綿羊miR-127/FOXO4反饋環(huán)路及其對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

付 強(qiáng)，岳巧嫻，錫建中，宋鵬琰，陳曉勇，周榮艷

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071001)

綿羊產(chǎn)羔數(shù)的遺傳力較低[1]，易受環(huán)境、季節(jié)、營(yíng)養(yǎng)等條件影響[2]。卵泡的生長(zhǎng)、發(fā)育與綿羊產(chǎn)羔數(shù)密切相關(guān)，即當(dāng)綿羊排卵率上升時(shí)產(chǎn)羔數(shù)增加[3]。顆粒細(xì)胞為哺乳動(dòng)物卵泡的發(fā)育、成熟提供物質(zhì)保障[4]。miRNA是由18～24個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA分子，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式作用于靶基因，進(jìn)而降解mRNA或阻礙其翻譯，在調(diào)控卵泡發(fā)育、閉鎖和顆粒細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮作用[5]。

FOXO4屬于FOXO家族成員，此家族成員在生物體中參與的調(diào)節(jié)通路基本相同，F(xiàn)OXO4參與了機(jī)體的糖脂代謝過(guò)程，體內(nèi)高表達(dá)FOXO4的小鼠，糖異生受到抑制[6]，細(xì)胞中膽固醇的合成量減少、葡萄糖的攝入量增加[7]，經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和胰島素等多因素刺激后，誘導(dǎo)FOXO4乙?；蛊浠罨? 促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8-9]。FOXO4參與了能量代謝過(guò)程，在生物體代謝穩(wěn)定過(guò)程中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，廣泛影響細(xì)胞的生理過(guò)程[10]。

顆粒細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞自主發(fā)生的模式[11-12]，在卵泡發(fā)育過(guò)程中扮演著重要角色。卵泡發(fā)育、成熟過(guò)程中，顆粒細(xì)胞凋亡則通常被認(rèn)為是引起卵泡閉鎖的“誘因”[13]。miRNA調(diào)控動(dòng)物卵泡顆粒細(xì)胞凋亡[14]。綿羊miR-150通過(guò)靶向STAR基因，抑制孕酮合成相關(guān)基因表達(dá)減少孕酮合成，促進(jìn)體外顆粒細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖[15]。miR-26b通過(guò)靶向SMAD4基因促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞凋亡[16]。miR-181a-5p通過(guò)靶向SIRT1抑制鵝顆粒細(xì)胞凋亡[17]。近年來(lái)研究表明，miRNAs在動(dòng)物卵泡顆粒細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用。

本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH顯著降低了綿羊卵泡顆粒細(xì)胞oar-miR-127和FOXO4的表達(dá)水平，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平上升。根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，推測(cè)oar-miR-127可能靶向FOXO4基因，且在細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮作用，目前oar-miR-127在綿羊顆粒細(xì)胞中的研究未見(jiàn)報(bào)道，本研究擬明確oar-miR-127對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞凋亡的影響及其與靶基因FOXO4之間的互作關(guān)系，為闡明其在綿羊卵泡發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 綿羊卵泡顆粒細(xì)胞分離培養(yǎng)及293T細(xì)胞培養(yǎng)

將復(fù)蘇后的293T細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，轉(zhuǎn)移到含有2 mL DMEM完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗)的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)在37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中。

采集綿羊卵巢，去除卵巢周?chē)嘤嗟闹?，割開(kāi)卵泡皮質(zhì)層后將液體收集于離心管中，1 000 r·min-1離心10 min，去上清，重復(fù)3次。加入適量DMEM/F12完全培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基+10%胎牛血清+0.1%丙酮酸鈉+1%雙抗)，吹打混勻后接種于培養(yǎng)瓶中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 引物設(shè)計(jì)

以綿羊FOXO4、Casp3和Bax基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)qRT-PCR引物，以oar-miR-127成熟體序列為模板設(shè)計(jì)莖環(huán)引物；利用Promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)預(yù)測(cè)綿羊miR-127基因啟動(dòng)子，設(shè)計(jì)啟動(dòng)子擴(kuò)增引物(Primer 3, https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)，測(cè)序引物由擎科生物公司合成(表1)。

