副豬嗜血桿菌Flp-FRT雙基因敲除方法的建立與優(yōu)化

肖 靜，肖坤雪，王翹楚，陳煥春，蔡旭旺，徐曉娟

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070)

副豬嗜血桿菌(Glaesserellaparasuis,G.parasuis)是存在于豬上呼吸道的條件致病菌，可引起以纖維性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、急性肺炎和敗血病為特征的豬格氏病(Gl?sser’s disease)，許多生豬養(yǎng)殖國(guó)家受其危害[1-3]。但目前對(duì)G.parasuis毒力因子和致病機(jī)制的了解還不夠充分，給豬格氏病的防控和疫苗研發(fā)帶來(lái)困難[4-5]。其中部分原因是G.parasuis轉(zhuǎn)化效率較低以及基因編輯工具缺乏，使得其遺傳操作相對(duì)較難[6-7]。目前，應(yīng)用于G.parasuis的遺傳操作系統(tǒng)是基于同源重組原理，通過(guò)自然轉(zhuǎn)化帶有抗性基因的自殺質(zhì)粒敲除/敲入目的基因[7-9]。該方法產(chǎn)生的突變株帶有抗生素抗性基因，這對(duì)缺失株本身會(huì)帶來(lái)極性效應(yīng)，而且由于抗性基因的引入使其不可以作為弱毒疫苗使用。雖然有報(bào)道在G.parasuis基因組敲入負(fù)選擇標(biāo)記sacB可實(shí)現(xiàn)抗性基因的消除，但該方法需要構(gòu)建兩個(gè)質(zhì)粒和進(jìn)行兩次自然轉(zhuǎn)化[10]，而且sacB基因本身易于自發(fā)失活[11-12]，由此而產(chǎn)生的假陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子也給突變株的篩選帶來(lái)困難。因此對(duì)于G.parasuis，急需建立一個(gè)便捷高效的無(wú)抗性標(biāo)記的基因缺失系統(tǒng)，以對(duì)其致病機(jī)制、毒力因子等方面進(jìn)行更深入的研究。

Flp-FRT系統(tǒng)最初發(fā)現(xiàn)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的2-μm質(zhì)粒，由Flp重組酶(flippase)和FRT位點(diǎn)組成[13]。Flp位點(diǎn)特異性重組酶可以識(shí)別一段48 bp的FRT(flippase recognition target) 位點(diǎn)序列，在兩個(gè)方向相同的FRT位點(diǎn)間發(fā)生切割和再連接，導(dǎo)致位點(diǎn)中間片段缺失，并在作用位點(diǎn)留下一個(gè)FRT位點(diǎn)[14]。鑒于Flp-FRT系統(tǒng)這一特性且其具有低細(xì)胞毒性、高重組效率等優(yōu)點(diǎn)，目前該系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于從原核生物[如大腸桿菌(Escherichiacoli)[15]、藍(lán)藻(cyanobacteria)[16]等]到真核生物[如玉米[17]、黑腹果蠅[18]、哺乳動(dòng)物[19]等]各種不同物種的遺傳操作中。

雖然Flp-FRT系統(tǒng)已在多種細(xì)菌中得到廣泛應(yīng)用[15, 20-22]，但在G.parasuis中尚未見(jiàn)報(bào)道。要將Flp-FRT系統(tǒng)應(yīng)用于G.parasuis中實(shí)現(xiàn)多基因敲除，既要實(shí)現(xiàn)Flp重組酶的調(diào)控表達(dá)，也要使Flp表達(dá)質(zhì)粒易于消除。目前已有各種不同的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)得到廣泛研究，如來(lái)源于E.coli的阿拉伯糖操縱子[23]和乳糖操縱子[24]、來(lái)源于λ噬菌體的λcI857/PRM/PR表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)[25]等，其中λcI857 /PRM/PR表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)對(duì)下游基因的表達(dá)由溫度調(diào)控，相較于其他表達(dá)調(diào)控系統(tǒng),該系統(tǒng)具有經(jīng)濟(jì)安全等優(yōu)點(diǎn)，下游基因表達(dá)在溫度低于30 ℃時(shí)被阻遏，而溫度高于42 ℃時(shí)則被激活[13]。該方法的問(wèn)題在于大多數(shù)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子無(wú)法做到完全的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控，且G.parasuis的最適生長(zhǎng)溫度在37 ℃左右，若調(diào)控不夠嚴(yán)謹(jǐn)，可能導(dǎo)致打靶質(zhì)粒在整合至基因組前，就在Flp重組酶作用下發(fā)生分子內(nèi)重組從而影響其轉(zhuǎn)化效率。但是已有報(bào)道突變的λcI857 /PRM/PR表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)在37 ℃左右也可實(shí)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控[26]，并且突變的FRT位點(diǎn)可在一定程度上降低Flp重組酶介導(dǎo)的位點(diǎn)特應(yīng)性重組效率[27-28]，這或許可對(duì)解決這一問(wèn)題提供幫助。

