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    副豬嗜血桿菌Flp-FRT雙基因敲除方法的建立與優(yōu)化

    2022-03-08 03:08:20肖坤雪王翹楚陳煥春蔡旭旺徐曉娟
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報 2022年1期
    關(guān)鍵詞:系統(tǒng)

    肖 靜,肖坤雪,王翹楚,陳煥春,蔡旭旺,徐曉娟

    (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430070)

    副豬嗜血桿菌(Glaesserellaparasuis,G.parasuis)是存在于豬上呼吸道的條件致病菌,可引起以纖維性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、急性肺炎和敗血病為特征的豬格氏病(Gl?sser’s disease),許多生豬養(yǎng)殖國家受其危害[1-3]。但目前對G.parasuis毒力因子和致病機(jī)制的了解還不夠充分,給豬格氏病的防控和疫苗研發(fā)帶來困難[4-5]。其中部分原因是G.parasuis轉(zhuǎn)化效率較低以及基因編輯工具缺乏,使得其遺傳操作相對較難[6-7]。目前,應(yīng)用于G.parasuis的遺傳操作系統(tǒng)是基于同源重組原理,通過自然轉(zhuǎn)化帶有抗性基因的自殺質(zhì)粒敲除/敲入目的基因[7-9]。該方法產(chǎn)生的突變株帶有抗生素抗性基因,這對缺失株本身會帶來極性效應(yīng),而且由于抗性基因的引入使其不可以作為弱毒疫苗使用。雖然有報道在G.parasuis基因組敲入負(fù)選擇標(biāo)記sacB可實(shí)現(xiàn)抗性基因的消除,但該方法需要構(gòu)建兩個質(zhì)粒和進(jìn)行兩次自然轉(zhuǎn)化[10],而且sacB基因本身易于自發(fā)失活[11-12],由此而產(chǎn)生的假陽性轉(zhuǎn)化子也給突變株的篩選帶來困難。因此對于G.parasuis,急需建立一個便捷高效的無抗性標(biāo)記的基因缺失系統(tǒng),以對其致病機(jī)制、毒力因子等方面進(jìn)行更深入的研究。

    Flp-FRT系統(tǒng)最初發(fā)現(xiàn)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的2-μm質(zhì)粒,由Flp重組酶(flippase)和FRT位點(diǎn)組成[13]。Flp位點(diǎn)特異性重組酶可以識別一段48 bp的FRT(flippase recognition target) 位點(diǎn)序列,在兩個方向相同的FRT位點(diǎn)間發(fā)生切割和再連接,導(dǎo)致位點(diǎn)中間片段缺失,并在作用位點(diǎn)留下一個FRT位點(diǎn)[14]。鑒于Flp-FRT系統(tǒng)這一特性且其具有低細(xì)胞毒性、高重組效率等優(yōu)點(diǎn),目前該系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于從原核生物[如大腸桿菌(Escherichiacoli)[15]、藍(lán)藻(cyanobacteria)[16]等]到真核生物[如玉米[17]、黑腹果蠅[18]、哺乳動物[19]等]各種不同物種的遺傳操作中。

    雖然Flp-FRT系統(tǒng)已在多種細(xì)菌中得到廣泛應(yīng)用[15, 20-22],但在G.parasuis中尚未見報道。要將Flp-FRT系統(tǒng)應(yīng)用于G.parasuis中實(shí)現(xiàn)多基因敲除,既要實(shí)現(xiàn)Flp重組酶的調(diào)控表達(dá),也要使Flp表達(dá)質(zhì)粒易于消除。目前已有各種不同的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)得到廣泛研究,如來源于E.coli的阿拉伯糖操縱子[23]和乳糖操縱子[24]、來源于λ噬菌體的λcI857/PRM/PR表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)[25]等,其中λcI857 /PRM/PR表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)對下游基因的表達(dá)由溫度調(diào)控,相較于其他表達(dá)調(diào)控系統(tǒng),該系統(tǒng)具有經(jīng)濟(jì)安全等優(yōu)點(diǎn),下游基因表達(dá)在溫度低于30 ℃時被阻遏,而溫度高于42 ℃時則被激活[13]。該方法的問題在于大多數(shù)誘導(dǎo)型啟動子無法做到完全的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控,且G.parasuis的最適生長溫度在37 ℃左右,若調(diào)控不夠嚴(yán)謹(jǐn),可能導(dǎo)致打靶質(zhì)粒在整合至基因組前,就在Flp重組酶作用下發(fā)生分子內(nèi)重組從而影響其轉(zhuǎn)化效率。但是已有報道突變的λcI857 /PRM/PR表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)在37 ℃左右也可實(shí)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控[26],并且突變的FRT位點(diǎn)可在一定程度上降低Flp重組酶介導(dǎo)的位點(diǎn)特應(yīng)性重組效率[27-28],這或許可對解決這一問題提供幫助。

