王維夫,錢亞光,2,盧 萍*,何 珊,3*,杜 玲,李玉玲,高 峰
(1.內(nèi)蒙古師范大學生命科學與技術(shù)學院,呼和浩特 010022;2. 喀喇沁旗農(nóng)業(yè)環(huán)境保護能源站,赤峰 024400;3. 包頭醫(yī)學院醫(yī)學技術(shù)與麻醉學院,包頭 014040)
小花棘豆(Oxytropisglabra)為豆科棘豆屬多年生草本植物,主要生長在草原、荒漠草原以及荒漠區(qū)的低濕地[1]。國際上將含苦馬豆素(swainsonine, SW)的黃芪屬和棘豆屬植物統(tǒng)稱為瘋草,小花棘豆是內(nèi)蒙古最重要的瘋草,其生長周期均有毒,以漸進形式引起牲畜慢性中毒,對草原畜牧業(yè)造成重大損失。SW陽離子構(gòu)型與甘露糖苷陽離子結(jié)構(gòu)十分相似,與甘露糖有高度親和性,在動物細胞中會競爭性抑制溶酶體酸性α-甘露糖苷酶Ⅰ和高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ的活性,導致甘露糖積累,使蛋白質(zhì)合成、加工以及轉(zhuǎn)運受到一系列影響,細胞內(nèi)部分低聚糖無法正常代謝而聚積,由此導致細胞變性空泡化,失去正常功能,嚴重時造成死亡。牲畜采食小花棘豆初期體重稍增加,繼續(xù)采食后出現(xiàn)身體消瘦,精神沉郁、易受驚嚇、四肢無力、反應遲鈍、內(nèi)臟空泡化以及生殖機能嚴重受損等癥狀,嚴重時導致死亡[2-4]。
SW是一種次級代謝產(chǎn)物,最早由Colegate從灰苦馬豆(Sphaerophysasalsula)中分離純化。SW的分子式為C8H15NO3,相對分子質(zhì)量為173,熔點為144~145 ℃,純品呈白色針狀晶體,屬于吲哚里西啶類生物堿,在吲哚里西啶環(huán)1,2,8位3個C原子上各連1個羥基,化學名為1,2,8-三羥基吲哚里西啶[5]。SW在醫(yī)藥領域內(nèi)可作為一種有潛力的抗腫瘤藥物,能抑制高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ,從而阻斷癌細胞的N-連接寡糖合成,抑制癌細胞轉(zhuǎn)移,增加癌細胞對天然免疫的敏感性[6]。
盧萍等[7-8]進行了內(nèi)蒙古3種棘豆屬植物(O.glabra、O.aciphylla和O.racemusa)中SW相關(guān)因子的研究,發(fā)現(xiàn)僅小花棘豆(采自鄂爾多斯、巴彥淖爾和阿拉善地區(qū)的6個種群167株)含SW,檢測了單株植物SW水平,在植物總DNA中擴增出真菌5.8S rDNA/ITS序列,部分植株分離出內(nèi)生真菌,擴增了5.8S rDNA/ITS序列,經(jīng)微生物學研究和序列比對分析,在屬水平上鑒定該真菌為Embellisia,后修訂為Alternaria,有該內(nèi)生真菌的小花棘豆都含SW。后盧萍課題組繼續(xù)在內(nèi)蒙古西部采集8個種群135株小花棘豆,進行相關(guān)研究,得到相同結(jié)論,發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的小花棘豆Alternaria內(nèi)生真菌產(chǎn)生了SW,提出小花棘豆SW毒性可能由Alternaria引起[9-11]。余永濤等[12-13]從甘肅棘豆、毛瓣棘豆、冰川棘豆中分離到Embellisia內(nèi)生真菌(修訂為Alternaria),該真菌檢測到SW,在莖直黃芪分離了Alternaria內(nèi)生真菌,真菌中也檢測到SW。Martinez等[14]采集了不同地區(qū)的黃芪種群,提取單株SW,擴增出AlternariasectionUndifilum內(nèi)生真菌并檢測到SW。
本研究在前期基礎上擴大采樣量,從內(nèi)蒙古鄂爾多斯鄂托克前旗和烏審旗8個不同地理種群采集120株小花棘豆,測定單株植物SW水平,從單株植物中分離培養(yǎng)內(nèi)生真菌,進一步深入研究小花棘豆SW毒性與內(nèi)生真菌的關(guān)系。