基于此，本研究首次將Flp-FRT系統(tǒng)應(yīng)用于G.parasuis的遺傳操作，將Flp重組酶基因置于該誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)，構(gòu)建了由λcI857/PRM/PR表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)控制的Flp重組酶表達(dá)載體質(zhì)粒，通過(guò)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入G.parasuis細(xì)胞，隨后在基因組上引入FRT位點(diǎn)以實(shí)現(xiàn)連續(xù)的基因敲除，利用其構(gòu)建了G.parasuis的nanH、apd雙基因缺失株。進(jìn)一步對(duì)這一系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)將篩選到的突變的FRT位點(diǎn)與野生型FRT位點(diǎn)結(jié)合使用，在一定程度上降低重組效率以提高轉(zhuǎn)化效率，從而提高系統(tǒng)穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂(trypton soy agar, TSA)，胰蛋白胨大豆肉湯(trypton soy broth, TSB)購(gòu)自Difco。新生牛血清(NCS)購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)、卡那霉素、慶大霉素購(gòu)自德國(guó)BioFroxx公司；環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉購(gòu)自英國(guó)OXOID公司。Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase、2 × Rapid Taq Master Mix、ClonExpress II One Step Cloning Kit、ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek公司；SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒 (12.5%)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液 (5×) 購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜 (0.45 μm) 購(gòu)自德國(guó)Merck公司；GAPDH Mouse McAb購(gòu)自美國(guó)Proteintech Group公司；HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；底物顯色試劑盒(Clarity Western ECL Substrate)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?？笰pd和抗NanH小鼠血清由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.2 菌株培養(yǎng)與緩沖液

本研究所用菌株如表1所示，其中G.parasuisCF7066及突變株生長(zhǎng)用TSA或TSB培養(yǎng)基。按照說(shuō)明書(shū)將培養(yǎng)基滅菌后每1 L加入新生牛血清50 mL、 1%的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸2 mL，按需加入終濃度為50 μg·mL-1的卡那霉素或20 μg·mL-1的慶大霉素。電轉(zhuǎn)化所用Sucrose/glycerol (SG) buffer包含15%甘油、272 mmol·L-1蔗糖。大腸桿菌DH5α的培養(yǎng)使用LB肉湯或LB瓊脂，根據(jù)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的抗性，加入終濃度為50 μg·mL-1的卡那霉素或20 μg·mL-1的慶大霉素。

1.3 主要質(zhì)粒構(gòu)建

研究中使用的質(zhì)粒如表1所示，其中質(zhì)粒pCP20和pKD4來(lái)自于大腸桿菌λ缺失突變系統(tǒng)研究[15]，質(zhì)粒pSHG5、pKF-ΔnanH、pKF-Δapd2和pXKN-Flp均由本課題組前期構(gòu)建，質(zhì)粒pSHG5C-Flp、pXKC-Flp、pKFM-Δapd的構(gòu)建方法如下。

pSHG5C-Flp的結(jié)構(gòu)如圖1a所示，DNA片段pUCori-GmR-pA13ori使用引物CFLP-V-F/R(表2)以質(zhì)粒pSHG5為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得，DNA片段λrepressor(cI857)-λPR-flp使用引物CFLP-F/R以質(zhì)粒pCP20[29]為模板擴(kuò)增，以上兩個(gè)DNA片段回收后通過(guò)ClonExpress II One Step Cloning Kit試劑盒融合構(gòu)建質(zhì)粒pSHG5C-Flp。該質(zhì)粒用于表達(dá)Flp重組酶從而介導(dǎo)抗性突變株中KanR表達(dá)盒的消除，其含有pA13ori溫敏的復(fù)制原點(diǎn)，在培養(yǎng)G.parasuis時(shí)，30 ℃可以保持，42 ℃會(huì)發(fā)生丟失。

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒

pXKC-Flp結(jié)構(gòu)如圖1b所示，DNA片段λrepressor(cI857)-λPR-flp使用引物KCFLP-V-F/R(表2)以質(zhì)粒pSHG5C-Flp為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得, DNA片段FRT-pUCori-FRT-KanR使用引物KCFLP-F/R(表2)以質(zhì)粒pXKN-Flp為模板擴(kuò)增，以上兩個(gè)DNA片段膠回收后通過(guò)ClonExpress II One Step Cloning Kit試劑盒融合構(gòu)建質(zhì)粒pXKC-Flp。該質(zhì)粒用于篩選突變的mFRT位點(diǎn)。

pKFM-Δapd結(jié)構(gòu)如圖1c所示，apd上下游同源臂以CF7066基因組DNA為模板擴(kuò)增，pUC ori和卡那霉素抗性表達(dá)盒的DNA片段使用引物KFM-V-F/R(表2)以質(zhì)粒pKF-Δapd2為模板擴(kuò)增，DNA片段mFRT使用引物KFM-F/KFM-R(表2)以質(zhì)粒pXKC-Flp為模板擴(kuò)增，以上4個(gè)DNA片段回收后通過(guò)ClonExpress II One Step Cloning Kit試劑盒融合構(gòu)建質(zhì)粒pKFM-Δapd。