    基于此,本研究首次將Flp-FRT系統(tǒng)應(yīng)用于G.parasuis的遺傳操作,將Flp重組酶基因置于該誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控下表達(dá),構(gòu)建了由λcI857/PRM/PR表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)控制的Flp重組酶表達(dá)載體質(zhì)粒,通過電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入G.parasuis細(xì)胞,隨后在基因組上引入FRT位點(diǎn)以實(shí)現(xiàn)連續(xù)的基因敲除,利用其構(gòu)建了G.parasuis的nanH、apd雙基因缺失株。進(jìn)一步對這一系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化,通過將篩選到的突變的FRT位點(diǎn)與野生型FRT位點(diǎn)結(jié)合使用,在一定程度上降低重組效率以提高轉(zhuǎn)化效率,從而提高系統(tǒng)穩(wěn)定性。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑

    胰蛋白胨大豆瓊脂(trypton soy agar, TSA),胰蛋白胨大豆肉湯(trypton soy broth, TSB)購自Difco。新生牛血清(NCS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)、卡那霉素、慶大霉素購自德國BioFroxx公司;環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)購自北京索萊寶科技有限公司;蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉購自英國OXOID公司。Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase、2 × Rapid Taq Master Mix、ClonExpress II One Step Cloning Kit、ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司;SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒 (12.5%)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液 (5×) 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;PVDF膜 (0.45 μm) 購自德國Merck公司;GAPDH Mouse McAb購自美國Proteintech Group公司;HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;底物顯色試劑盒(Clarity Western ECL Substrate)購自美國Bio-Rad公司;其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純??笰pd和抗NanH小鼠血清由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

    1.2 菌株培養(yǎng)與緩沖液

    本研究所用菌株如表1所示,其中G.parasuisCF7066及突變株生長用TSA或TSB培養(yǎng)基。按照說明書將培養(yǎng)基滅菌后每1 L加入新生牛血清50 mL、 1%的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸2 mL,按需加入終濃度為50 μg·mL-1的卡那霉素或20 μg·mL-1的慶大霉素。電轉(zhuǎn)化所用Sucrose/glycerol (SG) buffer包含15%甘油、272 mmol·L-1蔗糖。大腸桿菌DH5α的培養(yǎng)使用LB肉湯或LB瓊脂,根據(jù)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的抗性,加入終濃度為50 μg·mL-1的卡那霉素或20 μg·mL-1的慶大霉素。

    1.3 主要質(zhì)粒構(gòu)建

    研究中使用的質(zhì)粒如表1所示,其中質(zhì)粒pCP20和pKD4來自于大腸桿菌λ缺失突變系統(tǒng)研究[15],質(zhì)粒pSHG5、pKF-ΔnanH、pKF-Δapd2和pXKN-Flp均由本課題組前期構(gòu)建,質(zhì)粒pSHG5C-Flp、pXKC-Flp、pKFM-Δapd的構(gòu)建方法如下。

    pSHG5C-Flp的結(jié)構(gòu)如圖1a所示,DNA片段pUCori-GmR-pA13ori使用引物CFLP-V-F/R(表2)以質(zhì)粒pSHG5為模板通過PCR擴(kuò)增獲得,DNA片段λrepressor(cI857)-λPR-flp使用引物CFLP-F/R以質(zhì)粒pCP20[29]為模板擴(kuò)增,以上兩個DNA片段回收后通過ClonExpress II One Step Cloning Kit試劑盒融合構(gòu)建質(zhì)粒pSHG5C-Flp。該質(zhì)粒用于表達(dá)Flp重組酶從而介導(dǎo)抗性突變株中KanR表達(dá)盒的消除,其含有pA13ori溫敏的復(fù)制原點(diǎn),在培養(yǎng)G.parasuis時,30 ℃可以保持,42 ℃會發(fā)生丟失。

    表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒

    pXKC-Flp結(jié)構(gòu)如圖1b所示,DNA片段λrepressor(cI857)-λPR-flp使用引物KCFLP-V-F/R(表2)以質(zhì)粒pSHG5C-Flp為模板通過PCR擴(kuò)增獲得, DNA片段FRT-pUCori-FRT-KanR使用引物KCFLP-F/R(表2)以質(zhì)粒pXKN-Flp為模板擴(kuò)增,以上兩個DNA片段膠回收后通過ClonExpress II One Step Cloning Kit試劑盒融合構(gòu)建質(zhì)粒pXKC-Flp。該質(zhì)粒用于篩選突變的mFRT位點(diǎn)。

    pKFM-Δapd結(jié)構(gòu)如圖1c所示,apd上下游同源臂以CF7066基因組DNA為模板擴(kuò)增,pUC ori和卡那霉素抗性表達(dá)盒的DNA片段使用引物KFM-V-F/R(表2)以質(zhì)粒pKF-Δapd2為模板擴(kuò)增,DNA片段mFRT使用引物KFM-F/KFM-R(表2)以質(zhì)粒pXKC-Flp為模板擴(kuò)增,以上4個DNA片段回收后通過ClonExpress II One Step Cloning Kit試劑盒融合構(gòu)建質(zhì)粒pKFM-Δapd。