選擇內(nèi)蒙古鄂爾多斯市鄂托克前旗和烏審旗8個小花棘豆地理種群,進行單株植物隨機采樣,采樣地概況見表1。每個地理種群采集15株左右小花棘豆健康個體,株間距50 m以上。將新鮮葉片置變色硅膠中迅速干燥,帶回實驗室以備DNA提取,將整株植株帶回烘干后,用于SW的提取、測定及內(nèi)生真菌分析。
表1 小花棘豆采樣地
儀器設備:Varian 450GC氣相色譜儀(美國瓦里安公司)、Hettic MIKRO22R臺式低溫高速離心機(北奧企業(yè)集團有限公司)、WD-9405B水平搖床(北京六一儀器廠)、FZ102植物試樣粉碎機(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)、ZHJH-1109超凈工作臺(上海智誠分析儀器有限公司)、Tanon GIS-2010凝膠成像系統(tǒng)(上海天能儀器廠)、050-810Tgradient48 PCR 擴增儀(德國 Biometra-grandient 公司)、DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)。
試劑:甲基化-α-D-甘露糖苷(Sigma公司)、硅烷化試劑(三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷) (Sigma公司)、SW標準品(西北農(nóng)林科技大學)、Dowex 50 WX8 50-100(H)陽離子交換樹脂(阿法埃莎天津化學有限公司)、2×TaqMaster Mix(南京博爾迪生物科技有限公司)、1 kb Plus DNA ladder(天根生化科技北京有限公司),均為色譜純或分析純。
單株小花棘豆總DNA提?。篊TAB 法提取總DNA[15],0.7%瓊脂糖凝膠電泳,電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)檢測。內(nèi)生真菌5.8S rDNA/ITS序列擴增:用真菌特異性引物P1/P2對其5.8S rDNA/ITS區(qū)進行PCR擴增,P1為正向引物,序列為5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′;P2為反向引物,序列為5′- GTTCAGCGGGTATCCCTA-3′。
10 μL PCR反應體系:3.5 μL 2×PCR master mix,總DNA模板10 ng,100 μmol·L-1引物各0.25 μL,用超純水補足10 μL。擴增程序:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性45 s,48 ℃復性1 min,72 ℃延伸30 s,30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,Tanon GIS-2010型凝膠成像系統(tǒng)檢測。對擴增產(chǎn)物進行序列測定,所得結(jié)果序列進行同源比對。
用電動粉碎機將已烘干的120株單株小花棘豆植物分別粉碎,使其通過直徑0.5 mm篩。準確稱取0.2 g過篩單株植物粉末,利用乙酸-氯仿浸提,用Dowex 50 WX8 50-100(H)陽離子交換樹脂柱層析純化[7,9-11]。
SW的GC檢測:樣品中加50 μL吡啶溶液,加16 μL甲基化-α-D-甘露糖苷(100 μg·mL-1)作內(nèi)標物,再加入50 μL雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷(99∶1)混勻,置于干燥器中進行30 min衍生化反應后進樣。用吡啶配制SW標準溶液,用標準品和內(nèi)標物峰面積比值作橫坐標,SW標準溶液的濃度(μg·mL-1)作縱坐標,繪制標準曲線,依據(jù)標準曲線方程計算植株SW水平。氣相色譜條件:石英毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),柱溫210 ℃, 進樣口溫度300 ℃,氫火焰離子化檢測器,檢測器溫度為280 ℃,高純氮載氣。測樣進樣量1 μL, 流速1 mL·min-1,分流比50∶1。
