前噬菌體對豬鏈球菌毒力、環(huán)境適應性、耐藥性及代謝活動的影響

韓雪姣，李 亮，占松鶴，段倩倩，崔麗榮，劉雪蘭，孫 裴，魏建忠，李 郁*

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥 230036； 2. 安徽省動物疫病預防與控制中心，合肥 230091)

豬鏈球菌(Streptococcussuis，SS)是世界范圍內(nèi)引起豬鏈球菌病最主要的病原，同時也可造成人類感染并發(fā)病，給食品安全和公共衛(wèi)生帶來威脅。SS的致病機制復雜，眾多毒力因子在SS不同的致病階段發(fā)揮作用，最終導致疾病的發(fā)生。發(fā)病豬臨床表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎或急性死亡等[1]。SS抗原結(jié)構(gòu)復雜，臨床上使用的疫苗交叉保護力較弱。因此在實際生產(chǎn)中使用抗生素是對豬鏈球菌病進行防控的主要手段，這也造成了SS對抗生素的耐藥性日趨增強。此外，形成生物被膜(bacterial biofilms，BF)是細菌或真菌為了適應自然環(huán)境而采取的一種生存方式。相對于BF外的細菌，BF內(nèi)的細菌對抗生素的敏感性要低很多，對于酸有更強的抵抗力且具有更強的抗饑餓能力[2]。已知SS也具有形成BF的能力，BF的形成不可避免地增強了SS對外界環(huán)境的適應性。

噬菌體是能夠感染細菌、放線菌、螺旋體、霉形體以及藍細菌等微生物的病毒，也稱為細菌病毒[3]。整合到細菌DNA上或以質(zhì)粒形式存在的噬菌體基因叫前噬菌體，含有前噬菌體的細菌稱為溶原菌。前噬菌體與細菌性病原的毒力關(guān)系緊密，其編碼多種毒力因子，并對溶原菌的環(huán)境適應性和耐藥性具有一定影響。大腸桿菌O157：H7中由于存在兩個編碼志賀毒素的前噬菌體，而具備了產(chǎn)生志賀毒素的能力[4]。SS分離株SsUD由于整合了攜帶有四環(huán)素耐藥基因的前噬菌體，從而產(chǎn)生了對四環(huán)素的耐藥性[5]。此外，前噬菌體還具有調(diào)節(jié)BF形成的能力。在放線桿菌和糞腸球菌中，相比不含前噬菌體的菌株，前噬菌體存在的菌株具有更強的BF形成能力[6-7]。

本研究前期對199株分離自臨床發(fā)病豬的SS進行了前噬菌體解旋酶基因和末端酶基因的鑒定，鑒定結(jié)果顯示199株SS分離株中前噬菌體陽性菌有39株(解旋酶基因和末端酶基因均為陽性的有31株，解旋酶基因陰性末端酶基因陽性的有7株，解旋酶基因陽性末端酶基因陰性的有1株)，其余160株為前噬菌體陰性菌。為了探究前噬菌體與SS毒力、環(huán)境適應性、耐藥性及代謝活動之間的關(guān)系，本研究以39株前噬菌體陽性菌為試驗菌株，依照單一變量原則，根據(jù)前噬菌體陽性菌的血清型、毒力基因型、多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)結(jié)果和溶血性等背景信息選取7株前噬菌體陰性菌為對照菌株，共計46株SS進行研究。以期為SS 致病機制的研究提供科學依據(jù)，為探究前噬菌體對SS生理活動及遺傳進化的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 受試菌株

39株前噬菌體陽性菌及7株前噬菌體陰性菌均由安徽農(nóng)業(yè)大學動物傳染病實驗室分離鑒定并保存，具體信息見表1。

1.2 質(zhì)控菌株

肺炎鏈球菌標準株ATCC49619，由安徽農(nóng)業(yè)大學動物傳染病實驗室保存。

1.3 實驗動物

體重18～22 g，6～8周齡清潔級雌性昆明小鼠購于安徽醫(yī)科大學動物實驗中心。

1.4 主要試劑

含0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA-YE)、含0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB-YE)、水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(MHA)、MH肉湯培養(yǎng)基購自紹興天恒生物科技有限公司；小牛血清購自上海羽朵生物科技有限公司；SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)和FastKing RT Kit(With gDNase)購自天根生化科技有限公司。