    1.4 自然轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化

    G.parasuis自然轉(zhuǎn)化參考 Bigas等[8]的方法。首先將細(xì)菌接種于TSA平板均勻劃線并于37 ℃培養(yǎng)16 h,長出的菌苔用2 mL TSB洗下并調(diào)整OD600 nm約0.9,取20 μL菌液、20 μL cAMP (8 mmol·L-1)、1 μg質(zhì)?;靹蚝蟮斡赥SA平板正置于37 ℃培養(yǎng)5 h。取200 μL TSB洗下菌苔并均勻涂布于相應(yīng)抗性的TSA平板,于37 ℃培養(yǎng)。

    G.parasuis電轉(zhuǎn)化參考Lancashire等[30]的方法并稍作改進(jìn)。細(xì)菌接種于TSA平板均勻劃線并于37 ℃培養(yǎng)14 h,長出的菌體用2 mL SG buffer洗下。離心收集菌體后用2 mL SG buffer重懸洗滌,重復(fù)3次,最終調(diào)整OD600nm約2.0。取100 μL菌液加入5 μg質(zhì)粒,冰浴30 min后加入預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中,于2.5 kV電擊一次后加入1 mL TSB,在37 ℃轉(zhuǎn)速為200 r·min-1的搖床復(fù)蘇2 h后均勻涂布于相應(yīng)抗性的TSA平板。由于穿梭質(zhì)粒pSHG5C-Flp攜帶溫度敏感型復(fù)制子,其在30 ℃可復(fù)制,而溫度高于42 ℃則停止復(fù)制[31]。電轉(zhuǎn)后細(xì)菌的培養(yǎng)條件為37 ℃/30 ℃交替培養(yǎng),溫度每12 h變換1次,以維持轉(zhuǎn)化子中溫敏質(zhì)粒復(fù)制。

    a. 溫敏穿梭質(zhì)粒pSHG5C-Flp,表達(dá)Flp重組酶介導(dǎo)Kan抗性基因消除;b. 質(zhì)粒pXKC-Flp,通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后的自剪切篩選mFRT位點(diǎn);c. 用于自然轉(zhuǎn)化的自殺質(zhì)粒pKFM-Δapd,單側(cè)含有mFRT位點(diǎn)a. The temperature-sensitive shuttle plasmid pSHG5C-Flp that mediated antibiotic resistance gene excision by Flp recombinase; b. The plasmid pXKC-Flp including the mutated FRT site, which was screened according to the self-excised occurrence in the transformed DH5α cells; c. The suicide plasmid pKFM-Δapd containing mFRT in unilateral site that was used for natural transformation圖1 本研究所用質(zhì)粒圖譜Fig.1 The maps of plasmids used in the study

    表2 本研究所用引物

    1.5 Flp重組酶作用檢測

    用自殺質(zhì)粒pKF-Δapd2自然轉(zhuǎn)化G.parasuisCF7066,轉(zhuǎn)化菌體涂布到TSA/KanR平板上于37 ℃培養(yǎng),長出的單菌落用引物APD-OUT-F/R(表2)進(jìn)行PCR篩選,得到CF7066Δapd::KanR突變體。接下來,用Flp表達(dá)質(zhì)粒pSHG5C-Flp電轉(zhuǎn)化CF7066Δapd::KanR,轉(zhuǎn)化菌體涂布到TSA/GmR平板上在37 ℃/30 ℃交替培養(yǎng),再使用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,篩選并鑒定無抗缺失株CF7066Δapd,通過抗性基因消除確定Flp酶的作用。

