• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    內(nèi)蒙古不同小花棘豆種群苦馬豆素及其內(nèi)生真菌關(guān)系的分析

    2022-03-08 03:08:28王維夫錢亞光李玉玲
    畜牧獸醫(yī)學報 2022年1期
    關(guān)鍵詞:棘豆內(nèi)生小花

    王維夫,錢亞光,2,盧 萍*,何 珊,3*,杜 玲,李玉玲,高 峰

    (1.內(nèi)蒙古師范大學生命科學與技術(shù)學院,呼和浩特 010022;2. 喀喇沁旗農(nóng)業(yè)環(huán)境保護能源站,赤峰 024400;3. 包頭醫(yī)學院醫(yī)學技術(shù)與麻醉學院,包頭 014040)

    小花棘豆(Oxytropisglabra)為豆科棘豆屬多年生草本植物,主要生長在草原、荒漠草原以及荒漠區(qū)的低濕地[1]。國際上將含苦馬豆素(swainsonine, SW)的黃芪屬和棘豆屬植物統(tǒng)稱為瘋草,小花棘豆是內(nèi)蒙古最重要的瘋草,其生長周期均有毒,以漸進形式引起牲畜慢性中毒,對草原畜牧業(yè)造成重大損失。SW陽離子構(gòu)型與甘露糖苷陽離子結(jié)構(gòu)十分相似,與甘露糖有高度親和性,在動物細胞中會競爭性抑制溶酶體酸性α-甘露糖苷酶Ⅰ和高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ的活性,導致甘露糖積累,使蛋白質(zhì)合成、加工以及轉(zhuǎn)運受到一系列影響,細胞內(nèi)部分低聚糖無法正常代謝而聚積,由此導致細胞變性空泡化,失去正常功能,嚴重時造成死亡。牲畜采食小花棘豆初期體重稍增加,繼續(xù)采食后出現(xiàn)身體消瘦,精神沉郁、易受驚嚇、四肢無力、反應遲鈍、內(nèi)臟空泡化以及生殖機能嚴重受損等癥狀,嚴重時導致死亡[2-4]。

    SW是一種次級代謝產(chǎn)物,最早由Colegate從灰苦馬豆(Sphaerophysasalsula)中分離純化。SW的分子式為C8H15NO3,相對分子質(zhì)量為173,熔點為144~145 ℃,純品呈白色針狀晶體,屬于吲哚里西啶類生物堿,在吲哚里西啶環(huán)1,2,8位3個C原子上各連1個羥基,化學名為1,2,8-三羥基吲哚里西啶[5]。SW在醫(yī)藥領域內(nèi)可作為一種有潛力的抗腫瘤藥物,能抑制高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ,從而阻斷癌細胞的N-連接寡糖合成,抑制癌細胞轉(zhuǎn)移,增加癌細胞對天然免疫的敏感性[6]。

    盧萍等[7-8]進行了內(nèi)蒙古3種棘豆屬植物(O.glabra、O.aciphylla和O.racemusa)中SW相關(guān)因子的研究,發(fā)現(xiàn)僅小花棘豆(采自鄂爾多斯、巴彥淖爾和阿拉善地區(qū)的6個種群167株)含SW,檢測了單株植物SW水平,在植物總DNA中擴增出真菌5.8S rDNA/ITS序列,部分植株分離出內(nèi)生真菌,擴增了5.8S rDNA/ITS序列,經(jīng)微生物學研究和序列比對分析,在屬水平上鑒定該真菌為Embellisia,后修訂為Alternaria,有該內(nèi)生真菌的小花棘豆都含SW。后盧萍課題組繼續(xù)在內(nèi)蒙古西部采集8個種群135株小花棘豆,進行相關(guān)研究,得到相同結(jié)論,發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的小花棘豆Alternaria內(nèi)生真菌產(chǎn)生了SW,提出小花棘豆SW毒性可能由Alternaria引起[9-11]。余永濤等[12-13]從甘肅棘豆、毛瓣棘豆、冰川棘豆中分離到Embellisia內(nèi)生真菌(修訂為Alternaria),該真菌檢測到SW,在莖直黃芪分離了Alternaria內(nèi)生真菌,真菌中也檢測到SW。Martinez等[14]采集了不同地區(qū)的黃芪種群,提取單株SW,擴增出AlternariasectionUndifilum內(nèi)生真菌并檢測到SW。