1.5 藥敏紙片和抗生素粉劑

17種抗生素的藥敏紙片和10種抗生素粉劑購于紹興天恒生物科技有限公司。

1.6 致病性試驗

將39株前噬菌體陽性菌和7株前噬菌體陰性菌進行復蘇、培養(yǎng)并調(diào)整菌液濃度為6.3×109CFU·mL-1。 試驗組小鼠腹腔注射菌液(每組5只)， 0.3 mL·只-1。對照組小鼠注射等體積生理鹽水。觀察7 d，記錄小鼠死亡情況。

根據(jù)致病性試驗結(jié)果，篩選出使小鼠死亡率≥80%的菌株，每株菌設(shè)置5個劑量組(108～1010CFU·mL-1)， 各劑量組配置10只小鼠，腹腔注射菌液，0.3 mL·只-1。另取10只小鼠注射等體積生理鹽水，作為陰性對照。攻毒后觀察7 d，采用累積法(Reed-Muench)計算菌株對小鼠的LD50。

1.7 組織荷菌數(shù)測定和組織病理學觀察

根據(jù)LD50測定結(jié)果，結(jié)合分離株的背景信息，選擇4株前噬菌體陽性菌(BB15-4、FY13-4、HF13-21和BZ17-2)和1株前噬菌體陰性菌(BB14-5)進行組織荷菌數(shù)測定和組織病理學觀察。試驗組小鼠腹腔注射SS菌液，濃度為1/5LD50[8-10]，0.3 mL·只-1；陰性對照組注射等體積生理鹽水。攻毒36 h后每組取3只小鼠，采集不同臟器(肺、肝、脾、腎、心和腦)測定組織荷菌數(shù)。操作如下：將臟器置于1.5 mL研磨管中，稱重并記錄，按照一定比例加入滅菌PBS和磁珠，使用全自動研磨儀進行研磨。研磨液10倍遞增稀釋后取稀釋度為100、10-1、10-2的組織懸液均勻涂布于含5%小牛血清的TSA培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計活菌數(shù)；每組另取2只小鼠，采集上述不同臟器常規(guī)制作組織切片，經(jīng)HE染色后觀察病理變化。

1.8 BF形成能力的測定

利用結(jié)晶紫染色法[11-12]測定39株前噬菌體陽性菌和7株前噬菌體陰性菌的BF形成能力。判斷標準：將空白對照組平均OD600 nm值加上其3倍標準差(s)，作為細菌BF形成的臨界值(ODc)，OD600 nm≤ODc判為無BF形成能力(-)，ODc4ODc判為BF形成能力強(3+)。最后根據(jù)測定結(jié)果挑選菌株通過掃描電鏡進行BF形態(tài)觀察。

1.9 藥敏試驗

1.9.1 紙片擴散法(K-B法) 以肺炎鏈球菌ATCC49619為質(zhì)控菌株，根據(jù)美國臨床實驗室標準委員會(CLSI)推薦的K-B紙片法測定39株前噬菌體陽性菌和7株前噬菌體陰性菌對9類17種常見抗生素的敏感性。藥敏試驗結(jié)果參照CLSI(2020)標準和藥敏紙片說明書進行判定。

1.9.2 微量肉湯稀釋法 參照CLSI抗菌藥物敏感性試驗操作標準，采用微量肉湯稀釋法測定4株前噬菌體陽性菌(BB15-4、FY13-4、HF13-21和BZ17-2)和1株前噬菌體陰性菌(BB14-5)對抗菌藥物的MIC并判斷菌株對各種藥物的敏感程度。

1.10 轉(zhuǎn)錄組測序及測序結(jié)果的驗證

對4株前噬菌體陽性菌(BB15-4、FY13-4、HF13-21和BZ17-2)和1株前噬菌體陰性菌(BB14-5)進行培養(yǎng)，并在對數(shù)生長期進行菌體采集，采集的菌體送至基迪奧生物科技有限公司進行RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序。根據(jù)測序結(jié)果對差異表達基因進行分析,并隨機選取部分差異表達基因設(shè)計引物，見表2。以16S rRNA為內(nèi)參基因，采用SYBR Green I法進行mRNA表達量分析，每個基因做3次重復，數(shù)據(jù)采用2-△△Ct處理。