1.4 自然轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化

G.parasuis自然轉(zhuǎn)化參考 Bigas等[8]的方法。首先將細(xì)菌接種于TSA平板均勻劃線并于37 ℃培養(yǎng)16 h，長(zhǎng)出的菌苔用2 mL TSB洗下并調(diào)整OD600 nm約0.9，取20 μL菌液、20 μL cAMP (8 mmol·L-1)、1 μg質(zhì)?；靹蚝蟮斡赥SA平板正置于37 ℃培養(yǎng)5 h。取200 μL TSB洗下菌苔并均勻涂布于相應(yīng)抗性的TSA平板，于37 ℃培養(yǎng)。

G.parasuis電轉(zhuǎn)化參考Lancashire等[30]的方法并稍作改進(jìn)。細(xì)菌接種于TSA平板均勻劃線并于37 ℃培養(yǎng)14 h，長(zhǎng)出的菌體用2 mL SG buffer洗下。離心收集菌體后用2 mL SG buffer重懸洗滌，重復(fù)3次，最終調(diào)整OD600nm約2.0。取100 μL菌液加入5 μg質(zhì)粒，冰浴30 min后加入預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中，于2.5 kV電擊一次后加入1 mL TSB，在37 ℃轉(zhuǎn)速為200 r·min-1的搖床復(fù)蘇2 h后均勻涂布于相應(yīng)抗性的TSA平板。由于穿梭質(zhì)粒pSHG5C-Flp攜帶溫度敏感型復(fù)制子，其在30 ℃可復(fù)制，而溫度高于42 ℃則停止復(fù)制[31]。電轉(zhuǎn)后細(xì)菌的培養(yǎng)條件為37 ℃/30 ℃交替培養(yǎng)，溫度每12 h變換1次，以維持轉(zhuǎn)化子中溫敏質(zhì)粒復(fù)制。

a. 溫敏穿梭質(zhì)粒pSHG5C-Flp，表達(dá)Flp重組酶介導(dǎo)Kan抗性基因消除；b. 質(zhì)粒pXKC-Flp，通過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后的自剪切篩選mFRT位點(diǎn)；c. 用于自然轉(zhuǎn)化的自殺質(zhì)粒pKFM-Δapd，單側(cè)含有mFRT位點(diǎn)a. The temperature-sensitive shuttle plasmid pSHG5C-Flp that mediated antibiotic resistance gene excision by Flp recombinase; b. The plasmid pXKC-Flp including the mutated FRT site, which was screened according to the self-excised occurrence in the transformed DH5α cells; c. The suicide plasmid pKFM-Δapd containing mFRT in unilateral site that was used for natural transformation圖1 本研究所用質(zhì)粒圖譜Fig.1 The maps of plasmids used in the study

表2 本研究所用引物

1.5 Flp重組酶作用檢測(cè)

用自殺質(zhì)粒pKF-Δapd2自然轉(zhuǎn)化G.parasuisCF7066，轉(zhuǎn)化菌體涂布到TSA/KanR平板上于37 ℃培養(yǎng)，長(zhǎng)出的單菌落用引物APD-OUT-F/R(表2)進(jìn)行PCR篩選，得到CF7066Δapd::KanR突變體。接下來(lái)，用Flp表達(dá)質(zhì)粒pSHG5C-Flp電轉(zhuǎn)化CF7066Δapd::KanR，轉(zhuǎn)化菌體涂布到TSA/GmR平板上在37 ℃/30 ℃交替培養(yǎng)，再使用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選并鑒定無(wú)抗缺失株CF7066Δapd，通過(guò)抗性基因消除確定Flp酶的作用。