表1 引物信息表

1.3 綿羊卵泡顆粒細(xì)胞總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

利用TRIzol試劑對(duì)收集的細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取。采用NanoDrop2000(Thermo Fisher Scientific, 美國(guó))進(jìn)行濃度測(cè)定。將RNA稀釋至200 ng·μL-1，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa, Code No.RR047A)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA合成。反轉(zhuǎn)錄體系包含10.0 μL去除基因組DNA的反應(yīng)液，1.0 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，1.0 μL RT Primer Mix(反轉(zhuǎn)錄oar-miR-127時(shí)，換成oar-miR-127反轉(zhuǎn)錄引物)，4.0 μL 5×PrimeScript Buffer 2，4.0 μL RNase Free Water，反轉(zhuǎn)錄條件為42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.4 miR-127啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子FOXO4結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)和重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.4.1 miR-127啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子FOXO4結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用Promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)預(yù)測(cè)綿羊miR-127啟動(dòng)子(NCBI，Gene ID: 102466274)，并利用JASPAR在線數(shù)據(jù)庫(kù) (http://jaspar.genereg.net/) 預(yù)測(cè)oar-miR-127和轉(zhuǎn)錄因子FOXO4的結(jié)合位點(diǎn)，以分?jǐn)?shù)為評(píng)判依據(jù)進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)的篩選。

1.4.2FOXO4過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建 在Ensembl中下載綿羊FOXO4的CDS區(qū)序列，利用重組臂技術(shù)將目的片段(完整編碼區(qū))連接至pcDNA3.1(+)質(zhì)粒。利用限制性?xún)?nèi)切酶Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切pcDNA3.1(+)過(guò)表達(dá)載體，膠回收純化，使用T4連接酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司)在4 ℃條件下將目的條帶與酶切產(chǎn)物連接10 min，目的片段與酶切產(chǎn)物質(zhì)量比為1∶6，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Trans5α，過(guò)夜培養(yǎng)，利用SalⅠ酶切和測(cè)序篩選陽(yáng)性克隆。

1.4.3 miR-127啟動(dòng)子區(qū)熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建 選取miR-127啟動(dòng)子區(qū)包含轉(zhuǎn)錄因子FOXO4結(jié)合位點(diǎn)長(zhǎng)度為600 bp的目的片段(-1 401～-2 000 bp)。 利用MluⅠ和Hind Ⅲ酶切pGL3-basic載體，膠回收純化，將目的條帶與酶切產(chǎn)物用T4連接酶在4 ℃條件下連接10 min，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Trans5α，過(guò)夜培養(yǎng)，利用酶切(HpaⅠ、HindⅢ)和測(cè)序篩選陽(yáng)性克隆。

1.5 靶基因FOXO4的3′-UTR miR-127結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)與熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建

利用TargetScan在線預(yù)測(cè)靶基因結(jié)合位點(diǎn)，選取包含miR-127結(jié)合位點(diǎn)長(zhǎng)度為70 bp的FOXO4基因序列，在序列兩端添加SacⅠ、XbaⅠ酶切位點(diǎn)(表2)。將兩條鏈按照如下體系進(jìn)行退火：FOXO4 3′-UTR正義鏈、反義鏈各10 μL，反應(yīng)條件為95～25 ℃溫度梯度，每個(gè)梯度相差5 ℃，反應(yīng)時(shí)間為2 min。利用SacⅠ酶和XbaⅠ酶對(duì)pmir-GLO質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，利用膠回收試劑盒回收純化酶切產(chǎn)物。利用T4連接酶在4 ℃條件下連接10 min， 轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)后挑選菌落，利用PCR擴(kuò)增和測(cè)序篩選陽(yáng)性克隆。

1.6 293T和綿羊卵泡顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶活性檢測(cè)

