1株感染多種致病性大腸桿菌噬菌體的生物學(xué)特性研究

林 焱，羅潤(rùn)波，劉燕坤，朱偉云*

(1.國(guó)家動(dòng)物消化道營(yíng)養(yǎng)國(guó)際聯(lián)合研究中心，江蘇省消化道營(yíng)養(yǎng)與動(dòng)物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物研究室，南京 210095； 2.西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，林芝 860000)

仔豬腹瀉可導(dǎo)致仔豬發(fā)病率、死亡率提高，生長(zhǎng)速度減緩等，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大損失。細(xì)菌感染，尤其是致病性大腸桿菌(Escherichiacoli)感染，是引起仔豬腹瀉的主要原因之一[1]。我國(guó)已于2020年7月正式實(shí)施飼料禁抗，細(xì)菌性的腹瀉成為禁抗后最核心的問題，開發(fā)新型高效綠色的“替抗產(chǎn)品”成為畜牧業(yè)關(guān)注焦點(diǎn)。噬菌體作為一種可殺死細(xì)菌卻對(duì)真核細(xì)胞無害的病毒，被認(rèn)為是具有較好前景的抗生素替代品[2-4]。根據(jù)噬菌體對(duì)宿主菌的裂解效應(yīng)不同，將噬菌體分為烈性噬菌體和溶原性噬菌體[5]。烈性噬菌體可直接裂解宿主菌導(dǎo)致其死亡，而溶原性噬菌體大多數(shù)情況下會(huì)將其基因組整合到宿主菌的染色體上,并隨著宿主基因組的復(fù)制而復(fù)制，通常情況下并不裂解宿主菌[6]，因此臨床上僅用烈性噬菌體治療細(xì)菌性感染。噬菌體的宿主譜是決定其治療效果的重要因素[7]，然而1株噬菌體在感染不同細(xì)菌時(shí)感染能力可能存在差異[8-9]，僅測(cè)定宿主譜并不能全面說明噬菌體的應(yīng)用潛力，需明確噬菌體在各株菌上的感染特性，才能更好地將噬菌體應(yīng)用于治療。本研究測(cè)定了此前從斷奶前仔豬糞樣中分離得到的1株大腸桿菌噬菌體C6在致病性大腸桿菌上的宿主譜，并比較了該噬菌體在不同致病菌上的感染特性，為進(jìn)一步開發(fā)噬菌體作為新型抗菌劑提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 噬菌體及菌株來源

試驗(yàn)所用噬菌體為本實(shí)驗(yàn)室此前在1頭健康仔豬斷奶前期的糞樣中分離得到的1株大腸桿菌噬菌體C6。

用于噬菌體宿主譜測(cè)定和感染特性分析的大腸桿菌菌株均為本實(shí)驗(yàn)室此前從豬糞中分離得到的90株大腸桿菌(限于篇幅，請(qǐng)到OSID開放科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容查看詳細(xì)信息)，其中包括1株非致病性大腸桿菌(E.coli22)，6株產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC 101、ETEC 102、ETEC 103、ETEC 104、ETEC 105和ETEC 106)，1株大腸桿菌O157(E.coliW1)，和2株 血清型為O157:H7的產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(STEC W3、STEC W5)，2株腸道致病性大腸桿菌(EPEC 143、EPEC 162)。菌株具體信息見表1。噬菌體C6是以E.coli22為宿主菌分離得到。

1.2 噬菌體電鏡形態(tài)觀察

雙層平板法擴(kuò)增噬菌體后用10 mL SM液將平板上的噬菌體洗脫下，用0.22 μm濾器過濾除菌后，加入100 ku超濾管中,4 ℃，4 800g離心20 min，濃縮噬菌體液至500 μL，滴度為1010～1011pfu·mL-1。將噬菌體濃縮液滴在銅網(wǎng)上，作用15 min，從側(cè)面用濾紙吸干多余液體，加1滴2%磷鎢酸(PTA，pH7.2)于銅網(wǎng)，然后置于干燥濾紙上，自然干燥后，進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.3 基因組提取、全基因組測(cè)序和分析