    本研究在前期基礎上擴大采樣量,從內(nèi)蒙古鄂爾多斯鄂托克前旗和烏審旗8個不同地理種群采集120株小花棘豆,測定單株植物SW水平,從單株植物中分離培養(yǎng)內(nèi)生真菌,進一步深入研究小花棘豆SW毒性與內(nèi)生真菌的關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    選擇內(nèi)蒙古鄂爾多斯市鄂托克前旗和烏審旗8個小花棘豆地理種群,進行單株植物隨機采樣,采樣地概況見表1。每個地理種群采集15株左右小花棘豆健康個體,株間距50 m以上。將新鮮葉片置變色硅膠中迅速干燥,帶回實驗室以備DNA提取,將整株植株帶回烘干后,用于SW的提取、測定及內(nèi)生真菌分析。

    表1 小花棘豆采樣地

    1.2 儀器與試劑

    儀器設備:Varian 450GC氣相色譜儀(美國瓦里安公司)、Hettic MIKRO22R臺式低溫高速離心機(北奧企業(yè)集團有限公司)、WD-9405B水平搖床(北京六一儀器廠)、FZ102植物試樣粉碎機(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)、ZHJH-1109超凈工作臺(上海智誠分析儀器有限公司)、Tanon GIS-2010凝膠成像系統(tǒng)(上海天能儀器廠)、050-810Tgradient48 PCR 擴增儀(德國 Biometra-grandient 公司)、DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)。

    試劑:甲基化-α-D-甘露糖苷(Sigma公司)、硅烷化試劑(三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷) (Sigma公司)、SW標準品(西北農(nóng)林科技大學)、Dowex 50 WX8 50-100(H)陽離子交換樹脂(阿法埃莎天津化學有限公司)、2×TaqMaster Mix(南京博爾迪生物科技有限公司)、1 kb Plus DNA ladder(天根生化科技北京有限公司),均為色譜純或分析純。

    1.3 單株小花棘豆總DNA提取及其內(nèi)生真菌5.8S rDNA/ITS序列擴增

    單株小花棘豆總DNA提?。篊TAB 法提取總DNA[15],0.7%瓊脂糖凝膠電泳,電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)檢測。內(nèi)生真菌5.8S rDNA/ITS序列擴增:用真菌特異性引物P1/P2對其5.8S rDNA/ITS區(qū)進行PCR擴增,P1為正向引物,序列為5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′;P2為反向引物,序列為5′- GTTCAGCGGGTATCCCTA-3′。

    10 μL PCR反應體系:3.5 μL 2×PCR master mix,總DNA模板10 ng,100 μmol·L-1引物各0.25 μL,用超純水補足10 μL。擴增程序:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性45 s,48 ℃復性1 min,72 ℃延伸30 s,30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,Tanon GIS-2010型凝膠成像系統(tǒng)檢測。對擴增產(chǎn)物進行序列測定,所得結(jié)果序列進行同源比對。

    1.4 單株小花棘豆SW水平檢測SW提取

    用電動粉碎機將已烘干的120株單株小花棘豆植物分別粉碎,使其通過直徑0.5 mm篩。準確稱取0.2 g過篩單株植物粉末,利用乙酸-氯仿浸提,用Dowex 50 WX8 50-100(H)陽離子交換樹脂柱層析純化[7,9-11]。

    SW的GC檢測:樣品中加50 μL吡啶溶液,加16 μL甲基化-α-D-甘露糖苷(100 μg·mL-1)作內(nèi)標物,再加入50 μL雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷(99∶1)混勻,置于干燥器中進行30 min衍生化反應后進樣。用吡啶配制SW標準溶液,用標準品和內(nèi)標物峰面積比值作橫坐標,SW標準溶液的濃度(μg·mL-1)作縱坐標,繪制標準曲線,依據(jù)標準曲線方程計算植株SW水平。氣相色譜條件:石英毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),柱溫210 ℃, 進樣口溫度300 ℃,氫火焰離子化檢測器,檢測器溫度為280 ℃,高純氮載氣。測樣進樣量1 μL, 流速1 mL·min-1,分流比50∶1。

    1.5 小花棘豆內(nèi)生真菌的培養(yǎng)及其SW水平檢測

    內(nèi)生真菌的培養(yǎng):用60 ℃烘干的單株小花棘豆莖切段做外植體,在超凈工作臺內(nèi)將約1 cm外植體用70%乙醇浸泡30 s、20%次氯酸鈉溶液浸泡3 min, 用無菌雙蒸水清洗2次,后置滅菌濾紙上吸干,接種到1.5%水瓊脂培養(yǎng)基上,于25 ℃下培養(yǎng)。待外植體長出真菌菌絲體后,用接種環(huán)刮取菌絲體轉(zhuǎn)至PDA培養(yǎng)基上分離單菌落。觀察菌落和菌絲體形態(tài)。