內(nèi)生真菌的培養(yǎng):用60 ℃烘干的單株小花棘豆莖切段做外植體,在超凈工作臺內(nèi)將約1 cm外植體用70%乙醇浸泡30 s、20%次氯酸鈉溶液浸泡3 min, 用無菌雙蒸水清洗2次,后置滅菌濾紙上吸干,接種到1.5%水瓊脂培養(yǎng)基上,于25 ℃下培養(yǎng)。待外植體長出真菌菌絲體后,用接種環(huán)刮取菌絲體轉(zhuǎn)至PDA培養(yǎng)基上分離單菌落。觀察菌落和菌絲體形態(tài)。
小花棘豆內(nèi)生真菌SW水平檢測:在超凈工作臺內(nèi)刮取培養(yǎng)45 d的真菌單菌落菌絲體,置于干燥器中干燥后,用研缽充分研磨至粉末狀,從中提取SW,水平檢測方法同“1.4”。
SW水平兩種群間差異性比較采用獨立樣本t-檢驗;SW水平多種群間差異性比較采用單因素方差分析,事后多重比較采用Bonferroni校正法。以P<0.05作為檢驗水準。
部分小花棘豆單株植物總DNA提取電泳結(jié)果見圖1,DNA質(zhì)量較好,無降解。
110株小花棘豆均擴增出真菌5.8S rDNA/ITS序列,部分PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。經(jīng)PCR產(chǎn)物測序分析,序列全長為517 bp,其中ITS1區(qū)1—199 bp、5.8S rDNA區(qū)200—369 bp、3 ITS2區(qū)370—517 bp,與課題組前期發(fā)表的結(jié)果相同,屬于Alternaria。
M. 1 kb plus DNA相對分子質(zhì)量標準;1~17. 小花棘豆DNA提取結(jié)果M. 1 kb plus DNA ladder;1-17. Results of DNA extraction from Oxytropis glabra圖1 部分小花棘豆總DNA提取結(jié)果Fig.1 The extraction results of total DNA from Oxytropis glabra
M. 1 kb plus DNA相對分子質(zhì)量標準;1~7. 擴增結(jié)果M. 1 kb plus DNA ladder;1-7. Amplification results圖2 部分小花棘豆植物中內(nèi)生真菌5.8S rDNA/ITS序列擴增結(jié)果Fig.2 Amplification of 5.8S rDNA/ITS of endophytic fungi from Oxytropis glabra
SW標準曲線見圖3,其中R2=0.999 7,方程線性良好。
圖3 SW標準曲線Fig.3 Standard curve of SW
各樣品進樣后均出現(xiàn)與SW標準品相同保留時間的色譜峰,保留時間為4.4 min左右;內(nèi)標物色譜峰保留時間為4.2 min左右,結(jié)果見圖4、5。
圖4 SW標準品氣相色譜圖Fig.4 GC map of standard SW
圖5 植株樣品SW氣相色譜測定圖Fig.5 GC map of SW from plant samples
根據(jù)標準曲線方程計算出小花棘豆待測植株樣品的SW水平和PCR擴增結(jié)果見表2。120株小花棘豆中有111株測出SW,最高水平為369.05 μg·g-1,平均水平32.78 μg·g-1,未測出SW的9株擴增出了真菌條帶,經(jīng)測序分析不屬于Alternaria。
鄂托克前旗有2個種群OTQ1和OTQ2,OTQ1的15株均測出SW,最低水平為OTQ1.13(0.10 μg·g-1),最高水平為OTQ1.1(16.00 μg·g-1),均值為4.15 μg·g-1;OTQ2的15株有13株測出SW,最高水平為OTQ2.6(21.80 μg·g-1),均值為3.65 μg·g-1。獨立樣本t-檢驗顯示,鄂托克前旗OTQ1和OTQ2種群SW水平種群間差異無統(tǒng)計學意義(t=0.033,P=0.973)。
