCl濃度依次為0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol·L-1。向凝膠加入40 μL SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴10 min，采用SDS-PAGE分析rIBP與肝素的結(jié)合情況。

用PBS溶液溶解肝素配制肝素溶液。按表1加入各組分，按肝素濃度分為4個(gè)處理組、肝素濃度依次為0、10、30、90 mg·mL-1?；靹?，4 ℃下緩慢搖動(dòng)孵育1 h。4 ℃下3 000×g離心10 min,保留沉淀。按上述方法進(jìn)行免疫印跡分析，一抗為小鼠抗GST單克隆抗體(1∶2 000稀釋)，二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(1∶2 000稀釋)。

表1 肝素結(jié)合抑制分析

rIBP和GST抗血清用PBS進(jìn)行1∶10稀釋。將肝素瓊脂糖凝膠、rIBP(0.3 mg·mL-1)、稀釋的rIBP或GST抗血清加入1.5 mL離心管中，各組分均為60 μL，混勻，4 ℃下緩慢搖動(dòng)孵育1 h。4 ℃下3 000 ×g離心10 min，凝膠用0.1 mL 預(yù)冷0.9%NaCl洗3次。向凝膠加入40 μL SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴10 min，采用免疫印跡分析抗血清對(duì)rIBP結(jié)合肝素的抑制作用，一抗為小鼠抗GST單克隆抗體(1∶2 000稀釋)，二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(1∶2 000稀釋)。

1.6 rIBP細(xì)胞黏附分析

用胰酶(0.05%胰酶，0.02% EDTA)消化長(zhǎng)滿單層的MDBK細(xì)胞，用RPMI-1640洗3次，將細(xì)胞制備成1010個(gè)·mL-1備用。將蛋白質(zhì)(GST、rIBP)的濃度調(diào)整為0.3 mg·mL-1。按表2加入各組分，按蛋白質(zhì)濃度分為4個(gè)處理組，蛋白質(zhì)濃度依次為0、0.015、0.045 和0.135 mg·mL-1。顛倒混勻各組分，4 ℃下緩慢搖動(dòng)孵育1 h。4 ℃下800 r·min-1離心10 min， 沉淀用1 mL 預(yù)冷PBS洗3次。樣本經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗3次后與小鼠抗GST單克隆抗體(1∶2 000稀釋)孵育，TBST洗3次后與堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶2 000稀釋)孵育，最后置于BCTP/NBT顯色。

表2 rIBP細(xì)胞黏附分析

1.7 rIBP抗血清抑制細(xì)菌黏附細(xì)胞分析

2 結(jié) 果

2.1 肝素結(jié)合蛋白的提取與質(zhì)譜鑒定

SDS-PAGE顯示，利用肝素瓊脂糖凝膠從化膿隱秘桿菌菌體蛋白中提取到蛋白，提取后蛋白質(zhì)條帶數(shù)量明顯減少，部分條帶得到明顯富集(圖1A、B)。蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定得出，所提取的蛋白包含IBP等多種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體SBP(表3)。

A.肝素瓊脂糖凝膠提取的蛋白；B. 菌體蛋白；M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 蛋白質(zhì)樣品A. Proteins extracted by heparin agarose gel; B. Bacterial proteins; M. Protein marker; 1. Protein sample圖1 SDS-PAGE分析肝素瓊脂糖凝膠提取的化膿隱秘桿菌蛋白質(zhì)Fig.1 SDS-PAGE analysis of the proteins extracted from Trueperella pyogenes by heparin agarose gel

2.2 rIBP的制備

采用Gluthathione-Sepharose 4B從37 ℃下0.1 mmol·mL-1IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3 h的重組菌株中純化得到rIBP(圖2)。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. rIBPM.Protein marker; 1. rIBP圖2 rIBP的純化結(jié)果Fig.2 Purification of rIBP