    1.6 nanH和apd基因連續(xù)敲除

    雙基因缺失株構(gòu)建流程如圖2a所示,構(gòu)建過程中CF7066基因組基因型變化如圖2b所示。首先用Flp表達(dá)質(zhì)粒pSHG5C-Flp電轉(zhuǎn)化G.parasuisCF7066,涂布于TSA/GmR平板上于37 ℃培養(yǎng),長出的轉(zhuǎn)化子使用質(zhì)粒鑒定引物G5C-F/R(表2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測抗性平板上長出的轉(zhuǎn)化子是否含有質(zhì)粒pSHG5C-Flp,含有質(zhì)粒的重組菌株即為CF7066(pSHG5C-Flp)。然后用pKF-ΔnanH自然轉(zhuǎn)化CF7066(pSHG5C-Flp),涂布TSA/KanR平板上于37 ℃/30 ℃交替培養(yǎng),長出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR,使用基因nanH外側(cè)引物NANH-OUT-F/R和質(zhì)粒鑒定引物G5C-F/R,篩選出無抗缺失株CF7066ΔnanH(pSHG5C-Flp)。

    a. 雙基因敲除流程圖;b.雙基因敲除基因型變化示意圖a. Schematic diagram of double gene knockout; b. Genotype changes of CF7066 genome圖2 通過質(zhì)粒pSHG5C-Flp進(jìn)行雙基因敲除的策略Fig.2 The strategy of double gene knockout by using plasmid pSHG5C-Flp

    接下來,將篩選到的有抗缺失突變株于TSA平板劃線傳代,在42 ℃下培養(yǎng)以消除質(zhì)粒pSHG5C-Flp,獲得無抗單基因缺失株CF7066ΔnanH;同時將其于慶大霉素抗性平板傳代,在37 ℃/30 ℃交替培養(yǎng),溫度每12 h變換1次,以保證溫敏穿梭質(zhì)粒pSHG5C-Flp的復(fù)制和Flp酶表達(dá),得到抗性消除的單基因缺失株CF7066ΔnanH(pSHG5C-Flp)。再用自殺質(zhì)粒pKF-Δapd2自然轉(zhuǎn)化CF7066ΔnanH(pSHG5C-Flp),用apd外側(cè)引物APD-OUT-F/R和質(zhì)粒鑒定引物G5C-F/R(表2)通過篩選無抗雙基因缺失株CF7066ΔnanHΔapd(pSHG5C-Flp),最后在TSA平板上42 ℃培養(yǎng)以消除質(zhì)粒,獲得雙基因缺失株CF7066ΔnanHΔapd。

    祖母信奉的瓜達(dá)盧佩圣母,代表著與西班牙殖民文化相對的墨西哥本土文化,是墨西哥的文化身份的象征。(石平萍,2005:25)賽利亞對祖母態(tài)度的變化在本質(zhì)上也是對祖母所代表的墨西哥傳統(tǒng)文化的態(tài)度變化。祖母長期被賽利亞視為“可怕祖母”。在敘述祖母的故事中,她逐漸理解了祖母嚴(yán)苛的外表下對兒孫們的愛,感覺到了與祖母之間的聯(lián)系:“我就是可怕祖母,我成為她,看到了她的內(nèi)心?!保?24)

    1.7 Western blot

    使用重組Apd和抗NanH蛋白的小鼠抗血清,通過Western blot檢測NanH和Apd蛋白的表達(dá)。野生株和缺失株分別接種于TSA平板37 ℃過夜培養(yǎng),取等量菌體用40 μL雙蒸水重懸,加入10 μL SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液 (5×) 并煮沸10 min后置于冰上冷卻。樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,TBST洗滌3次,于含5%脫脂乳的TBST溶液室溫封閉6 h后,分別按1∶5 000 加入抗Apd、抗NanH血清和GAPDH單克隆抗體于4 ℃過夜孵育。TBST洗滌3次后,將PVDF膜放入含5%脫脂乳的TBST溶液中,分別按1∶5 000加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG,室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,于ECL超敏化學(xué)發(fā)光液中顯色后將PVDF膜置于凝膠成像系統(tǒng)中顯色。

    1.8 轉(zhuǎn)化效率比較試驗(yàn)

    轉(zhuǎn)化效率比較試驗(yàn)按照“1.6”中缺失第一個基因的方法進(jìn)行。首先電轉(zhuǎn)化獲得組菌株CF7066(pSHG5C-Flp)自然轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行,然后取1 μg質(zhì)粒pKF-Δapd2和pKFM-Δapd,分別自然轉(zhuǎn)化CF7066(pSHG5C-Flp)。每組設(shè)置3個重復(fù),待長出轉(zhuǎn)化子后分別統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化子數(shù)。

    1.9 生長曲線測定

    使用 Bioscreen 全自動生長曲線分析儀測定菌株生長曲線,野生株和缺失株分別于TSA平板活化三代后取單菌落接種于5 mL TSB培養(yǎng)基,于37 ℃ 200 r·min-1震蕩培養(yǎng)12 h后按1∶100轉(zhuǎn)接于新鮮的TSB培養(yǎng)基。取Bioscreen全自動生長曲線分析儀專用的檢測板,每孔加入200 μL轉(zhuǎn)接菌液,每30 min測定菌液在600 nm波長處的吸光度(OD600nm),記錄并繪制生長曲線。