烏審旗有6個種群OW3至OW8。OW3的15株有8株測出SW,最高水平為OW3.14(92.40 μg·g-1),均值為9.53 μg·g-1;OW4的15株均測出SW,最低水平為OW4.7(2.46 μg·g-1),最高水平為OW4.2(139.12 μg·g-1),均值為54.31 μg·g-1;OW5的15株均測出SW,其最低水平為OW5.1(0.50 μg·g-1),最高水平為OW5.2(65.30 μg·g-1),均值為14.51 μg·g-1; OW6的15株均測出SW,最低水平為OW6.1(5.54 μg·g-1),最高水平為OW6.6(369.05 μg·g-1),均值為80.94 μg·g-1;OW7的15株均測出SW,其中OW7.14為痕量,最高水平為OW7.9(89.57 μg·g-1),均值為17.57 μg·g-1;OW8的15株均測出SW,最低水平為OW8.5(1.59 μg·g-1), 最高水平為OW8.10(243.56 μg·g-1),均值為77.57 μg·g-1。烏審旗6個種群檢測出SW的樣本進行單因素方差分析顯示,SW水平與種群存在一定相關(guān)性(F=4.286,P=0.002),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);Bonferroni校正的事后兩兩比較顯示,OW6與OW5、OW6與OW7、OW8與OW5各組間SW水平存在差異,前者分別高于后者,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示某些種群間SW水平可能存在一定差異性。
表2 小花棘豆單株SW水平及Alternaria真菌序列擴增結(jié)果
(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)
小花棘豆外植體于水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)1~2周,周圍長出松散白色絨毛狀真菌菌絲體(圖6),劃線培養(yǎng)得單株,真菌生長緩慢,呈現(xiàn)白色、圓形、隆起、邊緣整齊、輻射狀生長菌落,后來菌體分泌色素,菌落顏色逐漸加深,呈現(xiàn)灰色、深灰色或褐色至深褐色,有些菌落變?yōu)楹谏浔趁骖伾兓黠@(圖7)。
38株小花棘豆分離培養(yǎng)出Alternaria內(nèi)生真菌,分離純化其菌絲體中的SW,經(jīng)GC檢測結(jié)果顯示,各樣品均出現(xiàn)與SW標準品相同保留時間色譜峰(圖8),保留時間為4.4 min左右,內(nèi)標色譜峰保留時間為4.2 min左右。
不同內(nèi)生真菌樣品SW水平在0.83~2 573.24 μg·g-1變化,見表3。其中A-OTQ1.2~ A-OTQ2.13 的14個樣品的SW水平均值為33.93 μg·g-1,最低水平為A-OTQ1.9(0.83 μg·g-1),最高水平為A-OTQ1.10(287.09 μg·g-1);A-OW3.2~A-OW8.14的24個樣品的SW水平均值為492.28 μg·g-1,最低水平為A-OW3.13(2.05 μg·g-1),最高水平為A-OW7.8(2 573.24 μg·g-1)。
本研究在中國內(nèi)蒙古西部8個不同種群采集120株小花棘豆,單株SW水平為0.10~369.05 μg·g-1,均值為32.78 μg·g-1,分離培養(yǎng)出38株Alternaria內(nèi)生真菌,均檢測到SW,SW水平的均值為323.3 μg·g-1,范圍在0.83~2 573.24 μg·g-1,在種群內(nèi)和種群間有變化,與前期在其他種群中所得結(jié)論一致[7-11],與Gardener等[16]、Braun等[17]A.mollisimus、O.lambertii和O.sericae的研究結(jié)果相似;內(nèi)生真菌菌落呈白色、圓形、邊緣整齊、隆起,輻射狀生長,后菌體分泌黑褐色色素,菌落顏色變化由白色至淺灰色直至黑褐色,與盧萍等[7-11]、Simmons[18]、陳偉群[19]、Pryor等[20]、Braun等[17]對瘋草內(nèi)生真菌Embellisia(后修訂為Alternaria)的研究結(jié)果相同,測序所得內(nèi)生真菌5.8S rDNA/ITS序列與Braun等[17]提交的相比有1個變異位點,位于5.8S rDNA區(qū)第227位(T→A),一致度為99.8%,二者高度同源。