1.6 nanH和apd基因連續(xù)敲除

雙基因缺失株構(gòu)建流程如圖2a所示，構(gòu)建過(guò)程中CF7066基因組基因型變化如圖2b所示。首先用Flp表達(dá)質(zhì)粒pSHG5C-Flp電轉(zhuǎn)化G.parasuisCF7066，涂布于TSA/GmR平板上于37 ℃培養(yǎng)，長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子使用質(zhì)粒鑒定引物G5C-F/R(表2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)抗性平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子是否含有質(zhì)粒pSHG5C-Flp，含有質(zhì)粒的重組菌株即為CF7066(pSHG5C-Flp)。然后用pKF-ΔnanH自然轉(zhuǎn)化CF7066(pSHG5C-Flp)，涂布TSA/KanR平板上于37 ℃/30 ℃交替培養(yǎng)，長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR，使用基因nanH外側(cè)引物NANH-OUT-F/R和質(zhì)粒鑒定引物G5C-F/R，篩選出無(wú)抗缺失株CF7066ΔnanH(pSHG5C-Flp)。

a. 雙基因敲除流程圖；b.雙基因敲除基因型變化示意圖a. Schematic diagram of double gene knockout; b. Genotype changes of CF7066 genome圖2 通過(guò)質(zhì)粒pSHG5C-Flp進(jìn)行雙基因敲除的策略Fig.2 The strategy of double gene knockout by using plasmid pSHG5C-Flp

接下來(lái)，將篩選到的有抗缺失突變株于TSA平板劃線傳代，在42 ℃下培養(yǎng)以消除質(zhì)粒pSHG5C-Flp，獲得無(wú)抗單基因缺失株CF7066ΔnanH；同時(shí)將其于慶大霉素抗性平板傳代，在37 ℃/30 ℃交替培養(yǎng)，溫度每12 h變換1次，以保證溫敏穿梭質(zhì)粒pSHG5C-Flp的復(fù)制和Flp酶表達(dá)，得到抗性消除的單基因缺失株CF7066ΔnanH(pSHG5C-Flp)。再用自殺質(zhì)粒pKF-Δapd2自然轉(zhuǎn)化CF7066ΔnanH(pSHG5C-Flp)，用apd外側(cè)引物APD-OUT-F/R和質(zhì)粒鑒定引物G5C-F/R(表2)通過(guò)篩選無(wú)抗雙基因缺失株CF7066ΔnanHΔapd(pSHG5C-Flp)，最后在TSA平板上42 ℃培養(yǎng)以消除質(zhì)粒，獲得雙基因缺失株CF7066ΔnanHΔapd。

祖母信奉的瓜達(dá)盧佩圣母，代表著與西班牙殖民文化相對(duì)的墨西哥本土文化，是墨西哥的文化身份的象征。（石平萍,2005:25）賽利亞對(duì)祖母態(tài)度的變化在本質(zhì)上也是對(duì)祖母所代表的墨西哥傳統(tǒng)文化的態(tài)度變化。祖母長(zhǎng)期被賽利亞視為“可怕祖母”。在敘述祖母的故事中，她逐漸理解了祖母嚴(yán)苛的外表下對(duì)兒孫們的愛(ài)，感覺(jué)到了與祖母之間的聯(lián)系：“我就是可怕祖母，我成為她，看到了她的內(nèi)心?！保?24）

1.7 Western blot

使用重組Apd和抗NanH蛋白的小鼠抗血清，通過(guò)Western blot檢測(cè)NanH和Apd蛋白的表達(dá)。野生株和缺失株分別接種于TSA平板37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，取等量菌體用40 μL雙蒸水重懸，加入10 μL SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液 (5×) 并煮沸10 min后置于冰上冷卻。樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，TBST洗滌3次，于含5%脫脂乳的TBST溶液室溫封閉6 h后，分別按1∶5 000 加入抗Apd、抗NanH血清和GAPDH單克隆抗體于4 ℃過(guò)夜孵育。TBST洗滌3次后，將PVDF膜放入含5%脫脂乳的TBST溶液中，分別按1∶5 000加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG,室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，于ECL超敏化學(xué)發(fā)光液中顯色后將PVDF膜置于凝膠成像系統(tǒng)中顯色。

1.8 轉(zhuǎn)化效率比較試驗(yàn)

轉(zhuǎn)化效率比較試驗(yàn)按照“1.6”中缺失第一個(gè)基因的方法進(jìn)行。首先電轉(zhuǎn)化獲得組菌株CF7066(pSHG5C-Flp)自然轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行，然后取1 μg質(zhì)粒pKF-Δapd2和pKFM-Δapd，分別自然轉(zhuǎn)化CF7066(pSHG5C-Flp)。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，待長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子后分別統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化子數(shù)。

1.9 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

使用 Bioscreen 全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)定菌株生長(zhǎng)曲線，野生株和缺失株分別于TSA平板活化三代后取單菌落接種于5 mL TSB培養(yǎng)基，于37 ℃ 200 r·min-1震蕩培養(yǎng)12 h后按1∶100轉(zhuǎn)接于新鮮的TSB培養(yǎng)基。取Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀專(zhuān)用的檢測(cè)板，每孔加入200 μL轉(zhuǎn)接菌液，每30 min測(cè)定菌液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD600nm)，記錄并繪制生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié) 果