    2 結(jié) 果

    2.1 Flp重組酶消除基因組上KanR基因

    為了證實(shí)Flp-FRT系統(tǒng)在G.parasuis中是否發(fā)揮作用,本研究用λ噬菌體的可調(diào)控啟動子cI857/PRM/PR調(diào)控Flp基因的表達(dá),構(gòu)建了質(zhì)粒pSHG5C-Flp(圖1a)。然后,用Flp重組酶的表達(dá)質(zhì)粒pSHG5C-Flp電轉(zhuǎn)化CF7066Δapd::KanR,對長出的轉(zhuǎn)化子用基因apd外側(cè)引物和質(zhì)粒鑒定引物G5C-F/R通過PCR檢測。在基因apd外側(cè)引物APD-OUT-F/R的擴(kuò)增13個菌落中,8個菌落的基因型為Δapd::KanR(3 041 bp),5個菌落的基因型為Δapd(1 535 bp)。而同時pSHG5C-Flp質(zhì)粒鑒定引物G5C-F/ G5C-R的擴(kuò)增結(jié)果顯示,在8個基因型為Δapd::KanR的菌落中不存在質(zhì)粒,而在5個基因型為Δapd的菌落中有質(zhì)粒存在(869 bp)(圖3)。該結(jié)果表明,在質(zhì)粒pSHG5C-Flp得以成功轉(zhuǎn)化的有抗性標(biāo)記的突變株,F(xiàn)lp重組酶表達(dá)并介導(dǎo)了KanR基因的消除,從而獲得了G.parasuis無抗缺失株。

    a. 用Flp酶表達(dá)質(zhì)粒pSHG5C-Flp電轉(zhuǎn)化CF7066后基因型的改變;b.質(zhì)粒pSHG5C-Flp在轉(zhuǎn)化子中的存在a. The genotype change of CF7066 that was ecletrotransformed with pSHG5C-Flp expressing Flp recombinase amplication; b. The existence of pSHG5C-Flp in transformed bacterial cells圖3 Flp重組酶介導(dǎo)的KanR基因消除Fig.3 The KanR gene excision mediated by Flp recombinase

    2.2 Flp-FRT系統(tǒng)介導(dǎo)nanH和apd基因連續(xù)敲除

    為了能夠進(jìn)行G.parasuis雙基因連續(xù)敲除,首先用表達(dá)Flp酶的溫敏質(zhì)粒pSHG5C-Flp電轉(zhuǎn)化CF7066獲得重組菌CF7066(pSHG5C-Flp)。然后用自殺質(zhì)粒pKF-ΔnanH自然轉(zhuǎn)化重組菌CF7066(pSHG5C-Flp),獲得的轉(zhuǎn)化子用PCR篩選。結(jié)果表明,所檢測的22個轉(zhuǎn)化子中,都出現(xiàn)了有抗性標(biāo)記的缺失基因型ΔnanH::KanR(3 923 bp),其中18個中還包含抗性消除的缺失基因型ΔnanH(2 417 bp), 而且在出現(xiàn)無抗缺失株的18個轉(zhuǎn)化子中均檢測到了Flp酶表達(dá)質(zhì)粒的存在(圖4a)。選擇1#轉(zhuǎn)化子在TSA平板分別于42 ℃和37 ℃/30 ℃上培養(yǎng)。結(jié)果表明,在42 ℃培養(yǎng)的22個單菌落中,19個菌落出現(xiàn)了抗性基因消除,但質(zhì)粒pSHG5C-Flp的丟失不一致;而在37 ℃/30 ℃培養(yǎng)的22個單菌落中,22個菌落中的抗性基因全部消除,并且質(zhì)粒pSHG5C-Flp全部存在,選擇17#菌株進(jìn)行下一個基因敲除(圖4b、c)。可見,CF7066(pSHG5C-Flp)可表達(dá)Flp酶并介導(dǎo)抗性突變株中KanR的消除,同時也證實(shí)溫敏質(zhì)粒pSHG5C-Flp在37 ℃/30 ℃ 培養(yǎng)可以表達(dá)具有活性的Flp重組酶。

    a.用pKF-ΔnanH自然轉(zhuǎn)化CF7066(pSHG5C-Flp)后基因型的改變;b. 42℃培養(yǎng)后抗性消除和質(zhì)粒丟失;c. 37/30 ℃培養(yǎng)后抗性消除和質(zhì)粒丟失a. The genotype change of CF7066(pSHG5C-Flp)transformants following natural transformation with pKF-ΔnanH; b. The resistance cassette excision and plasmid curing following culturation at 42 ℃; c. The resistance cassette excision and plasmid caring following cultaration at 37/30 ℃圖4 缺失株CF7066ΔnanH構(gòu)建Fig.4 The construction of the deletion strain CF7066ΔnanH