圖6 水瓊脂培養(yǎng)基上小花棘豆內(nèi)生真菌Fig.6 Endophytic fungi of Oxytropis glabra on the agar media
圖7 PDA培養(yǎng)基上的小花棘豆內(nèi)生真菌菌落Fig.7 Colonies of endophytic fungi from Oxytropis glabra on PDA media
圖8 Alternaria真菌SW標準品氣相色譜圖Fig.8 GC map of SW from Alternaria
Ralphs等[21]從黃芪屬(Astragalus)和棘豆屬(Oxytropis)中分離到內(nèi)生真菌Embellisia(后修訂為Alternaria),檢測植株和內(nèi)生真菌SW水平,發(fā)現(xiàn)含SW植株與內(nèi)生真菌有相關(guān)性,認為內(nèi)生真菌定殖宿主植株以及環(huán)境會影響宿主植株合成SW。在植物Astragalusoxyphysus和真菌Rhizotonialeguminicola的SW生物合成途徑中,哌啶酸是一種前體物[22-23],深入研究內(nèi)生真菌如何在瘋草中合成SW及環(huán)境的影響很有必要。瘋草內(nèi)生真菌SW合成途徑處于賴氨酸代謝途徑的一個分支,尚有許多未解之謎,其合成途徑:α-氨基已二酸→α-氨基已二酸半醛→P6C→哌啶酸→SW或賴氨酸→酵母氨酸→P6C→哌啶酸→SW,酵母氨酸還原酶(Sac)是合成SW的關(guān)鍵酶之一[24-25](P6C途徑),近年推測瘋草內(nèi)生真菌Undifilumoxytropis中SW生物合成可能還有P2C途徑,其生物合成機制及代謝途徑尚不清楚,故對其進行深入研究有重要理論意義,同時在控制宿主小花棘豆SW含量、保護草原生態(tài)環(huán)境等方面具有潛在的應用價值[26]。課題組前期也克隆了A.oxytropisOW7.8的sac,構(gòu)建了sac敲除株M1,發(fā)現(xiàn)其SW水平低于野生株OW7.8,而賴氨酸的水平變化很小,OW7.8中sac表達量越高、SW水平也越高[27-30];構(gòu)建了sac互補株 C1,其SW水平高于M1和W7.8,推測表達載體上的強啟動子驅(qū)動sac高表達,促進了SW的合成[31];探索了光照和培養(yǎng)基對A.oxytropis生長和苦馬豆素含量的影響[32],綜述了真菌中苦馬豆素生物合成途徑的研究進展[33],進行了OW7.8和 M1的轉(zhuǎn)錄組測序分析,注釋到45 634個差異表達基因,從中初步鑒定出41個可能與SW生物合成相關(guān),推測SW合成涉及P6C和P2C兩條途徑[34]。
表3 體外培養(yǎng)的小花棘豆Alternaria內(nèi)生真菌SW水平
本研究通過比較分析不同小花棘豆種群SW及其內(nèi)生真菌關(guān)系,可為深入研究內(nèi)生真菌SW生物合成途徑與調(diào)控機制提供基礎數(shù)據(jù),另外,也可篩選高水平SW菌株應用于醫(yī)藥和化工領域。將來課題組將繼續(xù)深入研究小花棘豆基因組中關(guān)鍵基因?qū)ζ浜铣蒘W及其前體物質(zhì)積累的作用,探究植物與內(nèi)生真菌如何互作合成SW,以及A.oxytropis的SW合成相關(guān)基因的克隆與功能研究。
內(nèi)蒙古8個種群120小花棘豆株中111株測出含SW。從38株小花棘豆分離培養(yǎng)出了內(nèi)生真菌,經(jīng)微生物學研究及5.8S rDNA/ITS序列比對分析,在屬水平上鑒定為Alternaria,該內(nèi)生真菌均合成了SW,含Alternaria內(nèi)生真菌的小花棘豆植株都檢測出了苦馬豆素。