    小花棘豆內(nèi)生真菌SW水平檢測:在超凈工作臺內(nèi)刮取培養(yǎng)45 d的真菌單菌落菌絲體,置于干燥器中干燥后,用研缽充分研磨至粉末狀,從中提取SW,水平檢測方法同“1.4”。

    1.6 統(tǒng)計分析

    SW水平兩種群間差異性比較采用獨立樣本t-檢驗;SW水平多種群間差異性比較采用單因素方差分析,事后多重比較采用Bonferroni校正法。以P<0.05作為檢驗水準。

    2 結(jié) 果

    2.1 單株小花棘豆總DNA提取

    部分小花棘豆單株植物總DNA提取電泳結(jié)果見圖1,DNA質(zhì)量較好,無降解。

    2.2 內(nèi)生真菌5.8S rDNA/ITS序列擴增

    110株小花棘豆均擴增出真菌5.8S rDNA/ITS序列,部分PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。經(jīng)PCR產(chǎn)物測序分析,序列全長為517 bp,其中ITS1區(qū)1—199 bp、5.8S rDNA區(qū)200—369 bp、3 ITS2區(qū)370—517 bp,與課題組前期發(fā)表的結(jié)果相同,屬于Alternaria。

    M. 1 kb plus DNA相對分子質(zhì)量標準;1~17. 小花棘豆DNA提取結(jié)果M. 1 kb plus DNA ladder;1-17. Results of DNA extraction from Oxytropis glabra圖1 部分小花棘豆總DNA提取結(jié)果Fig.1 The extraction results of total DNA from Oxytropis glabra

    M. 1 kb plus DNA相對分子質(zhì)量標準;1~7. 擴增結(jié)果M. 1 kb plus DNA ladder;1-7. Amplification results圖2 部分小花棘豆植物中內(nèi)生真菌5.8S rDNA/ITS序列擴增結(jié)果Fig.2 Amplification of 5.8S rDNA/ITS of endophytic fungi from Oxytropis glabra

    2.3 單株小花棘豆SW水平檢測

    SW標準曲線見圖3,其中R2=0.999 7,方程線性良好。

    圖3 SW標準曲線Fig.3 Standard curve of SW

    2.4 單株小花棘豆SW水平

    各樣品進樣后均出現(xiàn)與SW標準品相同保留時間的色譜峰,保留時間為4.4 min左右;內(nèi)標物色譜峰保留時間為4.2 min左右,結(jié)果見圖4、5。

    圖4 SW標準品氣相色譜圖Fig.4 GC map of standard SW

    圖5 植株樣品SW氣相色譜測定圖Fig.5 GC map of SW from plant samples

    根據(jù)標準曲線方程計算出小花棘豆待測植株樣品的SW水平和PCR擴增結(jié)果見表2。120株小花棘豆中有111株測出SW,最高水平為369.05 μg·g-1,平均水平32.78 μg·g-1,未測出SW的9株擴增出了真菌條帶,經(jīng)測序分析不屬于Alternaria。

    鄂托克前旗有2個種群OTQ1和OTQ2,OTQ1的15株均測出SW,最低水平為OTQ1.13(0.10 μg·g-1),最高水平為OTQ1.1(16.00 μg·g-1),均值為4.15 μg·g-1;OTQ2的15株有13株測出SW,最高水平為OTQ2.6(21.80 μg·g-1),均值為3.65 μg·g-1。獨立樣本t-檢驗顯示,鄂托克前旗OTQ1和OTQ2種群SW水平種群間差異無統(tǒng)計學意義(t=0.033,P=0.973)。

    烏審旗有6個種群OW3至OW8。OW3的15株有8株測出SW,最高水平為OW3.14(92.40 μg·g-1),均值為9.53 μg·g-1;OW4的15株均測出SW,最低水平為OW4.7(2.46 μg·g-1),最高水平為OW4.2(139.12 μg·g-1),均值為54.31 μg·g-1;OW5的15株均測出SW,其最低水平為OW5.1(0.50 μg·g-1),最高水平為OW5.2(65.30 μg·g-1),均值為14.51 μg·g-1; OW6的15株均測出SW,最低水平為OW6.1(5.54 μg·g-1),最高水平為OW6.6(369.05 μg·g-1),均值為80.94 μg·g-1;OW7的15株均測出SW,其中OW7.14為痕量,最高水平為OW7.9(89.57 μg·g-1),均值為17.57 μg·g-1;OW8的15株均測出SW,最低水平為OW8.5(1.59 μg·g-1), 最高水平為OW8.10(243.56 μg·g-1),均值為77.57 μg·g-1。烏審旗6個種群檢測出SW的樣本進行單因素方差分析顯示,SW水平與種群存在一定相關(guān)性(F=4.286,P=0.002),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);Bonferroni校正的事后兩兩比較顯示,OW6與OW5、OW6與OW7、OW8與OW5各組間SW水平存在差異,前者分別高于后者,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示某些種群間SW水平可能存在一定差異性。