表2 qPCR引物序列

1.11 數(shù)據(jù)處理

本試驗所有數(shù)據(jù)的差異性統(tǒng)計均采用SPSS 20.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)繪圖均使采用Graphpad.7.0軟件進行繪制。

2 結(jié) 果

2.1 致病性試驗

前噬菌體陽性菌和陰性菌攻毒后，發(fā)病小鼠均表現(xiàn)出食欲不振、扎堆聚集、被毛粗亂、眼分泌物增多的癥狀，部分發(fā)病小鼠除出現(xiàn)上述臨床癥狀外，還在攻毒3 d左右出現(xiàn)神經(jīng)癥狀(轉(zhuǎn)圈，共濟失調(diào))。對死亡的小鼠進行剖檢，可見大腦充血；肺出現(xiàn)出血點，腫大；肝明顯淤血，質(zhì)地易碎；脾腫大，邊緣鈍圓，有明顯淤血；腎充血腫大?？瞻讓φ战M小鼠剖檢無異常變化。39株前噬菌體陽性菌中對小鼠致死率為100%的有4株，占比10.2%；致死率為80%的有7株，占比17.9%；致死率≤60%的有28株，占比71.9%。7株前噬菌體陰性菌中對小鼠致死率為100%的有1株，占比14.3%；致死率為80%的有1株， 占比14.3%；致死率≤60%的有5株，占比71.4%。

選取使小鼠死亡率≥80%的11株前噬菌體陽性菌和2株前噬菌體陰性菌測定LD50。前噬菌體陽性菌BB15-4、HF10-1、HF13-24、FY13-4、HF13-32、LA16-2、HF09-2、HF13-21、BZ17-2、XC14-1和BZ10-3的LD50分別為8.4×108、1.07×109、1.53×109、1.56×109、1.66×109、1.76×109、1.81×109、1.84×109、2.09×109、2.24×109、和2.36×109CFU·只-1。前噬菌體陰性菌HF13-16和BB14-5的LD50分別為1.88×109和2.72×109CFU·只-1。統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示，前噬菌體陽性菌和陰性菌之間LD50差異不顯著(P>0.05)。

2.2 組織荷菌數(shù)測定及病理切片觀察

2.2.1 組織荷菌數(shù)測定 結(jié)果見表3。BB15-4(LD50為8.4×108CFU·只-1)攻毒組小鼠肺、肝、心中的載菌量顯著高于其余4株攻毒組(P<0.05)；BB15-4和FY13-4(LD50為1.56×109CFU·只-1)攻毒組小鼠腦組織中的載菌量均顯著高于其余3株攻毒組(P<0.05)；雖然BB15-4、FY13-4和HF13-21(LD50為1.84×109CFU·只-1)攻毒組在小鼠脾中的載菌量差異不顯著(P>0.05)，但BB15-4攻毒組的載菌量顯著高于BZ17-2(LD50為2.09×109CFU·只-1)和BB14-5(LD50為2.72×109CFU·只-1)攻毒組(P<0.05)。

表3 組織荷菌數(shù)測定結(jié)果

2.2.2 病理變化 BB15-4攻毒后小鼠心肌纖維壞死，空泡變性；肝細胞固縮壞死；脾組織白髓區(qū)淋巴細胞稀疏，脾小結(jié)萎縮；肺泡壁增厚，輕微實質(zhì)化；腎間質(zhì)血管充血擴張；腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元排列稀疏紊亂；心、肝、脾、腎和腦組織均可見炎癥細胞浸潤。詳見圖1。FY13-4攻毒后小鼠心肌纖維間隙增寬；脾組織白髓區(qū)淋巴細胞稀疏；肺組織可見支氣管淋巴結(jié)細胞；腎小球明顯萎縮，腎小管上皮細胞輕微疏松水腫；心、肝、脾和腦組織均可見炎癥細胞浸潤。詳見圖2。HF13-21攻毒后小鼠肝細胞水腫；少量腎小球明顯萎縮；心、肝、脾和腎組織均可見炎癥細胞浸潤；肺和腦組織基本正常。詳見圖3。BZ17-2攻毒后小鼠心肌纖維間質(zhì)充血擴張；肝細胞輕微水腫；脾小結(jié)萎縮；腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元排列稀疏；肝、脾和腎組織均可見炎癥細胞浸潤；肺組織基本正常。詳見圖4。BB14-5攻毒后小鼠心肌組織僅心肌纖維間隙增寬；肝細胞輕微水腫；腦組織血管輕微充血擴張；脾和腎組織少量炎癥細胞浸潤；肺組織基本正常。詳見圖5。陰性對照組小鼠各臟器結(jié)構(gòu)正常，詳見圖6。