    接下來,再用質(zhì)粒pKF-Δapd2自然轉(zhuǎn)化CF7066ΔnanH(pSHG5C-Flp)。結(jié)果顯示,雖然在22個菌落中均可檢測到質(zhì)粒pSHG5C-Flp,但僅有3個菌落出現(xiàn)了有抗性標(biāo)記的apd缺失的基因型,而其余19個為轉(zhuǎn)化前的基因型(圖5a)。將篩選到的有抗性消除的apd基因缺失株(11#)于42 ℃ 在TSA平板上培養(yǎng),篩選并獲得到了雙基因缺失株CF7066ΔnanHΔapd(12#),同時也實(shí)現(xiàn)了質(zhì)粒pSHG5C-Flp的消除(圖5b)。以該雙基因缺失株為模板,用nanH和apd基因外側(cè)引物擴(kuò)增目的片段并進(jìn)行序列分析,結(jié)果表明示nanH和apd均成功敲除,并在缺失的基因座留下了FRT位點(diǎn)(圖5c)。進(jìn)一步,分別使用Apd和抗NanH蛋白的小鼠抗血清進(jìn)行 Western blot檢測,可見雙基因缺失株中無兩種蛋白的印跡,而野生型菌株中均有兩種蛋白預(yù)期大小的印跡(圖5d)。上述結(jié)果表明,在CF7066菌株中預(yù)先轉(zhuǎn)化表達(dá)Flp重組酶的溫敏質(zhì)粒pSHG5C-Flp,可以實(shí)現(xiàn)G.parasuis基因組上KanR基因的切除以及雙基因連續(xù)敲除。

    2.3 FRT突變位點(diǎn)的篩選

    在進(jìn)行nanH和apd基因連續(xù)敲除時,有抗性標(biāo)記的突變體在第一個基因敲除時出現(xiàn)的比率為100%(22/22)(圖4a),而在第二個基因敲除時出現(xiàn)的比率僅為13.6%(3/22)(圖5a)。抗性突變體在敲除第二個基因時的比率大為下降,有可能是質(zhì)粒pSHG5C-Flp在菌體內(nèi)的持續(xù)存在和Flp重組酶持續(xù)表達(dá)的積累,對自然轉(zhuǎn)化后的自殺質(zhì)粒介導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組,從而減少了抗性缺失突變株的獲得。因此,通過篩選有點(diǎn)突變FRT的序列,以降低積累的Flp重組酶對自然轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組的干擾和抗性突變株的獲得。

    a. 用pKF-Δapd2自然轉(zhuǎn)化CF7066ΔnanH(pSHG5C-Flp)后基因型的改變;b. 42 ℃培養(yǎng)后抗性消除和質(zhì)粒丟失;c. PCR產(chǎn)物測序鑒定靶基因的敲除;d. Western blot 檢測敲除基因蛋白的表達(dá)a. The genotype change of CF7066ΔnanH(pSHG5C-Flp)transformants following natural transformation with pKF-Δapd2; b. The resistance cassette excision and plasmid curing following culturation at 42℃; c. Identification of gene knockout by sequence analysis of PCR products; d. Detection of the protein expression of the knocked-out genes圖5 缺失株CF7066ΔnanHΔapd的構(gòu)建Fig.5 The construction of the deletion strain CF7066ΔnanHΔapd

    a. mFRT篩選結(jié)果;b. mFRT測序結(jié)果(wtFRT.野生型FRT位點(diǎn);mFRT.突變FRT位點(diǎn))a. The screening results of mFRT; b. The mFRT sequence (wtFRT. Wild type FRT; mFRT. Mutant FRT)圖6 突變FRT位點(diǎn)的篩選Fig.6 Screening of the mutated FRT site