1.6.1 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選取對(duì)數(shù)期的293T細(xì)胞，按1.6×105個(gè)·孔-1接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。共轉(zhuǎn)染miR-127 mimic、mimicNC和FOXO4野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒、缺失型質(zhì)粒(0.5 μg DNA，1.0 μL P3000TM，1.5 μL LipofectamineTM 3000)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶的活性檢測(cè)。pcDNA3.1-FOXO4重組質(zhì)粒與pGL3-basic(miR-127)的共轉(zhuǎn)染方法同上。

1.6.2 綿羊卵泡顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將在體外培養(yǎng)的綿羊卵泡顆粒細(xì)胞按1.6×105個(gè)·孔-1接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，過(guò)夜培養(yǎng)。細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，利用HiPerFect Transfection Reagent將miR-127 mimic(50 nmol·L-1)、mimic NC(50 nmol·L-1) 轉(zhuǎn)染綿羊顆粒細(xì)胞(30 μL Optim-MEM，1.25 μL mimic/2.5 μLmimic NC，3 μL HiPer- Fect Transfection Reagent)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，處理48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行RNA提取和反轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子FOXO4 過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染綿羊卵泡顆粒細(xì)胞步驟同“1.6.1”。

1.6.3 熒光素酶活性檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞收集于EP管中，用GloMax Multi Jr單管多功能檢測(cè)儀(Promega，美國(guó))檢測(cè)熒光素酶活性，每管添加100 μL Stop & Glo Reagent，檢測(cè)海腎熒光素酶活性，重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算螢光蟲(chóng)熒光素酶與海腎熒光素酶活性比值。

1.7 qPCR檢測(cè)miR-127及相關(guān)基因表達(dá)

miR-127及mRNAs均按以下反應(yīng)體系和條件進(jìn)行設(shè)置，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)。qRT-PCR擴(kuò)增體系為：cDNA 1 μL，上、下游引物各0.4 μL (10 pmol·L-1)， Super Evagreen?qPCR Master Mix(Biotium，美國(guó)) 10 μL，ROX(100×) 3 μL，水5.2 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。利用2-△△Ct方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，miRNA表達(dá)量計(jì)算以U6為內(nèi)參，mRNAs表達(dá)量計(jì)算以GAPDH為內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism8軟件進(jìn)行作圖分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間基因表達(dá)量的差異，利用單因素方差分析相對(duì)熒光素酶活性，使用Duncan’s多重極差檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 載體的構(gòu)建

2.1.1 轉(zhuǎn)錄因子FOXO4過(guò)表達(dá)載體的酶切驗(yàn)證 利用SalⅠ酶對(duì)轉(zhuǎn)錄因子FOXO4與過(guò)表達(dá)載體(pcDNA3.1+)的重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，如圖1所示，酶切片段大小均符合目的片段的長(zhǎng)度；將測(cè)序結(jié)果與目的片段序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)序列一致并無(wú)突變，說(shuō)明質(zhì)?？蛇M(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.1.2 miR-127啟動(dòng)子區(qū)熒光素酶報(bào)告載體酶切驗(yàn)證 利用HpaⅠ和Hind Ⅲ酶對(duì)miR-127啟動(dòng)子區(qū)片段與pGL3-basic的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切片段大小與目的片段長(zhǎng)度相符(圖2)，將測(cè)序結(jié)果與目的片段序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)序列完全一致，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.1.3FOXO4基因3′-UTR區(qū)結(jié)合位點(diǎn)熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建 在線預(yù)測(cè)的綿羊miR-127與FOXO4基因3′-UTR二者的結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖3。依據(jù)該結(jié)合位點(diǎn)利用pmir-GLO載體構(gòu)建FOXO4基因3′-UTR野生型、突變型和缺失型重組質(zhì)粒。分別培養(yǎng)其單克隆菌，利用PCR鑒定陽(yáng)性菌落，挑選符合目的片段大小的菌落擴(kuò)增后進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果與原序列進(jìn)行比對(duì)(圖4)，序列無(wú)突變，表明載體構(gòu)建成功。