A.心；B.肝；C.脾；D.肺；E.腎；F.腦。下同A. Heart; B. Liver; C. Spleen; D. Lung; E. Kidney; F. Brain. The same as below圖1 BB15-4組小鼠組織病理變化(HE染色，200×)Fig.1 Histopathological changes of mice in BB15-4 group (HE staining, 200×)

圖2 FY13-4組小鼠組織病理變化(HE染色，200×)Fig.2 Histopathological changes of mice in FY13-4 group (HE staining, 200×)

圖3 HF13-21組小鼠組織病理變化(HE染色，200×)Fig.3 Histopathological changes of mice in HF13-21 group (HE staining, 200×)

圖4 BZ17-2組小鼠組織病理變化(HE染色，200×)Fig.4 Histopathological changes of mice in BZ17-2 group (HE staining, 200×)

圖5 BB14-5組小鼠組織病理變化(HE染色，200×)Fig.5 Histopathological changes of mice in BB14-5 group (HE staining, 200×)

圖6 陰性對照組小鼠組織病理變化(HE染色，200×)Fig.6 Histopathological changes of mice in negative control group (HE staining, 200×)

2.3 BF形成能力的測定結(jié)果

39株前噬菌體陽性菌BF形成陽性率為97.4%(38/39)，其中，成膜力強(3+)的15株，占比38.4%；成膜力中等(2+)的14株，占比35.8%；成膜力弱(1+)的9株，占比23.0%；陰性(-)的1株，占比2.5%。7株前噬菌體陰性菌BF形成陽性率為100%，其中成膜力強(3+)的5株，占比71.4%；成膜力中等(2+)的株2株，占比28.5%。選取成膜力強(3+)的HF13-11和陰性(-)的HN16-1，通過掃描電鏡進行BF形態(tài)觀察，見圖7。HF13-11(3+)為球型，菌體周圍充滿黏液等分泌物并將其相互粘連，形成致密的立體結(jié)構(gòu)，幾乎覆蓋整個爬片。HN16-1(-)呈橢圓形，菌體周圍無黏液等分泌物存在，密度小，在爬片上呈短鏈或散在分布。

A. HF13-11 (3+); B. HN16-1 (-)圖7 掃描電鏡下SS的BF(6 000×)Fig.7 SS biofilm under scanning electron microscope(6 000×)

2.4 藥敏試驗

K-B法結(jié)果顯示，39株前噬菌體陽性菌和7株前噬菌體陰性菌對萬古霉素、頭孢吡肟、氨芐西林的敏感率均高，其次為氧氟沙星；對四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、阿奇霉素的耐藥率均高，其次為頭孢曲松和多西環(huán)素，見表4。

表4 藥敏試驗結(jié)果(K-B法)

微量肉湯稀釋法測定10種抗生素對前噬菌體陽性菌BB15-4、FY13-4、HF13-21、BZ17-2和前噬菌體陰性菌BB14-5的MIC，與K-B法的結(jié)果整體一致?？咕幬锏腗IC值及菌株的敏感性統(tǒng)計結(jié)果見表5。

表5 抗菌藥物的MIC值及菌株敏感性統(tǒng)計表

前噬菌體陽性菌和陰性菌的多重耐藥情況統(tǒng)計見表6。39株前噬菌體陽性菌中92.3%呈現(xiàn)多重耐藥，其中3重耐藥13株，占比33.3%；4重耐藥4株，占比10.3%；5重耐藥8株，占比20.5%；6重耐藥7株，占比17.9%；7重耐藥4株，占比10.3%。7株前噬菌體陰性菌均為多重耐藥，其中3、4、6和8重耐藥各1株，均占比14.3%；5重耐藥3株，占比42.8%。統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示，前噬菌體陽性菌與陰性菌之間在耐藥性方面無顯著差異(P>0.05)。