    2.4 突變FRT位點(diǎn)提高系統(tǒng)的穩(wěn)定性

    首先,將質(zhì)粒pKF-Δapd2的KanR基因上游FRT位點(diǎn)替換為篩選到的突變FRT位點(diǎn)(mFRT),構(gòu)建質(zhì)粒pKFM-Δapd(圖1c)。然后,用pKFM-Δapd自然轉(zhuǎn)化單基因缺失株CF7066ΔnanH(pSHG5C-Flp),結(jié)果在22個菌落中,均可檢測到質(zhì)粒pSHG5C-Flp的存在并出現(xiàn)了有抗性標(biāo)記的apd基因缺失的基因型(Δapd::KanR)(圖7a)。可見,單側(cè)突變的mFRT位點(diǎn)有效降低了Flp重組酶的負(fù)效應(yīng),使有抗性標(biāo)記突變體出現(xiàn)的比率從原來的13.6%(3/22)(圖5a)提高到100%(22/22)。最后,選擇7#突變體于TSA/Gm平板劃線傳代,并于37 ℃/30 ℃交替培養(yǎng),22#菌落的抗性表達(dá)盒被切除(圖7b)。以上結(jié)果表明,抗性基因一側(cè)引入突變的mFRT位點(diǎn),保證了自然轉(zhuǎn)化后同源重組和等位交換的發(fā)生,而提高了該系統(tǒng)的有效性和穩(wěn)定性。此外,用質(zhì)粒pKF-Δapd2和pKFM-Δapd分別轉(zhuǎn)化CF7066(pSHG5C-Flp)進(jìn)行了轉(zhuǎn)化效率的比較。結(jié)果表明,使用具有mFRT位點(diǎn)的質(zhì)粒pFKM-Δapd轉(zhuǎn)化時,獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)目比未突變時提高約6倍(圖7c)。

    a. 用pKFM-Δapd自然轉(zhuǎn)化CF7066ΔnanH(pSHG5C-Flp)后基因型的改變;b. 37/30 ℃培養(yǎng)后抗性消除和質(zhì)粒丟失;c. 質(zhì)粒pKF-Δapd2和pKFM-Δapd轉(zhuǎn)化效率比較,***代表P<0.001a. The genotype change of CF7066ΔnanH(pSHG5C-Flp) transformants following natural transformation with pKFM-Δapd; b. The resistance cassette excision and plasmid curing following culturation at 37/30 ℃; c. Comparison of the transformation efficiency of plasmid pKF-Δapd2 and pKFM-Δapd,*** represents P<0.001圖7 突變FRT位點(diǎn)的應(yīng)用Fig.7 The employment of mutant FRT site

    2.5 nanH、apd基因缺失對CF7066生長的影響

    比較野生株CF7066和3株缺失株ΔnanH、Δapd、ΔnanHΔapd的生長曲線發(fā)現(xiàn),Δapd缺失株與野生株的生長曲線并無顯著差異;而CF7066缺失株ΔnanH和ΔnanHΔapd與其野生型相比,不僅進(jìn)入對數(shù)期的時間更晚、穩(wěn)定期的時間更短,到達(dá)穩(wěn)定期的OD600nm數(shù)值也都低于野生株(圖8)。以上結(jié)果說明apd基因的缺失對G.parasuis生長速率并無顯著影響,而nanH基因的缺失顯著降低了生長效率,并使得菌株更早進(jìn)入衰亡期。因此CF7066唾液酸酶nanH基因的缺失可能導(dǎo)致環(huán)境中唾液酸代謝障礙從而影響CF7066的生長。

    圖8 CF7066野生型和基因缺失株的生長曲線Fig.8 The growth curves of the CF7066 WT and deletion mutants

    3 討 論

    G.parasuis遺傳操作工具的缺乏限制了其分子生物學(xué)研究的進(jìn)展,因此建立一個穩(wěn)定高效的遺傳操作系統(tǒng)對其致病機(jī)制、毒力因子等研究具有重要意義。本研究利用λcI857/PRM/PR表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)控制Flp重組酶表達(dá),隨后自然轉(zhuǎn)化自殺性質(zhì)粒在基因組靶位點(diǎn)引入含有FRT位點(diǎn)的抗性標(biāo)記,通過Flp重組酶表達(dá)切除抗性基因,實(shí)現(xiàn)了抗性標(biāo)記循環(huán)使用和基因連續(xù)敲除,最后提高溫度消除Flp表達(dá)質(zhì)粒,成功敲除了G.parasuisCF7066的nanH和apd基因。