2.1 Flp重組酶消除基因組上KanR基因

為了證實(shí)Flp-FRT系統(tǒng)在G.parasuis中是否發(fā)揮作用，本研究用λ噬菌體的可調(diào)控啟動(dòng)子cI857/PRM/PR調(diào)控Flp基因的表達(dá)，構(gòu)建了質(zhì)粒pSHG5C-Flp(圖1a)。然后，用Flp重組酶的表達(dá)質(zhì)粒pSHG5C-Flp電轉(zhuǎn)化CF7066Δapd::KanR，對(duì)長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子用基因apd外側(cè)引物和質(zhì)粒鑒定引物G5C-F/R通過(guò)PCR檢測(cè)。在基因apd外側(cè)引物APD-OUT-F/R的擴(kuò)增13個(gè)菌落中，8個(gè)菌落的基因型為Δapd::KanR(3 041 bp)，5個(gè)菌落的基因型為Δapd(1 535 bp)。而同時(shí)pSHG5C-Flp質(zhì)粒鑒定引物G5C-F/ G5C-R的擴(kuò)增結(jié)果顯示，在8個(gè)基因型為Δapd::KanR的菌落中不存在質(zhì)粒，而在5個(gè)基因型為Δapd的菌落中有質(zhì)粒存在(869 bp)(圖3)。該結(jié)果表明，在質(zhì)粒pSHG5C-Flp得以成功轉(zhuǎn)化的有抗性標(biāo)記的突變株，F(xiàn)lp重組酶表達(dá)并介導(dǎo)了KanR基因的消除，從而獲得了G.parasuis無(wú)抗缺失株。

a. 用Flp酶表達(dá)質(zhì)粒pSHG5C-Flp電轉(zhuǎn)化CF7066后基因型的改變；b.質(zhì)粒pSHG5C-Flp在轉(zhuǎn)化子中的存在a. The genotype change of CF7066 that was ecletrotransformed with pSHG5C-Flp expressing Flp recombinase amplication; b. The existence of pSHG5C-Flp in transformed bacterial cells圖3 Flp重組酶介導(dǎo)的KanR基因消除Fig.3 The KanR gene excision mediated by Flp recombinase

2.2 Flp-FRT系統(tǒng)介導(dǎo)nanH和apd基因連續(xù)敲除

為了能夠進(jìn)行G.parasuis雙基因連續(xù)敲除，首先用表達(dá)Flp酶的溫敏質(zhì)粒pSHG5C-Flp電轉(zhuǎn)化CF7066獲得重組菌CF7066(pSHG5C-Flp)。然后用自殺質(zhì)粒pKF-ΔnanH自然轉(zhuǎn)化重組菌CF7066(pSHG5C-Flp)，獲得的轉(zhuǎn)化子用PCR篩選。結(jié)果表明，所檢測(cè)的22個(gè)轉(zhuǎn)化子中，都出現(xiàn)了有抗性標(biāo)記的缺失基因型ΔnanH::KanR(3 923 bp)，其中18個(gè)中還包含抗性消除的缺失基因型ΔnanH(2 417 bp)， 而且在出現(xiàn)無(wú)抗缺失株的18個(gè)轉(zhuǎn)化子中均檢測(cè)到了Flp酶表達(dá)質(zhì)粒的存在(圖4a)。選擇1#轉(zhuǎn)化子在TSA平板分別于42 ℃和37 ℃/30 ℃上培養(yǎng)。結(jié)果表明，在42 ℃培養(yǎng)的22個(gè)單菌落中，19個(gè)菌落出現(xiàn)了抗性基因消除，但質(zhì)粒pSHG5C-Flp的丟失不一致；而在37 ℃/30 ℃培養(yǎng)的22個(gè)單菌落中，22個(gè)菌落中的抗性基因全部消除，并且質(zhì)粒pSHG5C-Flp全部存在，選擇17#菌株進(jìn)行下一個(gè)基因敲除(圖4b、c)?？梢?jiàn)，CF7066(pSHG5C-Flp)可表達(dá)Flp酶并介導(dǎo)抗性突變株中KanR的消除，同時(shí)也證實(shí)溫敏質(zhì)粒pSHG5C-Flp在37 ℃/30 ℃ 培養(yǎng)可以表達(dá)具有活性的Flp重組酶。

a.用pKF-ΔnanH自然轉(zhuǎn)化CF7066(pSHG5C-Flp)后基因型的改變；b. 42℃培養(yǎng)后抗性消除和質(zhì)粒丟失；c. 37/30 ℃培養(yǎng)后抗性消除和質(zhì)粒丟失a. The genotype change of CF7066(pSHG5C-Flp)transformants following natural transformation with pKF-ΔnanH; b. The resistance cassette excision and plasmid curing following culturation at 42 ℃; c. The resistance cassette excision and plasmid caring following cultaration at 37/30 ℃圖4 缺失株CF7066ΔnanH構(gòu)建Fig.4 The construction of the deletion strain CF7066ΔnanH