首先按“1.2”介紹方法濃縮噬菌體至500 μL，加入DNase I 和RNaseA(購(gòu)自TaKaRa，大連寶生物)至終濃度為1 μg·mL-1，37 ℃作用1 h。接著加入EDTA 至終濃度為20 mol·L-1，80 ℃作用8 min。然后參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》提取噬菌體基因組[10]，最后將基因組送至上海凌恩生物科技有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序，測(cè)序結(jié)果上傳至GenBank。

1.4 噬菌體熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性測(cè)定

取1 mL的效價(jià)為107pfu·mL-1的噬菌體，分別放置在30～70 ℃的水浴鍋中恒溫作用1 h，樣品水浴完成后迅速取出放置在冰塊中冷卻，使用雙層平板法測(cè)定不同溫度處理后的樣品中噬菌體效價(jià)。

取100 μL效價(jià)為108pfu·mL-1的噬菌體分別與900 μL的pH為2～13的SM緩沖液均勻混合，后置于37 ℃ 中恒溫水浴2 h，使用雙層平板法測(cè)定不同pH處理后的樣品中噬菌體效價(jià)。

1.5 噬菌體宿主譜測(cè)定

結(jié)合點(diǎn)滴法和雙層平板法測(cè)定噬菌體C6在90株 大腸桿菌上的宿主譜。點(diǎn)滴法：用無菌棉簽沾取處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌后均勻涂布于LB平板上，待干后，取5 μL噬菌體液滴在平板上，37 ℃孵育6 h后，若菌苔上出現(xiàn)透亮的空斑則判定噬菌體可裂解該菌。雙層平板法：以點(diǎn)滴檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的菌作為宿主菌，用雙層平板法觀察成斑情況，出現(xiàn)噬菌斑的菌即視為可被裂解感染的細(xì)菌。同時(shí)觀察噬菌體C6在不同株菌上噬菌斑的形態(tài)。

1.6 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定

將噬菌體以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)102∶1、10∶1、1、1∶10、1∶102、1∶103、1∶104、 1∶105分別接種至處于對(duì)數(shù)期的各株大腸桿菌中，37 ℃培養(yǎng)4.5 h，得到噬菌體效價(jià)最高的MOI即為最佳MOI。

1.7 噬菌體成斑率測(cè)定

參照文獻(xiàn)[11]介紹的方法，以相同量噬菌體分別與各株大腸桿菌鋪雙層平板后統(tǒng)計(jì)噬菌斑數(shù)量，以在E.coli22上出現(xiàn)斑的數(shù)量為1，計(jì)算噬菌體在各株致病性大腸桿菌上的成斑率(efficiency of plating, EOP)。

1.8 噬菌體吸附率測(cè)定

將噬菌體分別與各株大腸桿菌以MOI=10-1接種于液體LB中，37 ℃孵育10 min后，4 000g離心5 min，棄上清，用液體LB重懸菌體后，測(cè)噬菌體數(shù)量。重懸后測(cè)得的噬菌體數(shù)量/初始接進(jìn)去的噬菌體數(shù)量即為噬菌體吸附率。

1.9 噬菌體生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將噬菌體分別與各株大腸桿菌以MOI=1或MOI=10-2接種于液體LB中，其中菌的接種量均為107cfu·mL-1，噬菌體的接種量為107或105pfu·mL-1。 37 ℃孵育15 min后，4 000g離心5 min， 棄上清，用液體LB重懸菌體后置于37 ℃震蕩培養(yǎng)5 h，每小時(shí)取樣檢測(cè)噬菌體滴度，以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，以噬菌體滴度的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線。

1.10 噬菌體抑菌曲線測(cè)定

將噬菌體分別與各株致病性大腸桿菌以MOI= 10-4～102接種于液體LB后置于37 ℃震蕩培養(yǎng)6 h，每小時(shí)檢測(cè)共孵育液在600 nm處的吸光值(OD600 nm)。同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組，僅接種致病菌菌，每小時(shí)檢測(cè)OD600 nm。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600 nm為縱坐標(biāo)，繪制噬菌體在各株致病性大腸桿菌上的抑菌曲線。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體C6分類鑒定