    表2 小花棘豆單株SW水平及Alternaria真菌序列擴增結(jié)果

    (轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

    2.5 小花棘豆內(nèi)生真菌

    小花棘豆外植體于水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)1~2周,周圍長出松散白色絨毛狀真菌菌絲體(圖6),劃線培養(yǎng)得單株,真菌生長緩慢,呈現(xiàn)白色、圓形、隆起、邊緣整齊、輻射狀生長菌落,后來菌體分泌色素,菌落顏色逐漸加深,呈現(xiàn)灰色、深灰色或褐色至深褐色,有些菌落變?yōu)楹谏浔趁骖伾兓黠@(圖7)。

    2.6 小花棘豆Alternaria內(nèi)生真菌SW水平

    38株小花棘豆分離培養(yǎng)出Alternaria內(nèi)生真菌,分離純化其菌絲體中的SW,經(jīng)GC檢測結(jié)果顯示,各樣品均出現(xiàn)與SW標準品相同保留時間色譜峰(圖8),保留時間為4.4 min左右,內(nèi)標色譜峰保留時間為4.2 min左右。

    不同內(nèi)生真菌樣品SW水平在0.83~2 573.24 μg·g-1變化,見表3。其中A-OTQ1.2~ A-OTQ2.13 的14個樣品的SW水平均值為33.93 μg·g-1,最低水平為A-OTQ1.9(0.83 μg·g-1),最高水平為A-OTQ1.10(287.09 μg·g-1);A-OW3.2~A-OW8.14的24個樣品的SW水平均值為492.28 μg·g-1,最低水平為A-OW3.13(2.05 μg·g-1),最高水平為A-OW7.8(2 573.24 μg·g-1)。

    3 討 論

    本研究在中國內(nèi)蒙古西部8個不同種群采集120株小花棘豆,單株SW水平為0.10~369.05 μg·g-1,均值為32.78 μg·g-1,分離培養(yǎng)出38株Alternaria內(nèi)生真菌,均檢測到SW,SW水平的均值為323.3 μg·g-1,范圍在0.83~2 573.24 μg·g-1,在種群內(nèi)和種群間有變化,與前期在其他種群中所得結(jié)論一致[7-11],與Gardener等[16]、Braun等[17]A.mollisimus、O.lambertii和O.sericae的研究結(jié)果相似;內(nèi)生真菌菌落呈白色、圓形、邊緣整齊、隆起,輻射狀生長,后菌體分泌黑褐色色素,菌落顏色變化由白色至淺灰色直至黑褐色,與盧萍等[7-11]、Simmons[18]、陳偉群[19]、Pryor等[20]、Braun等[17]對瘋草內(nèi)生真菌Embellisia(后修訂為Alternaria)的研究結(jié)果相同,測序所得內(nèi)生真菌5.8S rDNA/ITS序列與Braun等[17]提交的相比有1個變異位點,位于5.8S rDNA區(qū)第227位(T→A),一致度為99.8%,二者高度同源。

    圖6 水瓊脂培養(yǎng)基上小花棘豆內(nèi)生真菌Fig.6 Endophytic fungi of Oxytropis glabra on the agar media

    圖7 PDA培養(yǎng)基上的小花棘豆內(nèi)生真菌菌落Fig.7 Colonies of endophytic fungi from Oxytropis glabra on PDA media