接下來(lái)，再用質(zhì)粒pKF-Δapd2自然轉(zhuǎn)化CF7066ΔnanH(pSHG5C-Flp)。結(jié)果顯示，雖然在22個(gè)菌落中均可檢測(cè)到質(zhì)粒pSHG5C-Flp，但僅有3個(gè)菌落出現(xiàn)了有抗性標(biāo)記的apd缺失的基因型，而其余19個(gè)為轉(zhuǎn)化前的基因型(圖5a)。將篩選到的有抗性消除的apd基因缺失株(11#)于42 ℃ 在TSA平板上培養(yǎng)，篩選并獲得到了雙基因缺失株CF7066ΔnanHΔapd(12#)，同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了質(zhì)粒pSHG5C-Flp的消除(圖5b)。以該雙基因缺失株為模板，用nanH和apd基因外側(cè)引物擴(kuò)增目的片段并進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明示nanH和apd均成功敲除，并在缺失的基因座留下了FRT位點(diǎn)(圖5c)。進(jìn)一步，分別使用Apd和抗NanH蛋白的小鼠抗血清進(jìn)行 Western blot檢測(cè)，可見(jiàn)雙基因缺失株中無(wú)兩種蛋白的印跡，而野生型菌株中均有兩種蛋白預(yù)期大小的印跡(圖5d)。上述結(jié)果表明，在CF7066菌株中預(yù)先轉(zhuǎn)化表達(dá)Flp重組酶的溫敏質(zhì)粒pSHG5C-Flp，可以實(shí)現(xiàn)G.parasuis基因組上KanR基因的切除以及雙基因連續(xù)敲除。

2.3 FRT突變位點(diǎn)的篩選

在進(jìn)行nanH和apd基因連續(xù)敲除時(shí)，有抗性標(biāo)記的突變體在第一個(gè)基因敲除時(shí)出現(xiàn)的比率為100%(22/22)(圖4a),而在第二個(gè)基因敲除時(shí)出現(xiàn)的比率僅為13.6%(3/22)(圖5a)?？剐酝蛔凅w在敲除第二個(gè)基因時(shí)的比率大為下降，有可能是質(zhì)粒pSHG5C-Flp在菌體內(nèi)的持續(xù)存在和Flp重組酶持續(xù)表達(dá)的積累，對(duì)自然轉(zhuǎn)化后的自殺質(zhì)粒介導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組，從而減少了抗性缺失突變株的獲得。因此，通過(guò)篩選有點(diǎn)突變FRT的序列，以降低積累的Flp重組酶對(duì)自然轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組的干擾和抗性突變株的獲得。

a. 用pKF-Δapd2自然轉(zhuǎn)化CF7066ΔnanH(pSHG5C-Flp)后基因型的改變；b. 42 ℃培養(yǎng)后抗性消除和質(zhì)粒丟失；c. PCR產(chǎn)物測(cè)序鑒定靶基因的敲除；d. Western blot 檢測(cè)敲除基因蛋白的表達(dá)a. The genotype change of CF7066ΔnanH(pSHG5C-Flp)transformants following natural transformation with pKF-Δapd2; b. The resistance cassette excision and plasmid curing following culturation at 42℃; c. Identification of gene knockout by sequence analysis of PCR products; d. Detection of the protein expression of the knocked-out genes圖5 缺失株CF7066ΔnanHΔapd的構(gòu)建Fig.5 The construction of the deletion strain CF7066ΔnanHΔapd

a. mFRT篩選結(jié)果；b. mFRT測(cè)序結(jié)果(wtFRT.野生型FRT位點(diǎn)；mFRT.突變FRT位點(diǎn))a. The screening results of mFRT; b. The mFRT sequence (wtFRT. Wild type FRT； mFRT. Mutant FRT)圖6 突變FRT位點(diǎn)的篩選Fig.6 Screening of the mutated FRT site