    對Flp重組酶的表達(dá)質(zhì)粒pSHG5C-Flp而言,F(xiàn)lp的表達(dá)受到λ噬菌體右啟動子PR控制和cI857/PRM蛋白的調(diào)控,即該啟動子在30 ℃被阻遏,在42 ℃ 被激活[13]。作者計(jì)劃用Flp酶表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化G.parasuis后在30 ℃培養(yǎng),然后用自殺性質(zhì)粒自然轉(zhuǎn)化后也在30 ℃培養(yǎng)并獲得抗性突變體,因?yàn)樵?0 ℃培養(yǎng),溫敏質(zhì)粒可以穩(wěn)定復(fù)制,而且Flp酶沒有活性。最后,對自然轉(zhuǎn)化獲得的抗性突變株,在42 ℃培養(yǎng)以誘導(dǎo)Flp酶的表達(dá)進(jìn)而切除抗性基因并且消除質(zhì)粒。然而實(shí)際情況是,由于G.parasuis在30 ℃生長緩慢,在此溫度下多次自然轉(zhuǎn)化均無轉(zhuǎn)化子長出。已有研究報道突變的λcI857/PRM/PR系統(tǒng)可將調(diào)控表達(dá)的溫度從30 ℃提高至37 ℃[26]。所以在當(dāng)前研究中,為了既調(diào)控Flp重組酶的表達(dá)又不影響自然轉(zhuǎn)化效率,作者將攜帶CF7066(pSHG5C-Flp)在37 ℃/30 ℃交替培養(yǎng)作為受體菌。結(jié)果,在自然轉(zhuǎn)化敲除CF7066的nanH和apd基因時,初代轉(zhuǎn)化子中竟然出現(xiàn)了無抗性標(biāo)記缺失突變體,一次性完成了同源重組和抗性消除(圖4、5)。盡管自然轉(zhuǎn)化初代可獲得無抗缺失突變體令人欣喜,但在敲除第二個基因時,自然轉(zhuǎn)化后發(fā)生同源重組的突變體比率明顯下降。所幸的是,通過構(gòu)建單側(cè)FRT位點(diǎn)突變的質(zhì)粒,有效提高了自然轉(zhuǎn)化后同源重組的發(fā)生和抗性突變體的產(chǎn)生,從而保證了該雙基因敲除系統(tǒng)的有效性和穩(wěn)定性。

    G.parasuis中遺傳操作方法比較有限,本研究與Bigas等[8]報道的遺傳操作系統(tǒng)相比,本方法消除了遺留在基因組上的抗性基因表達(dá)盒,減少了潛在引起的極性效應(yīng),更有利于對目的基因的進(jìn)一步研究。另外,Zhang等[10]也報道了利用反選擇標(biāo)記進(jìn)一步敲除抗性基因的方法,但該方法每敲除一個基因需要構(gòu)建兩個質(zhì)粒,而且由于大部分G.parasuis對蔗糖不敏感、sacB基因本身易于自發(fā)失活而產(chǎn)生假陽性轉(zhuǎn)化子,這使得該方法難以在更多的菌株中使用。而本研究所建立的方法,不論在操作的簡便性和對轉(zhuǎn)化菌株的普適性上都有所提高,而且還可以進(jìn)行雙基因連續(xù)敲除。

    對G.parasuis而言,廣泛存在的限制修飾系統(tǒng)引起的轉(zhuǎn)化屏障是其遺傳操作困難的原因之一[6-7]。本研究只需要將表達(dá)Flp重組酶的溫敏穿梭質(zhì)粒進(jìn)行一次電轉(zhuǎn)化,就可以實(shí)現(xiàn)兩個基因的連續(xù)敲除,這不僅降低了操作難度也極大簡化了實(shí)驗(yàn)流程。進(jìn)一步對該系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化,通過篩選突變的FRT位點(diǎn)降低Flp重組酶介導(dǎo)的重組效率,雖然在一定程度上降低了自然轉(zhuǎn)化后初代轉(zhuǎn)化子中出現(xiàn)無抗敲除的效率,但極大提高了系統(tǒng)的穩(wěn)定性。最終獲得了可以用于G.parasuis的無抗和雙基因連續(xù)敲除的突變系統(tǒng)。

    所不足的是,本研究利用Flp-FRT系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)抗性基因的敲除,最終會在目的基因處留下一個FRT位點(diǎn),因此尚難以實(shí)現(xiàn)不留痕跡的基因敲除。另一方面,留下的FRT位點(diǎn)也給連續(xù)的多基因敲除帶來一定困擾,雖然本研究成功利用Flp-FRT系統(tǒng)構(gòu)建了CF7066的雙基因敲除菌株,這可能是由于基因nanH和apd在基因組上相距較遠(yuǎn)(約913 kb),如果發(fā)生基因nanH和apd間大DNA片段敲除必然會導(dǎo)致中間必須基因的失活造成致死性突變。但在敲除兩個相隔較近的基因時,F(xiàn)lp-FRT系統(tǒng)的這一缺陷是不得不考慮的問題。為了避免這一問題的發(fā)生,可以在敲除距離較近的兩個基因時分別使用不同的兩組FRT位點(diǎn),從而消除該系統(tǒng)的這一缺陷[27-28,32]。

    4 結(jié) 論

    利用Flp-FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng),構(gòu)建了副豬嗜血桿菌CF7066雙基因缺失株,建立了針對副豬嗜血桿菌的無抗性標(biāo)記的基因缺失系統(tǒng),為副豬嗜血桿菌基因功能研究、基因工程疫苗研發(fā)提供了有效的工具。

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