    圖8 Alternaria真菌SW標準品氣相色譜圖Fig.8 GC map of SW from Alternaria

    Ralphs等[21]從黃芪屬(Astragalus)和棘豆屬(Oxytropis)中分離到內(nèi)生真菌Embellisia(后修訂為Alternaria),檢測植株和內(nèi)生真菌SW水平,發(fā)現(xiàn)含SW植株與內(nèi)生真菌有相關(guān)性,認為內(nèi)生真菌定殖宿主植株以及環(huán)境會影響宿主植株合成SW。在植物Astragalusoxyphysus和真菌Rhizotonialeguminicola的SW生物合成途徑中,哌啶酸是一種前體物[22-23],深入研究內(nèi)生真菌如何在瘋草中合成SW及環(huán)境的影響很有必要。瘋草內(nèi)生真菌SW合成途徑處于賴氨酸代謝途徑的一個分支,尚有許多未解之謎,其合成途徑:α-氨基已二酸→α-氨基已二酸半醛→P6C→哌啶酸→SW或賴氨酸→酵母氨酸→P6C→哌啶酸→SW,酵母氨酸還原酶(Sac)是合成SW的關(guān)鍵酶之一[24-25](P6C途徑),近年推測瘋草內(nèi)生真菌Undifilumoxytropis中SW生物合成可能還有P2C途徑,其生物合成機制及代謝途徑尚不清楚,故對其進行深入研究有重要理論意義,同時在控制宿主小花棘豆SW含量、保護草原生態(tài)環(huán)境等方面具有潛在的應用價值[26]。課題組前期也克隆了A.oxytropisOW7.8的sac,構(gòu)建了sac敲除株M1,發(fā)現(xiàn)其SW水平低于野生株OW7.8,而賴氨酸的水平變化很小,OW7.8中sac表達量越高、SW水平也越高[27-30];構(gòu)建了sac互補株 C1,其SW水平高于M1和W7.8,推測表達載體上的強啟動子驅(qū)動sac高表達,促進了SW的合成[31];探索了光照和培養(yǎng)基對A.oxytropis生長和苦馬豆素含量的影響[32],綜述了真菌中苦馬豆素生物合成途徑的研究進展[33],進行了OW7.8和 M1的轉(zhuǎn)錄組測序分析,注釋到45 634個差異表達基因,從中初步鑒定出41個可能與SW生物合成相關(guān),推測SW合成涉及P6C和P2C兩條途徑[34]。

    表3 體外培養(yǎng)的小花棘豆Alternaria內(nèi)生真菌SW水平

    本研究通過比較分析不同小花棘豆種群SW及其內(nèi)生真菌關(guān)系,可為深入研究內(nèi)生真菌SW生物合成途徑與調(diào)控機制提供基礎數(shù)據(jù),另外,也可篩選高水平SW菌株應用于醫(yī)藥和化工領域。將來課題組將繼續(xù)深入研究小花棘豆基因組中關(guān)鍵基因?qū)ζ浜铣蒘W及其前體物質(zhì)積累的作用,探究植物與內(nèi)生真菌如何互作合成SW,以及A.oxytropis的SW合成相關(guān)基因的克隆與功能研究。

    4 結(jié) 論

    內(nèi)蒙古8個種群120小花棘豆株中111株測出含SW。從38株小花棘豆分離培養(yǎng)出了內(nèi)生真菌,經(jīng)微生物學研究及5.8S rDNA/ITS序列比對分析,在屬水平上鑒定為Alternaria,該內(nèi)生真菌均合成了SW,含Alternaria內(nèi)生真菌的小花棘豆植株都檢測出了苦馬豆素。