電鏡結(jié)果(圖1A)顯示噬菌體C6為肌尾噬菌體，由頭部、頸部和尾部3部分組成，其頭部呈正二十面體形，長(zhǎng)約95 nm，具有T4樣噬菌體形態(tài)特征。測(cè)序結(jié)果顯示噬菌體C6基因組全長(zhǎng)169 529 bp，測(cè)序結(jié)果上傳至NCBI，登錄號(hào)為MW679410。比對(duì)結(jié)果顯示，與C6同源性高的噬菌體均為T4樣噬菌體。基因組上無基因比對(duì)到細(xì)菌基因組上，且其基因組注釋顯示無整合酶基因，故判定為烈性噬菌體。根據(jù)形態(tài)觀察并結(jié)合基因測(cè)序結(jié)果可推斷噬菌體C6屬于T4樣噬菌體屬。

2.2 噬菌體C6熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性

熱穩(wěn)定性結(jié)果顯示噬菌體C6在溫度為30～50 ℃時(shí)相對(duì)穩(wěn)定；60 ℃時(shí)噬菌體開始出現(xiàn)死亡，70 ℃時(shí)噬 菌體無法存活(圖1B)。

pH穩(wěn)定性結(jié)果顯示噬菌體C6在pH為4～11時(shí)相對(duì)穩(wěn)定，在pH為3的酸環(huán)境或pH為12的堿性環(huán)境開始出現(xiàn)死亡，到pH為2或pH為13的條件時(shí)，噬菌體無法存活(圖1C)。

2.3 噬菌體C6宿主譜

作者選取實(shí)驗(yàn)室此前保存的90株大腸桿菌用于噬菌體C6宿主譜檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，點(diǎn)滴法得到的宿主譜要廣于平板法(表1)。噬菌體C6可感染1株非致病性大腸桿菌(E.coli22)和4株致病性大腸桿菌，包括大腸桿菌O157(E.coliW1)、2株產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(STEC W3、STEC W5)和1株腸致病性大腸桿菌(EPEC 143)。

A.電鏡形態(tài)；B.熱穩(wěn)定性；C.酸堿穩(wěn)定性A. Electronmicrograph; B. Thermal stability; C. pH stability圖1 噬菌體C6的電鏡形態(tài)和穩(wěn)定性Fig.1 Electronmicrograph and stability of phage C6

2.4 噬菌體C6感染特性

噬菌斑結(jié)果(圖2A～E)顯示,噬菌體C6在E.coli22和E.coliW1上的噬菌斑均透亮，直徑為0.5～1.0 mm；在EPEC 143上的噬菌斑也較透亮，但直徑≤0.5 mm；在STEC W3和STEC W5上的噬菌斑則較淡，且均為針尖般大小，比較二者，C6在STEC W3上的噬菌斑更清晰一些。

最佳MOI結(jié)果顯示(表2)，噬菌體C6在E.coli22上的最佳MOI為10-3，在EPEC143、STEC W3 和STEC W5上的最佳MOI均需≥100。

成斑率EOP結(jié)果顯示(表2)，噬菌體C6在STEC W3、STEC W5和 EPEC 143 3株菌間的成斑率均存在顯著差異(P<0.05)，且均顯著低于在E.coli22和E.coliW1上的成斑率(P<0.05)。C6在STEC W5上的成斑率最低，低至10-7。成斑率結(jié)果與噬菌斑大小呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

吸附率結(jié)果顯示(表2)，噬菌體C6在E.coli22和E.coliW1兩株菌間的吸附率存在顯著差異，且均顯著高于在STEC W3、STEC W5和 EPEC 143 3株菌上的吸附率。吸附率結(jié)果與最佳MOI呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