2.4 突變FRT位點(diǎn)提高系統(tǒng)的穩(wěn)定性

首先，將質(zhì)粒pKF-Δapd2的KanR基因上游FRT位點(diǎn)替換為篩選到的突變FRT位點(diǎn)(mFRT)，構(gòu)建質(zhì)粒pKFM-Δapd(圖1c)。然后，用pKFM-Δapd自然轉(zhuǎn)化單基因缺失株CF7066ΔnanH(pSHG5C-Flp)，結(jié)果在22個(gè)菌落中，均可檢測(cè)到質(zhì)粒pSHG5C-Flp的存在并出現(xiàn)了有抗性標(biāo)記的apd基因缺失的基因型(Δapd::KanR)(圖7a)?？梢?jiàn)，單側(cè)突變的mFRT位點(diǎn)有效降低了Flp重組酶的負(fù)效應(yīng)，使有抗性標(biāo)記突變體出現(xiàn)的比率從原來(lái)的13.6%(3/22)(圖5a)提高到100%(22/22)。最后，選擇7#突變體于TSA/Gm平板劃線傳代,并于37 ℃/30 ℃交替培養(yǎng)，22#菌落的抗性表達(dá)盒被切除(圖7b)。以上結(jié)果表明，抗性基因一側(cè)引入突變的mFRT位點(diǎn)，保證了自然轉(zhuǎn)化后同源重組和等位交換的發(fā)生，而提高了該系統(tǒng)的有效性和穩(wěn)定性。此外，用質(zhì)粒pKF-Δapd2和pKFM-Δapd分別轉(zhuǎn)化CF7066(pSHG5C-Flp)進(jìn)行了轉(zhuǎn)化效率的比較。結(jié)果表明，使用具有mFRT位點(diǎn)的質(zhì)粒pFKM-Δapd轉(zhuǎn)化時(shí)，獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)目比未突變時(shí)提高約6倍(圖7c)。

a. 用pKFM-Δapd自然轉(zhuǎn)化CF7066ΔnanH(pSHG5C-Flp)后基因型的改變；b. 37/30 ℃培養(yǎng)后抗性消除和質(zhì)粒丟失；c. 質(zhì)粒pKF-Δapd2和pKFM-Δapd轉(zhuǎn)化效率比較，***代表P<0.001a. The genotype change of CF7066ΔnanH(pSHG5C-Flp) transformants following natural transformation with pKFM-Δapd; b. The resistance cassette excision and plasmid curing following culturation at 37/30 ℃; c. Comparison of the transformation efficiency of plasmid pKF-Δapd2 and pKFM-Δapd，*** represents P<0.001圖7 突變FRT位點(diǎn)的應(yīng)用Fig.7 The employment of mutant FRT site

2.5 nanH、apd基因缺失對(duì)CF7066生長(zhǎng)的影響

比較野生株CF7066和3株缺失株ΔnanH、Δapd、ΔnanHΔapd的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，Δapd缺失株與野生株的生長(zhǎng)曲線并無(wú)顯著差異；而CF7066缺失株ΔnanH和ΔnanHΔapd與其野生型相比，不僅進(jìn)入對(duì)數(shù)期的時(shí)間更晚、穩(wěn)定期的時(shí)間更短，到達(dá)穩(wěn)定期的OD600nm數(shù)值也都低于野生株(圖8)。以上結(jié)果說(shuō)明apd基因的缺失對(duì)G.parasuis生長(zhǎng)速率并無(wú)顯著影響，而nanH基因的缺失顯著降低了生長(zhǎng)效率，并使得菌株更早進(jìn)入衰亡期。因此CF7066唾液酸酶nanH基因的缺失可能導(dǎo)致環(huán)境中唾液酸代謝障礙從而影響CF7066的生長(zhǎng)。

圖8 CF7066野生型和基因缺失株的生長(zhǎng)曲線Fig.8 The growth curves of the CF7066 WT and deletion mutants

3 討 論

G.parasuis遺傳操作工具的缺乏限制了其分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，因此建立一個(gè)穩(wěn)定高效的遺傳操作系統(tǒng)對(duì)其致病機(jī)制、毒力因子等研究具有重要意義。本研究利用λcI857/PRM/PR表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)控制Flp重組酶表達(dá)，隨后自然轉(zhuǎn)化自殺性質(zhì)粒在基因組靶位點(diǎn)引入含有FRT位點(diǎn)的抗性標(biāo)記，通過(guò)Flp重組酶表達(dá)切除抗性基因，實(shí)現(xiàn)了抗性標(biāo)記循環(huán)使用和基因連續(xù)敲除，最后提高溫度消除Flp表達(dá)質(zhì)粒，成功敲除了G.parasuisCF7066的nanH和apd基因。