    猜你喜歡
    棘豆內(nèi)生小花
    每一朵小花都應該盡情綻放
    小花
    黃河之聲(2021年2期)2021-03-29 01:20:10
    無名的小花
    學生天地(2020年11期)2020-08-25 09:15:30
    植物內(nèi)生菌在植物病害中的生物防治
    內(nèi)生微生物和其在作物管理中的潛在應用
    “黨建+”激活鄉(xiāng)村發(fā)展內(nèi)生動力
    送你一把小花傘
    兒童繪本(2019年12期)2019-07-08 21:18:44
    授人以漁 激活脫貧內(nèi)生動力
    甘肅棘豆的研究進展
    中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:31
    藏藥鐮形棘豆總黃酮苷元抑菌活性的研究
    99精国产麻豆久久婷婷| 久久久a久久爽久久v久久| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产精品熟女久久久久浪| 一本久久精品| 精品第一国产精品| 伦理电影免费视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 草草在线视频免费看| 国产精品偷伦视频观看了| 成人毛片60女人毛片免费| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产午夜精品一二区理论片| 国产在线一区二区三区精| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 美女视频免费永久观看网站| 久久99热6这里只有精品| 水蜜桃什么品种好| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲欧美清纯卡通| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲成人手机| 久久韩国三级中文字幕| 国产成人免费无遮挡视频| 久久99热这里只频精品6学生| 免费大片18禁| 大片电影免费在线观看免费| 黑人高潮一二区| 亚洲成国产人片在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日本与韩国留学比较| 天堂中文最新版在线下载| 欧美人与善性xxx| 亚洲少妇的诱惑av| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 日本欧美国产在线视频| 国产在视频线精品| 咕卡用的链子| av一本久久久久| 午夜日本视频在线| 三级国产精品片| 国产精品一区二区在线不卡| 精品一区在线观看国产| 少妇的丰满在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 永久免费av网站大全| 午夜福利网站1000一区二区三区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久久久久久久久久免费av| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久狼人影院| av在线app专区| 内地一区二区视频在线| 激情视频va一区二区三区| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产在视频线精品| 我要看黄色一级片免费的| 黄色怎么调成土黄色| av一本久久久久| 国产亚洲最大av| 中国国产av一级| www.熟女人妻精品国产 | av卡一久久| 在线观看三级黄色| 亚洲伊人色综图| 亚洲欧美一区二区三区国产| 丝袜在线中文字幕| 毛片一级片免费看久久久久| 久久99精品国语久久久| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日本免费在线观看一区| 亚洲第一区二区三区不卡| 母亲3免费完整高清在线观看 | 国产色爽女视频免费观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 婷婷色综合大香蕉| 国产国语露脸激情在线看| 精品久久久久久电影网| 色婷婷av一区二区三区视频| 中国三级夫妇交换| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 国产精品免费大片| 日韩av免费高清视频| 黑人猛操日本美女一级片| 久久人人爽人人爽人人片va| 欧美少妇被猛烈插入视频| 一级a做视频免费观看| 欧美国产精品一级二级三级| 色哟哟·www| 欧美少妇被猛烈插入视频| 中国国产av一级| 久久午夜福利片| 久久影院123| 久久热在线av| 精品一区在线观看国产| 两个人看的免费小视频| 人人澡人人妻人| 毛片一级片免费看久久久久| 春色校园在线视频观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 欧美精品亚洲一区二区| 麻豆乱淫一区二区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 高清毛片免费看| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 中文字幕免费在线视频6| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲伊人色综图| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 日韩视频在线欧美| 免费人成在线观看视频色| 免费少妇av软件| 国产精品人妻久久久久久| 欧美激情国产日韩精品一区| 成人亚洲欧美一区二区av| 美女大奶头黄色视频| 国产成人精品无人区| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产精品一国产av| 亚洲国产精品专区欧美| 亚洲av男天堂| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲欧洲日产国产| 丰满迷人的少妇在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 一本久久精品| a 毛片基地| 久久99热6这里只有精品| 如何舔出高潮| av黄色大香蕉| 午夜免费观看性视频| 国产成人一区二区在线| 女性被躁到高潮视频| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲伊人色综图| 国产在线一区二区三区精| 国产成人午夜福利电影在线观看| kizo精华| 久久精品国产亚洲av涩爱| 大话2 男鬼变身卡| 男女啪啪激烈高潮av片| 夫妻性生交免费视频一级片| 女人久久www免费人成看片| 男的添女的下面高潮视频| 超色免费av| 婷婷色综合大香蕉| 777米奇影视久久| 丰满迷人的少妇在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产 精品1| 90打野战视频偷拍视频| 成人免费观看视频高清| 亚洲av欧美aⅴ国产| 波多野结衣一区麻豆| 99热国产这里只有精品6| 精品一区二区免费观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 中国国产av一级| 精品国产国语对白av| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲精品中文字幕在线视频| 丝瓜视频免费看黄片| 国产日韩欧美在线精品| 尾随美女入室| 波野结衣二区三区在线| 一级,二级,三级黄色视频| 99热国产这里只有精品6| 亚洲综合色惰| 桃花免费在线播放| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美另类一区| 91久久精品国产一区二区三区| 综合色丁香网| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲国产最新在线播放| 最近手机中文字幕大全| 在线观看免费高清a一片| 免费观看性生交大片5| 五月天丁香电影| a 毛片基地| av黄色大香蕉| 亚洲久久久国产精品| 永久网站在线| 日本av免费视频播放| 精品久久蜜臀av无| 成人影院久久| 日日爽夜夜爽网站| 国产精品久久久久成人av| 国产精品久久久久久久久免| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 一级毛片我不卡| 最近手机中文字幕大全| a 毛片基地| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲三级黄色毛片| 久久久久国产网址| 男女免费视频国产| 亚洲国产av新网站| 夫妻午夜视频| av卡一久久| 亚洲欧美一区二区三区国产| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲,欧美精品.