表2 大腸桿菌噬菌體C6在各株菌上的感染特性

根據(jù)最佳MOI的結(jié)果，作者選擇了在MOI=10-2(噬菌體接種量為105pfu·mL-1)時(shí)測(cè)噬菌體C6在E.coli22和E.coliW1上的生長(zhǎng)曲線(圖3A)，以及在MOI=1(噬菌體接種量為107pfu·mL-1)時(shí)測(cè)C6在STEC W3、STEC W5和 EPEC 143上的生長(zhǎng)曲線(圖2B)。比較生長(zhǎng)曲線上0時(shí)的噬菌體滴度可以發(fā)現(xiàn)雖然噬菌體初始接種量在STEC W3、STEC W5和 EPEC 143比在E.coli22和E.coliW1上高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，但所測(cè)得的滴度仍較低，說明噬菌體吸附到E.coli22和E.coliW1的能力更強(qiáng)，這與吸附率結(jié)果一致。比較5 h后的噬菌體最終滴度，噬菌體在E.coli22和E.coliW1復(fù)制得到的子代滴度可達(dá)到109～1011pfu·mL-1，顯著高于在STEC W3、STEC W5和 EPEC 143上的子代滴度(107～109pfu·mL-1)。進(jìn)一步比較噬菌體在E.coli22和E.coliW1上的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)雖然噬菌體在E.coliW1上初始吸附的噬菌體少，但是5 h后，噬菌體在E.coliW1復(fù)制得到的子代噬菌體數(shù)量更多。比較噬菌體在STEC W3、STEC W5和 EPEC 143上的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)C6在STEC W3產(chǎn)生最終子代噬菌體的滴度最高，在STEC W5上的生長(zhǎng)速度最慢。

根據(jù)以上各項(xiàng)感染特性指標(biāo)的結(jié)果，選擇MOI= 10-1～10-5測(cè)定了噬菌體C6在E.coliW1上的抑菌效力，選擇MOI=1～102測(cè)定了噬菌體C6在STEC W3、STEC W5和 EPEC 143上的抑菌效力。

所標(biāo)字母相異代表各處理組差異顯著(P<0.05)，字母相同代表各處理組差異不顯著(P≥0.05)Different letters denotes significant difference between the treatments(P<0.05), same letter denotes not significant difference between treatments(P≥0.05)圖3 噬菌體C6在各株菌上的生長(zhǎng)曲線Fig.3 One-step growth curve of phage C6

結(jié)果顯示(圖4)，在各株菌上均是MOI越大抑菌效果越好，在E.coliW1上，MOI越小，噬菌體C6需要越長(zhǎng)的時(shí)間發(fā)揮抑菌效力。即使在MOI=10-5時(shí)，C6在5 h后也能發(fā)揮顯著的抑制E.coliW1的生長(zhǎng)。比較噬菌體C6在STEC W3、STEC W5和 EPEC 143上的抑菌效力，C6在STEC W3上的抑菌效果最好。在STEC W5上，噬菌體C6在3 h后出現(xiàn)抑菌效果減弱的現(xiàn)象，細(xì)菌的數(shù)量開始逐漸增加。

A.W1;B.143;C.W3;D.W5。所標(biāo)字母相異代表各處理組差異顯著(P<0.05)，字母相同代表各處理組差異不顯著(P≥0.05)A.W1;B.143;C.W3;D.W5.Different letters denotes significant difference between the treatments(P<0.05), same letter denotes not significant difference between treatments(P≥0.05)圖4 噬菌體C6在各株致病菌上的抑菌曲線Fig.4 Bacteriostatic curves of phage C6

3 討 論

本研究測(cè)定了實(shí)驗(yàn)室此前分離得到的1株大腸桿菌噬菌體C6的生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)噬菌體C6有較廣的致病菌宿主譜。試驗(yàn)用了點(diǎn)滴法和雙層平板法檢測(cè)了噬菌體C6的宿主譜，發(fā)現(xiàn)點(diǎn)滴法得到的宿主譜廣于雙層平板法。為了排除是由于擴(kuò)增噬菌體的細(xì)菌所分泌的大腸桿菌素導(dǎo)致被測(cè)細(xì)菌裂解而形成空斑，作者將用于擴(kuò)增噬菌體的菌株單獨(dú)培養(yǎng)后，取菌液上清重復(fù)點(diǎn)滴試驗(yàn)，并未觀測(cè)到空斑，說明點(diǎn)滴裂解效應(yīng)確實(shí)由噬菌體產(chǎn)生。這與之前Khan Mirzaei和Nilsson[12]的研究結(jié)果一致。革蘭陰性菌的噬菌體通過點(diǎn)滴法可裂解細(xì)菌卻在雙層平板上無法形成空斑的主要原因有兩種：“l(fā)ysis from without”或者“abortive infection”[11,13]。噬菌體的宿主譜是決定其治療效果的重要因素[7]，而點(diǎn)滴法和雙層平板法是最常見的兩種檢測(cè)噬菌體宿主譜的方法，但是兩者結(jié)果的差異說明點(diǎn)滴法得到的宿主譜并不能完全表明噬菌體的感染譜。此外，本試驗(yàn)結(jié)果表明即使噬菌體能感染裂解某些細(xì)菌，其抑菌能力也存在顯著差異，所以評(píng)價(jià)1株噬菌體是否具有應(yīng)用潛力，不能簡(jiǎn)單地看它是否具有較廣的宿主譜。