表6 前噬菌體陽性菌和前噬菌體陰性菌耐藥情況統(tǒng)計表

2.5 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果及測序結(jié)果的驗證

2.5.1 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果 將5株SS株(BB15-4、FY13-4、HF13-21、BZ17-2、BB14-5)分為3個比較組進行差異表達基因分析。比較組AvsC中，A組為前噬菌體陽性組，由前噬菌體解旋酶和末端酶基因均為陽性的BB15-4、FY13-4、BZ17-2和僅前噬菌體末端酶基因為陽性的HF13-21組成；C組為前噬菌體陰性組，由前噬菌體解旋酶和末端酶基因均為陰性的BB14-5組成。比較組A1vsC1中，A1組由前噬菌體解旋酶基因和末端酶基因均為陽性的BB15-4、FY13-4和BZ17-2組成；C1組由前噬菌體解旋酶和末端酶基因均為陰性的BB14-5組成。比較組HF13-21vsBB14-5中，HF13-21為前噬菌體解旋酶基因陰性末端酶基因陽性的SS分離株，BB14-5為前噬菌體解旋酶和末端酶基因均為陰性的SS分離株。

比較組AvsC中共有930個基因發(fā)生差異表達，見圖8。從中篩選出18個毒力相關(guān)基因、4個BF形成相關(guān)基因、5個耐藥基因。相較于A組，C組中毒力相關(guān)基因purD、SSUBM407_0143、copA、tpx、pepT、fhs、neuC、cpsE、cpsB、msmK和gtfA為上調(diào)表達，divIVA、ppc、ldh、nox、sodA、oatA和tig為下調(diào)表達；BF形成相關(guān)基因SSUBM407_1279和SSUBM407_1791為上調(diào)表達，SSUBM407_0297 和SSUBM407_0343為下調(diào)表達；耐藥基因tetO、bcrA、parC、parE和SSUBM407_0293 均為上調(diào)表達。

比較組A1vsC1中共有951個基因發(fā)生差異表達，見圖8。從中篩選出19個毒力相關(guān)基因、5個BF形成相關(guān)基因、5個耐藥基因。相較于A1組，C1組中毒力相關(guān)基因purD、SSUBM407_0143、copA、tpx、pepT、fhs、neuC、cpsE、cpsB、msmK和gtfA為上調(diào)表達，divIVA、ldh、nox、sodA、tig、spxA2、fba和codY為下調(diào)表達；BF形成相關(guān)基因SSUBM407_1279、SSUBM407_1342和SSUBM407_1791為上調(diào)表達，SSUBM407_0297和SSUBM407_0343為下調(diào)表達；耐藥基因tetO、bcrA、parC、parE和SSUBM407_0293均為上調(diào)表達。

比較組HF13-21vsBB14-5中共有1 151個基因發(fā)生差異表達，見圖8。從中篩選出19個毒力相關(guān)基因、5個BF形成相關(guān)基因、6個耐藥基因。相較于HF13-21，BB14-5中毒力相關(guān)基因purD、SSUBM407_0143、copA、tpx、pepT、fhs、neuC、codY、cpsE、cpsB、msmK、tig和gtfA為上調(diào)表達，ldh、ppc、nox、fba、feoB和gdh為下調(diào)表達；BF形成相關(guān)基因SSUBM407_0908、SSUBM407_1279和SSUBM407_1791為上調(diào)表達，SSUBM407_1342和SSUBM407_1520為下調(diào)表達；耐藥基因tetO、bcrA、parC、parE和SSUBM407_0293為上調(diào)表達，pmrA為下調(diào)表達。

圖8 差異基因統(tǒng)計柱狀圖Fig.8 Statistical histogram of differential genes

此外，3個比較組的測序結(jié)果均顯示相較于前噬菌體陽性菌，脂肪酸生物合成通路中所涉及到的相關(guān)基因SSUBM407_1477、SSUBM407_1676、SSUBM407_1680、SSUBM407_1672、SSUBM407_1670、SSUBM407_1671、SSUBM407_1674、SSUBM407以及精氨酸和脯氨酸代謝通路中所涉及到的相關(guān)基因SSUBM407_1304、SSUBM407_1303、SSUBM407_0427、SSUBM407_0274在前噬菌體陰性菌中均為上調(diào)表達。

2.5.2 qPCR驗證 為驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性，本研究以16S rRNA為內(nèi)參基因，隨機選取差異表達基因，進行qPCR檢測,見圖9。試驗結(jié)果顯示,隨機篩選出的差異表達基因在qPCR和轉(zhuǎn)錄組測序中變化趨勢基本一致，表明測序結(jié)果真實可靠。