2.3 免疫印跡檢測(cè)IBP

采自自然感染化膿隱秘桿菌山羊血清或免疫rIBP后的小鼠血清，在免疫印跡中能識(shí)別rIBP(圖3A)，表明血清中含有抗rIBP抗體。自然感染山羊血清識(shí)別rIBP也表明在感染過(guò)程中化膿隱秘桿菌表達(dá)IBP。

免疫印跡顯示，肝素瓊脂糖凝膠提取的蛋白能被自然感染化膿隱秘桿菌的山羊血清識(shí)別出2條帶(圖3B)，能被 rIBP小鼠抗血清識(shí)別1條帶(圖3C)。 rIBP小鼠抗血清所識(shí)別的條帶和自然感染的山羊血清所識(shí)別的其中1條帶的大小一致，表明化膿隱秘桿菌在含8%小牛血清的TSB培養(yǎng)基中37 ℃振搖培養(yǎng)有IBP表達(dá)，且IBP能用肝素瓊脂糖凝膠從化膿隱秘桿菌培養(yǎng)物中提取。

A.抗血清與rIBP的反應(yīng)性；B. 自然感染化膿隱秘桿菌山羊血清識(shí)別的化膿隱秘桿菌蛋白；C. 小鼠抗rIBP血清識(shí)別的化膿隱秘桿菌蛋白；M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 自然感染化膿隱秘桿菌山羊血清；2.小鼠抗 rIBP血清；3. 肝素瓊脂糖凝膠提取的蛋白；4.菌體蛋白A.The reaction between antiserum and rIBP; B. Proteins of T. pyogenes recognized by serum of goat infected naturally with T. pyogene; C. Proteins of T. pyogenes recognized by mice anti-rIBP serum; M. Protein marker; 1. Serum of goat naturally infected with T. pyogenes; 2. Anti-rIBP serum from mice; 3.Proteins extracted by heparin agarose gel; 4.Bacterial proteins圖3 抗血清識(shí)別的化膿隱秘桿菌蛋白(免疫印跡)Fig.3 Proteins of T. pyogenes recognized by the antiserum (immunoblotting)

2.4 肝素結(jié)合與結(jié)合抑制分析

SDS-PAGE顯示，隨著洗液中NaCl濃度從0.025 mol·L-1逐漸提高，肝素瓊脂糖珠結(jié)合的rIBP的量逐漸下降，至NaCl達(dá)到0.5 mol·L-1時(shí)，基本不可見rIBP；同時(shí)，GST沒(méi)有結(jié)合肝素瓊脂糖珠(圖4A)。這表明rIBP結(jié)合肝素瓊脂糖珠與標(biāo)簽GST無(wú)關(guān)，且結(jié)合能被生理濃度的NaCl部分解離下來(lái)。

肝素與肝素瓊脂糖凝膠、rIBP共孵育后，免疫印跡中的特異條帶亮度隨肝素濃度升高而降低，表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系(圖4B)，表明游離肝素與瓊脂糖凝膠中固相肝素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合rIBP，對(duì)結(jié)合的抑制作用是特異的。

免疫印跡顯示，與PBS相比，rIBP、GST抗血清都能抑制rIBP結(jié)合肝素瓊脂糖凝膠，且與兩者孵育后肝素瓊脂糖凝膠結(jié)合的rIBP量無(wú)明顯差異(圖4C)，表明針對(duì)rIBP的抗體不能抑制rIBP結(jié)合肝素，抗血清對(duì)結(jié)合的抑制作用是由血清中的其他物質(zhì)造成的。

A. rIBP結(jié)合肝素瓊脂糖凝膠分析；B. 肝素抑制rIBP結(jié)合肝素瓊脂糖凝膠；C. 抗血清抑制 rIBP結(jié)合肝素瓊脂糖凝膠(rIBP. 小鼠抗 rIBP血清；GST. GST抗血清)；M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)A. Binding assay of rIBP to heparin agarose gel; B. Heparin inhibits rIBP binding to heparin agarose gel; C. Antiserum inhibits rIBP binding to heparin agarose gel (rIBP. Anti-rIBP serum from mice; GST. Anti-GST serum); M. Protein marker圖4 rIBP肝素結(jié)合與結(jié)合抑制分析Fig.4 Analysis of rIBP binding heparin and the binding inhibition