對(duì)Flp重組酶的表達(dá)質(zhì)粒pSHG5C-Flp而言，F(xiàn)lp的表達(dá)受到λ噬菌體右啟動(dòng)子PR控制和cI857/PRM蛋白的調(diào)控，即該啟動(dòng)子在30 ℃被阻遏，在42 ℃ 被激活[13]。作者計(jì)劃用Flp酶表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化G.parasuis后在30 ℃培養(yǎng)，然后用自殺性質(zhì)粒自然轉(zhuǎn)化后也在30 ℃培養(yǎng)并獲得抗性突變體，因?yàn)樵?0 ℃培養(yǎng)，溫敏質(zhì)?？梢苑€(wěn)定復(fù)制，而且Flp酶沒(méi)有活性。最后，對(duì)自然轉(zhuǎn)化獲得的抗性突變株，在42 ℃培養(yǎng)以誘導(dǎo)Flp酶的表達(dá)進(jìn)而切除抗性基因并且消除質(zhì)粒。然而實(shí)際情況是，由于G.parasuis在30 ℃生長(zhǎng)緩慢，在此溫度下多次自然轉(zhuǎn)化均無(wú)轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出。已有研究報(bào)道突變的λcI857/PRM/PR系統(tǒng)可將調(diào)控表達(dá)的溫度從30 ℃提高至37 ℃[26]。所以在當(dāng)前研究中，為了既調(diào)控Flp重組酶的表達(dá)又不影響自然轉(zhuǎn)化效率，作者將攜帶CF7066(pSHG5C-Flp)在37 ℃/30 ℃交替培養(yǎng)作為受體菌。結(jié)果，在自然轉(zhuǎn)化敲除CF7066的nanH和apd基因時(shí)，初代轉(zhuǎn)化子中竟然出現(xiàn)了無(wú)抗性標(biāo)記缺失突變體，一次性完成了同源重組和抗性消除(圖4、5)。盡管自然轉(zhuǎn)化初代可獲得無(wú)抗缺失突變體令人欣喜，但在敲除第二個(gè)基因時(shí)，自然轉(zhuǎn)化后發(fā)生同源重組的突變體比率明顯下降。所幸的是，通過(guò)構(gòu)建單側(cè)FRT位點(diǎn)突變的質(zhì)粒，有效提高了自然轉(zhuǎn)化后同源重組的發(fā)生和抗性突變體的產(chǎn)生，從而保證了該雙基因敲除系統(tǒng)的有效性和穩(wěn)定性。

G.parasuis中遺傳操作方法比較有限，本研究與Bigas等[8]報(bào)道的遺傳操作系統(tǒng)相比，本方法消除了遺留在基因組上的抗性基因表達(dá)盒，減少了潛在引起的極性效應(yīng)，更有利于對(duì)目的基因的進(jìn)一步研究。另外，Zhang等[10]也報(bào)道了利用反選擇標(biāo)記進(jìn)一步敲除抗性基因的方法，但該方法每敲除一個(gè)基因需要構(gòu)建兩個(gè)質(zhì)粒，而且由于大部分G.parasuis對(duì)蔗糖不敏感、sacB基因本身易于自發(fā)失活而產(chǎn)生假陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，這使得該方法難以在更多的菌株中使用。而本研究所建立的方法，不論在操作的簡(jiǎn)便性和對(duì)轉(zhuǎn)化菌株的普適性上都有所提高，而且還可以進(jìn)行雙基因連續(xù)敲除。

對(duì)G.parasuis而言，廣泛存在的限制修飾系統(tǒng)引起的轉(zhuǎn)化屏障是其遺傳操作困難的原因之一[6-7]。本研究只需要將表達(dá)Flp重組酶的溫敏穿梭質(zhì)粒進(jìn)行一次電轉(zhuǎn)化，就可以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因的連續(xù)敲除，這不僅降低了操作難度也極大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程。進(jìn)一步對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)篩選突變的FRT位點(diǎn)降低Flp重組酶介導(dǎo)的重組效率，雖然在一定程度上降低了自然轉(zhuǎn)化后初代轉(zhuǎn)化子中出現(xiàn)無(wú)抗敲除的效率，但極大提高了系統(tǒng)的穩(wěn)定性。最終獲得了可以用于G.parasuis的無(wú)抗和雙基因連續(xù)敲除的突變系統(tǒng)。

所不足的是，本研究利用Flp-FRT系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)抗性基因的敲除，最終會(huì)在目的基因處留下一個(gè)FRT位點(diǎn)，因此尚難以實(shí)現(xiàn)不留痕跡的基因敲除。另一方面，留下的FRT位點(diǎn)也給連續(xù)的多基因敲除帶來(lái)一定困擾，雖然本研究成功利用Flp-FRT系統(tǒng)構(gòu)建了CF7066的雙基因敲除菌株，這可能是由于基因nanH和apd在基因組上相距較遠(yuǎn)(約913 kb)，如果發(fā)生基因nanH和apd間大DNA片段敲除必然會(huì)導(dǎo)致中間必須基因的失活造成致死性突變。但在敲除兩個(gè)相隔較近的基因時(shí)，F(xiàn)lp-FRT系統(tǒng)的這一缺陷是不得不考慮的問(wèn)題。為了避免這一問(wèn)題的發(fā)生，可以在敲除距離較近的兩個(gè)基因時(shí)分別使用不同的兩組FRT位點(diǎn)，從而消除該系統(tǒng)的這一缺陷[27-28,32]。

4 結(jié) 論

利用Flp-FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，構(gòu)建了副豬嗜血桿菌CF7066雙基因缺失株，建立了針對(duì)副豬嗜血桿菌的無(wú)抗性標(biāo)記的基因缺失系統(tǒng)，為副豬嗜血桿菌基因功能研究、基因工程疫苗研發(fā)提供了有效的工具。