3 討 論

前噬菌體與細菌病原體的毒力關(guān)系緊密，許多病原菌的毒力因子都是由前噬菌體編碼的。在霍亂弧菌中引起嚴重腹瀉的霍亂毒素即由前噬菌體中的ctxAB基因編碼[13]。本研究針對39株SS前噬菌體陽性菌及7株前噬菌體陰性菌，通過致病性試驗篩選出11株前噬菌體陽性菌和2株前噬菌體陰性菌，對小鼠的LD50測定結(jié)果之間沒有顯著差異(P>0.05)。以此為基礎(chǔ)，選擇4株前噬菌體陽性菌(BB15-4、FY13-4、HF13-21、BZ17-2)和1株前噬菌體陰性菌(BB14-5)進行組織荷菌數(shù)測定及病理組織學觀察，其LD50值由小到大依次為BB15-4

細菌為了適應周圍環(huán)境會吸附于異物或組織表面，分泌大量的胞外聚合物形成BF，從而具有抵御不良環(huán)境和抗菌藥物的能力。在放線桿菌和糞腸球菌中前噬菌體可以通過調(diào)節(jié)BF的形成，來增強細菌對不良環(huán)境的抵抗力[6-7]。Wang等[14]對大腸桿菌K-12的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，前噬菌體e14可以促進宿主菌早期BF的形成。而杜寶中等[15]的研究結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌中的前噬菌體可通過降低該菌中藻酸鹽合成相關(guān)基因的表達，從而影響B(tài)F的形成。本研究結(jié)果表明，39株前噬菌體陽性菌BF形成陽性率為97.4%，7株前噬菌體陰性菌BF形成陽性率為100.0%。39株前噬菌體陽性菌中23.0%的成膜力弱(1+)，而7株前噬菌體陰性菌均具備強(3+) 或中等(2+)的成膜能力。結(jié)果表明前噬菌體的存在與否與SS能否形成BF以及成膜能力之間沒有呈現(xiàn)出相關(guān)性。

前噬菌體是細菌間基因水平轉(zhuǎn)移的重要載體，Matos等[16]的研究表明,前噬菌體誘導的基因整合事件使白喉棒狀桿菌獲得對自身進化有用的DNA序列，增強了白喉棒狀桿菌的致病性和耐藥性；糞腸球菌致病株V583基因組中的多個前噬菌體對該菌的致病性和耐藥性有重要貢獻，促進了V583對環(huán)境的適應性并導致了人類心內(nèi)膜炎。彭子欣等[17]的研究表明前噬菌體Prophage-p存在于希拉腸球菌R17的質(zhì)粒中，并攜帶有紅霉素和桿菌肽耐藥基因，對R17向耐藥菌的進化發(fā)揮了重要作用。本研究的39株前噬菌體陽性菌中92.3%呈現(xiàn)多重耐藥，而7株前噬菌體陰性菌均為多重耐藥。前噬菌體陰性菌均可耐受3種及以上的抗生素，而前噬菌體陽性菌中存在僅耐受1種和2種抗生素的菌株。從表型上看，前噬菌體陰性菌比前噬菌體陽性菌更具有耐藥性，但統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示，兩者之間在耐藥性方面沒有顯著差異(P>0.05)。