| 精品国产露脸久久av麻豆| 精品国产乱码久久久久久小说| 大片电影免费在线观看免费| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲精品视频女| 一区二区三区精品91| av片东京热男人的天堂| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲精品国产av成人精品| 久久精品久久久久久久性| 久久狼人影院| 99精国产麻豆久久婷婷| 午夜av观看不卡| 国产激情久久老熟女| 丰满少妇做爰视频| 久久久久久久国产电影| 久久久久久久久久成人| 男女啪啪激烈高潮av片| 大片电影免费在线观看免费| 9191精品国产免费久久| 香蕉精品网在线| 国产毛片在线视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 高清不卡的av网站| 国产片特级美女逼逼视频| 丝瓜视频免费看黄片| 免费观看在线日韩| 免费看光身美女| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 视频在线观看一区二区三区| 国产激情久久老熟女| 精品少妇内射三级| 一级黄片播放器| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲中文av在线| 最新的欧美精品一区二区| 午夜激情久久久久久久| 一区二区三区乱码不卡18| 中文字幕亚洲精品专区| 免费在线观看完整版高清| 一级,二级,三级黄色视频| 精品午夜福利在线看| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲精品一二三| 成年美女黄网站色视频大全免费| 亚洲美女黄色视频免费看| 男女边吃奶边做爰视频| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲国产看品久久| 日本黄大片高清| 亚洲国产精品专区欧美| 久久午夜福利片| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲中文av在线| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产片内射在线| 久久久久精品性色| 国产日韩欧美亚洲二区| 黄色配什么色好看| 国产黄色免费在线视频| 男女国产视频网站| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美97在线视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 人人妻人人澡人人看| 黄色怎么调成土黄色| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产精品人妻久久久久久| 2022亚洲国产成人精品| 视频中文字幕在线观看| 在线观看www视频免费| 少妇的逼水好多| 日韩av不卡免费在线播放| 日日撸夜夜添| 人妻人人澡人人爽人人| 十八禁高潮呻吟视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 最新中文字幕久久久久| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产一级毛片在线| 黄色配什么色好看| 国产 一区精品| 在线观看国产h片| 一二三四在线观看免费中文在 | 免费观看av网站的网址| 亚洲av男天堂| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 99久久人妻综合| 国产免费现黄频在线看| 日韩伦理黄色片| 天美传媒精品一区二区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日韩制服骚丝袜av| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 男人操女人黄网站| 久久久久久久精品精品| 国产成人欧美| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲天堂av无毛| 99九九在线精品视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲av.av天堂| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲第一av免费看| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲内射少妇av| 国产黄色视频一区二区在线观看| a级片在线免费高清观看视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲综合精品二区| 新久久久久国产一级毛片| 99国产综合亚洲精品| xxx大片免费视频| 一本久久精品| 国产一区有黄有色的免费视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 有码 亚洲区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 宅男免费午夜| 黄片无遮挡物在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 九九爱精品视频在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 日韩三级伦理在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 国产激情久久老熟女| 欧美成人午夜精品| 亚洲国产日韩一区二区| 99香蕉大伊视频| 大片免费播放器 马上看| 日日啪夜夜爽| 一级片免费观看大全| 国国产精品蜜臀av免费| 欧美3d第一页| 精品酒店卫生间| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 免费黄色在线免费观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲国产精品专区欧美| 在线 av 中文字幕| 蜜桃在线观看..| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲欧洲国产日韩| 精品久久久精品久久久| 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲 欧美一区二区三区| av在线app专区| 亚洲人成77777在线视频| 久久久国产一区二区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲久久久国产精品| 草草在线视频免费看| 人妻少妇偷人精品九色| 十八禁网站网址无遮挡| 99热国产这里只有精品6| 丰满少妇做爰视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 免费观看a级毛片全部| 国产免费视频播放在线视频| videos熟女内射| 一级,二级,三级黄色视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产男女超爽视频在线观看| 午夜久久久在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产有黄有色有爽视频| 黑人猛操日本美女一级片| 男人舔女人的私密视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 伦理电影免费视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 母亲3免费完整高清在线观看 | 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产淫语在线视频| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 