2.5 細(xì)胞黏附分析

免疫印跡顯示，rIBP與MDBK細(xì)胞孵育后，出現(xiàn)特異條帶，且條帶亮度隨rIBP劑量的增加而增量，表現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系；GST與MDBK細(xì)胞孵育后未出現(xiàn)明顯條帶(圖5)，表明rIBP黏附MDBK細(xì)胞與GST標(biāo)簽無(wú)關(guān)，能特異性黏附MDBK細(xì)胞。

2.6 rIBP抗血清抑制細(xì)菌黏附細(xì)胞分析

抗血清抑制細(xì)胞黏附試驗(yàn)結(jié)果顯示，與rIBP或GST抗血清(1∶10稀釋)預(yù)孵育的化膿隱秘桿菌和與PBS預(yù)孵育的化膿隱秘桿菌相比，黏附到MDBK細(xì)胞上的數(shù)量下降極顯著(P<0.05)；與rIBP抗血清預(yù)孵育的化膿隱秘桿菌和與GST抗血清預(yù)孵育的化膿隱秘桿菌黏附到MDBK細(xì)胞上的數(shù)量下降極顯著(P<0.05)(圖6)。這表明rIBP抗血清能抑制化膿隱秘桿菌黏附到MDBK細(xì)胞，進(jìn)一步證實(shí)rIBP能黏附MDBK細(xì)胞。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)M. Protein marker圖5 rIBP黏附MDBK細(xì)胞分析(免疫印跡)Fig.5 Adhesion assay of rIBP to MDBK cells (Western blotting)

圖中不同大寫字母(A、B、C)表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母(a、b、c)表示差異顯著(P<0.05)Different capital letters (A, B or C) mean P<0.01, different lower letters (a, b or c) mean P<0.05 in the column chart圖6 rIBP抗血清抑制化膿隱秘桿菌黏附細(xì)胞的作用分析Fig.6 Inhibitory effect of anti-rIBP serum on cell adhesion of T. pyogenes

3 討 論

肝素、硫酸乙酰肝素是結(jié)構(gòu)類似的GAGs[16]。硫酸乙酰肝素在多細(xì)胞生物進(jìn)化的早期出現(xiàn)，與核心蛋白共價(jià)結(jié)合，是所有多細(xì)胞生物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的基本成分[17]。據(jù)計(jì)算人肝細(xì)胞表面表達(dá)4×105個(gè)硫酸乙酰肝素分子[18]。在感染中，很多病原體利用自身的表面蛋白黏附宿主HSPGs，以使自身附著靶細(xì)胞并侵入組織[10-12]。這些研究結(jié)果指出很多病原在進(jìn)化中適應(yīng)了以HSPGs作為受體的一般策略。