為進一步了解前噬菌體陽性菌和陰性菌間相關(guān)基因的表達差異，本研究對4株前噬菌體陽性菌和1株前噬菌體陰性菌進行了轉(zhuǎn)錄組測序。3個比較組的測序結(jié)果均表明，相較于前噬菌體陽性菌，毒力相關(guān)基因purD、SSUBM407_0143、copA、tpx、pepT、fhs、neuC、cpsE、cpsB、msmK和gtfA在前噬菌體陰性菌中均為上調(diào)表達；BF形成相關(guān)基因SSUBM407_1279和SSUBM407_1791、耐藥基因tetO、bcrA、parC、parE和SSUBM407_0293在前噬菌體陰性菌中均為上調(diào)表達。此外，脂肪酸生物合成通路中所涉及到的相關(guān)基因以及精氨酸和脯氨酸代謝通路中所涉及到的相關(guān)基因在前噬菌體陰性菌中同樣均為上調(diào)表達，這表明前噬菌體陰性菌具有更高的脂肪酸和氨基酸代謝水平。脂肪酸的生物合成是生命體重要的基礎(chǔ)代謝途徑，對于磷脂合成、細胞膜組裝、細胞信號轉(zhuǎn)導、能量儲存和基因表達調(diào)控必不可少，抑制脂肪酸的生物合成將導致細菌生長及繁殖的停滯。氨基酸作為微生物生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，參與胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生、蛋白質(zhì)和許多生物活性分子的合成，調(diào)節(jié)體內(nèi)信號通路和機體代謝。由此可見，前噬菌體的存在會影響SS的生理代謝，具體表現(xiàn)為脂肪酸和氨基酸代謝水平的下降。關(guān)于前噬菌體的存在對宿主菌相關(guān)基因及其代謝的影響研究報道有限，Veses-Garcia等[18]在大腸桿菌研究中通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，stx前噬菌體使宿主菌中與三羧酸循環(huán)和細菌有氧呼吸過程相關(guān)的基因下調(diào)表達，從而使宿主菌丙酮酸和能量代謝受到抑制。目前針對SS的研究則側(cè)重于噬菌體對細菌的裂解作用，而基于轉(zhuǎn)錄組學探究前噬菌體與SS毒力、環(huán)境適應性、耐藥性以及代謝活動之間的關(guān)系尚未見報道。

作為外源DNA，前噬菌體的插入給細菌帶來了額外的代謝負擔；同時功能性前噬菌體一旦受到特定因素的誘導，就會使細菌面臨被裂解死亡的危險。因此，前噬菌體需要具有一些選擇價值，才能在細菌基因組中被更好的保留下來，這些選擇價值包括細菌基因組中前噬菌體的存在，可以阻礙其他噬菌體對細菌的感染，使細菌產(chǎn)生對噬菌體的免疫；提高細菌對不良環(huán)境的適應性或增強其毒力。本研究試驗結(jié)果表明，前噬菌體的存在并沒有給SS提供毒力、耐藥性和形成BF等方面的優(yōu)勢，這并不能說明在SS中，前噬菌體只具有阻礙其他噬菌體感染，使SS產(chǎn)生對噬菌體的免疫這一個選擇優(yōu)勢。因為本研究是對前噬菌體陽性菌株及前噬菌體陰性菌株進行分析，并不針對某一株SS或某一個SS前噬菌體。在對SS前噬菌體進行研究的過程中，Harel等[19]發(fā)現(xiàn)許多SS強毒株特有的基因與前噬菌體中的一些基因存在同源性；Palmieri等[5]發(fā)現(xiàn)一個攜帶有四環(huán)素耐藥基因的前噬菌體樣元件，導致了SS分離株SsUD對四環(huán)素產(chǎn)生耐藥性；杜德超[20]發(fā)現(xiàn)SS弱毒株中擁有更多的前噬菌體序列，并提出前噬菌體序列的插入將會阻礙SS原有致病性元件發(fā)揮正常功能；虞莉等[21]通過檢測前噬菌體在101株SS2中的分布，發(fā)現(xiàn)前噬菌體與SS代表性毒力因子的分布沒有明顯相關(guān)性?；诒狙芯康慕Y(jié)果結(jié)合SS中有關(guān)前噬菌體的報道，作者發(fā)現(xiàn)在SS中，前噬菌體的存在不是判斷菌株毒力強弱的標準，那些序列中存在毒力基因或耐藥基因的前噬菌體整合到SS基因組后可以增強SS的毒力或耐藥性，但并非所有的前噬菌體序列中都存在這些毒力相關(guān)基因或耐藥基因，所以并非所有的前噬菌體都可以增強SS的毒力或耐藥性。在環(huán)境適應性方面，本研究結(jié)果僅表明前噬菌體不通過促進SS形成BF這種方式提高SS對不良環(huán)境的抵抗力。至于前噬菌體是否可以通過提高SS對酸、堿和低溫等不良因素的抗性，進而促進SS對環(huán)境的適應性，還需進一步研究。

4 結(jié) 論

前噬菌體存在與否與SS的毒力增強或減弱、耐藥性的高或低以及BF的形成能力之間未有明顯相關(guān)性；前噬菌體的存在會引致與SS脂肪酸生物合成以及精氨酸和脯氨酸代謝過程中相關(guān)聯(lián)基因的表達下調(diào)，從而造成脂肪酸和氨基酸代謝水平降低。