本研究測(cè)定了噬菌體C6在多株致病菌上的感染特性，綜合噬菌斑形態(tài)、最佳MOI、成斑率、吸附率、生長(zhǎng)曲線和抑菌曲線，發(fā)現(xiàn)它們之間并不完全呈正相關(guān)關(guān)系。噬菌斑大小與成斑率呈顯著正相關(guān)，噬菌體的抑菌效果與噬菌體在該菌上的生長(zhǎng)能力呈正相關(guān)，吸附率與最佳MOI呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，吸附率與成斑率之間也無相關(guān)性，噬菌體的抑菌效果與噬菌斑大小無相關(guān)性。噬菌體C6在5株菌上的噬菌斑大小和成斑率大小均為E.coli22、E.coliW1>EPEC 143>STEC W3>STEC W5。

噬菌體C6在STEC W5在噬菌體與細(xì)菌共培養(yǎng)后期，細(xì)菌出現(xiàn)增殖的情況，推測(cè)是產(chǎn)生了耐受的突變菌，導(dǎo)致噬菌體C6抑菌效力減弱。這也是目前噬菌體治療細(xì)菌感染時(shí)最常見的問題[14]。細(xì)菌耐受噬菌體可以通過阻止細(xì)菌吸附[15]、感染流產(chǎn)[16]和CRISPR-Cas系統(tǒng)等多種途徑[17], STEC W5是通過哪種途徑產(chǎn)生了耐受還需后續(xù)進(jìn)行更深入地研究確認(rèn)。但是噬菌體通常也會(huì)產(chǎn)生新的突變來應(yīng)對(duì)對(duì)細(xì)菌的耐受，噬菌體與細(xì)菌之間一直存在這種此消彼長(zhǎng)，互相抵抗的共同進(jìn)化的過程[18]。本試驗(yàn)由于僅檢測(cè)了6 h的抑菌效果，未能觀察到噬菌體是否能針對(duì)耐受菌產(chǎn)生突變進(jìn)而產(chǎn)生新一輪的抑菌效果。

細(xì)菌表面存在的噬菌體受體是影響噬菌體吸附的最關(guān)鍵因素[19]，從吸附率的結(jié)果可以看出，E.coli22、E.coliW1 以及 EPEC 143 3個(gè)菌株上的噬菌體受體結(jié)構(gòu)可能有所不同。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，噬菌體C6在5株菌上均是MOI越大時(shí)抑菌效果越好，并非在最佳MOI時(shí)抑菌效果最好，這與此前其他學(xué)者的試驗(yàn)結(jié)果一致[20-21]。

噬菌體C6是從健康斷奶前仔豬中分離得到，說明在豬腸道中天然存在著可裂解感染多株致病菌的噬菌體，這些噬菌體可能具有保護(hù)仔豬腸道抵抗致病菌侵襲的潛在作用，這對(duì)預(yù)防仔豬腹瀉的發(fā)生有著極其重要的意義。此前也有研究表明，內(nèi)源性的噬菌體可為機(jī)體提供潛在的保護(hù)作用[22-23]。此外，噬菌體C6可以感染多株致病性大腸桿菌，且在各株致病菌上的感染特性存在差異，可作為較好的模型研究噬菌體與細(xì)菌間的互作關(guān)系，為進(jìn)一步開發(fā)噬菌體作為新型抗菌劑提供研究基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

噬菌體C6為T4樣噬菌體，可感染多株致病性大腸桿菌，在不同致病菌上的感染特性存在差異，均能顯著抑制致病菌的生長(zhǎng)。