病原體表面蛋白與HSPGs黏附的分子基礎(chǔ)是，這些表面蛋白結(jié)構(gòu)域柔性環(huán)中的富含Arg、Lys區(qū)域負(fù)責(zé)與HSPGs結(jié)合，蛋白質(zhì)上帶正電荷的氨基酸簇與HSPGs上帶負(fù)電荷的GAGs形成離子鍵，在黏附基序上要求帶正電荷的氨基酸簇與疏水性氨基酸相靠近，疏水性氨基酸側(cè)鏈和糖鏈非極性基團(tuán)間的相互作用穩(wěn)定了蛋白質(zhì)和聚糖的結(jié)合[19-20]。與HSPGs結(jié)合的病原體表面蛋白能通過(guò)肝素瓊脂糖凝膠層析從膜蛋白中提取[20]。之前用商品化細(xì)菌膜蛋白提取試劑盒提取的化膿隱秘桿菌膜蛋白是高鹽溶液[14]，高濃度鹽會(huì)降低蛋白質(zhì)與肝素瓊脂糖凝膠的結(jié)合力。本研究利用肝素瓊脂糖凝膠從化膿隱秘桿菌裂解物上清提取蛋白，從SDS-PAGE和免疫印跡分析結(jié)果來(lái)看，提取后蛋白質(zhì)條帶數(shù)量明顯減少，部分條帶得到明顯富集。經(jīng)蛋白質(zhì)質(zhì)譜和免疫印跡鑒定，提取到包含IBP在內(nèi)的10種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的SBPs，表明化膿隱秘桿菌的這些蛋白質(zhì)在含8%小牛血清的TSB培養(yǎng)基中37 ℃振搖培養(yǎng)有大量表達(dá)。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)，由ABC型膜透酶(permease)、ATP結(jié)合蛋白質(zhì)(或稱ATP酶，ATPase)和底物結(jié)合蛋白(substrate binding protein, SBP)組成，不同類型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)不同的底物。SBPs是一類脂蛋白(lipoproteins)[21]。細(xì)菌脂蛋白含有N-末端脂質(zhì)修飾，即N-酰基-S-二?；?甘油基-半胱氨酸(N-acyl-S-diacyl-glyceryl-cysteine)。脂蛋白在原核生物中含量豐富。Stoll等[22]利用脂蛋白搜索程序ParSeq[23]對(duì)金黃色葡萄球菌N315基因組進(jìn)行了分析，鑒定出70多個(gè)推測(cè)的脂蛋白，但只有55個(gè)含有正確長(zhǎng)度的信號(hào)肽，35個(gè)脂蛋白可被注釋為鐵、鋅、氨基酸、寡肽、甘氨酸甜菜堿、糖和磷壁酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

在革蘭陽(yáng)性細(xì)菌中，脂蛋白錨定在細(xì)胞質(zhì)膜的外表面上，并可延伸到細(xì)胞壁內(nèi)外，與外部成分(如營(yíng)養(yǎng)素和宿主蛋白質(zhì))結(jié)合[21]，是一類保守的細(xì)菌黏附蛋白家族[24-25]。在免疫印跡中，自然感染化膿隱秘桿菌的山羊血清能識(shí)別出rIBP，這表明IBP能在感染過(guò)程中表達(dá)，可能在感染過(guò)程中發(fā)揮黏附宿主細(xì)胞的作用。IBP(rIBP)能結(jié)合肝素和宿主細(xì)胞，表明IBP可能通過(guò)與宿主HSPGs結(jié)合而促進(jìn)化膿隱秘桿菌黏附宿主細(xì)胞。另外，與肝素瓊脂糖凝膠結(jié)合的rIBP能被生理濃度的NaCl部分解離下來(lái)，提示IBP與HSPGs結(jié)合可能涉及化膿隱秘桿菌在黏膜定植和感染部位上與宿主細(xì)胞的動(dòng)態(tài)相互作用，而與宿主細(xì)胞的動(dòng)態(tài)相互作用對(duì)病原菌的體內(nèi)存活和疾病的發(fā)展至關(guān)重要[24]。rIBP能結(jié)合肝素和宿主細(xì)胞，但rIBP抗血清不能明顯抑制其結(jié)合肝素而能抑制其黏附宿主細(xì)胞，表明IBP還有其他宿主受體。

4 結(jié) 論

采用肝素瓊脂糖凝膠從化膿隱秘桿菌裂解物中提取到IBP等多種蛋白，證實(shí)在自然感染中化膿隱秘桿菌表達(dá)IBP，IBP特異性結(jié)合肝素、黏附MDBK細(xì)胞，rIBP抗血清不能明顯抑制rIBP結(jié)合肝素，但能抑制化膿隱秘桿菌黏附MDBK細(xì)胞。