成年女人在线观看亚洲视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 一二三四中文在线观看免费高清| 欧美97在线视频| 22中文网久久字幕| 久久热在线av| 久久人人97超碰香蕉20202| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲色图综合在线观看| 中文字幕制服av| 亚洲av欧美aⅴ国产| 高清不卡的av网站| 日本91视频免费播放| 亚洲av中文av极速乱| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲精品,欧美精品| 精品国产国语对白av| 两个人免费观看高清视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久午夜福利片| 精品人妻在线不人妻| 久久精品国产自在天天线| 又黄又粗又硬又大视频| 久久av网站| 最黄视频免费看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久婷婷青草| 99香蕉大伊视频| 热99国产精品久久久久久7| 18+在线观看网站| 亚洲美女视频黄频| 人人澡人人妻人| 国产成人欧美| 人体艺术视频欧美日本| 丰满乱子伦码专区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 国产在视频线精品| 国产精品国产av在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 欧美精品亚洲一区二区| 国产成人精品在线电影| 久久综合国产亚洲精品| 夜夜爽夜夜爽视频| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲四区av| videosex国产| 国国产精品蜜臀av免费| 十八禁高潮呻吟视频| 国产一区二区在线观看日韩| 久久久久精品性色| 久久鲁丝午夜福利片| 成人国语在线视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 精品国产露脸久久av麻豆| 天堂8中文在线网| 美女中出高潮动态图| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 青春草国产在线视频| 在线看a的网站| 卡戴珊不雅视频在线播放| 男人添女人高潮全过程视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久久久网色| 色网站视频免费| 久久青草综合色| 精品人妻在线不人妻| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 美女大奶头黄色视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产在线视频一区二区| www.熟女人妻精品国产 | 亚洲精品自拍成人| 一区二区三区乱码不卡18| 十八禁网站网址无遮挡| 精品第一国产精品| 成人综合一区亚洲| www.色视频.com| 国产精品一二三区在线看| av.在线天堂| av卡一久久| 亚洲国产日韩一区二区| 国产综合精华液| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲精品色激情综合| 欧美成人午夜免费资源| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲五月色婷婷综合| 交换朋友夫妻互换小说| 日韩欧美精品免费久久| 看免费成人av毛片| 久久午夜综合久久蜜桃| 高清在线视频一区二区三区| 久久99精品国语久久久| 国产精品久久久久久精品电影小说| 精品国产露脸久久av麻豆| 亚洲精品av麻豆狂野| 一边亲一边摸免费视频| 99热全是精品| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 黄色配什么色好看| 日韩三级伦理在线观看| 欧美日韩av久久| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 日韩大片免费观看网站| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产欧美日韩综合在线一区二区| 热re99久久国产66热| 亚洲伊人色综图| av.在线天堂| 有码 亚洲区| 亚洲人与动物交配视频| 国产午夜精品一二区理论片| freevideosex欧美| 99久国产av精品国产电影| 久久久久久久久久久免费av| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 青春草视频在线免费观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 91成人精品电影| 精品国产一区二区久久| 黄色 视频免费看| 中文欧美无线码| 少妇人妻精品综合一区二区| 22中文网久久字幕| 国产精品熟女久久久久浪| 香蕉丝袜av| 亚洲综合精品二区| 欧美日韩综合久久久久久| av国产久精品久网站免费入址| 免费大片黄手机在线观看| 免费大片18禁| 熟女av电影| 在线观看国产h片| 亚洲人成网站在线观看播放| √禁漫天堂资源中文www| 美女中出高潮动态图| 国产激情久久老熟女| 亚洲国产看品久久| 国产亚洲欧美精品永久| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 极品人妻少妇av视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲av成人精品一二三区| 丝袜在线中文字幕| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲精品第二区| 国产精品 国内视频| 在现免费观看毛片| 亚洲欧美精品自产自拍| 日本欧美国产在线视频| 国产成人精品久久久久久| 免费日韩欧美在线观看| 欧美日韩综合久久久久久| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产免费现黄频在线看| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 国产av一区二区精品久久| 青春草亚洲视频在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 9色porny在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 人人澡人人妻人| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 日本爱情动作片www.在线观看| 在线精品无人区一区二区三| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 人妻一区二区av| 国产综合精华液| 久久av网站| 最近中文字幕高清免费大全6| www.av在线官网国产| 精品少妇内射三级| 欧美日韩综合久久久久久| 丰满少妇做爰视频| 熟女电影av网| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 欧美人与性动交α欧美软件 | 亚洲,一卡二卡三卡| 久久久久久久久久人人人人人人| 9191精品国产免费久久| 九九在线视频观看精品| av不卡在线播放| 精品福利永久在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 中文字幕制服av| www.色视频.com| 国产高清三级在线| 国产激情久久老熟女| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 秋霞在线观看毛片| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久精品久久久久久久性| 69精品国产乱码久久久| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲综合色惰| 午夜福利乱码中文字幕| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 少妇人妻 视频| 97在线人人人人妻| 精品午夜福利在线看| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产成人av激情在线播放| 国产成人精品福利久久|