1.未酶切的pGL3-basic質(zhì)粒；2.使用Hpa Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切重組質(zhì)粒1. Undigested pGL3-basic plasmid; 2. Double digested recombinant plasmid with Hpa Ⅰand Hind III圖2 miR-127啟動(dòng)子區(qū)熒光素酶報(bào)告載體重組質(zhì)粒酶切電泳圖Fig.2 Enzyme digestion electrophoresis diagram of the recombinant plasmid of the luciferase reporter vector in the promoter region of miR-127

2.2 綿羊miR-127與FOXO4基因的相互作用

2.2.1 轉(zhuǎn)錄因子FOXO4對(duì)miR-127啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性及其表達(dá)水平的影響 利用JASPAR軟件預(yù)測(cè)并通過(guò)評(píng)分篩選，miR-127啟動(dòng)子區(qū)與轉(zhuǎn)錄因子FOXO4的結(jié)合位點(diǎn)為GTGAACA，詳見(jiàn)表3。轉(zhuǎn)錄因子FOXO4過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和miR-127啟動(dòng)子區(qū)重組質(zhì)粒pGL3-miR-127共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。如圖5所示，pGL3-miR-127+pcDNA3.1-FOXO4組熒光素酶活性值顯著低于pGL3-miR-127+ pcDNA3.1組(P<0.05，圖5A)，表明轉(zhuǎn)錄因子FOXO4負(fù)調(diào)控miR-127的表達(dá)。將FOXO4過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞，pcDNA3.1-FOXO4組 miR-127的表達(dá)水平顯著低于pcDNA3.1組(P<0.05，圖5B)，表明轉(zhuǎn)錄因子FOXO4抑制了miR-127的表達(dá)。

圖3 miR-127與FOXO4基因3′-UTR的結(jié)合位點(diǎn)Fig.3 The binding sites of miR-127 and FOXO4 3′-UTR

圖4 FOXO4重組質(zhì)粒序列比對(duì)圖Fig.4 Alignment of recombinant plasmid sequence of FOXO4

表3 miR-127啟動(dòng)子區(qū)與轉(zhuǎn)錄因子FOXO4預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)

A.FOXO4過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后熒光素酶活性值；B.FOXO4過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染綿羊卵泡顆粒細(xì)后miR-127的相對(duì)表達(dá)量。*. P<0.05，下同A. Luciferase activity value after FOXO4 overexpression vector transfected into 293T cells; B. Relative expression level of miR-127 after FOXO4 overexpression vector transfected into ovine follicular granulosa cells. *. P<0.05, the same as below圖5 相對(duì)熒光素酶活性和miR-127的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative luciferase activity and relative expression of miR-127

2.2.2 綿羊miR-127與基因FOXO4間的靶向關(guān)系驗(yàn)證 綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-127后，F(xiàn)OXO4的表達(dá)量極顯著降低(P<0.01，圖6A)。為進(jìn)一步驗(yàn)證FOXO4與miR-127的靶向關(guān)系，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)。結(jié)果顯示，與共轉(zhuǎn)染mimic NC+FOXO4-WT野生型載體組相比，共轉(zhuǎn)染miR-127 mimic+FOXO4-WT野生型載體組的293T細(xì)胞中熒光素酶活性顯著降低(P<0.05，圖6B)，表明miR-127可以靶向結(jié)合FOXO4 3′-UTR序列，抑制FOXO4基因的表達(dá)；分別與共轉(zhuǎn)染mimic NC+FOXO4-MUT突變型和共轉(zhuǎn)染mimic NC+FOXO4-DEL缺失型載體組相比，共轉(zhuǎn)染miR-127 mimic+FOXO4-MUT突變型和共轉(zhuǎn)染miR-127 mimic+FOXO4-DEL缺失型載體組的熒光素酶活性均無(wú)顯著差異(P>0.05，圖6B)，表明FOXO4 3′-UTR序列的突變和缺失均能消除miR-127對(duì)FOXO4基因的抑制作用，進(jìn)一步表明miR-127可以靶向結(jié)合FOXO4基因3′-UTR序列，并抑制FOXO4基因的表達(dá)。

A. miR-127 mimic 或mimic NC轉(zhuǎn)染綿羊卵泡顆粒細(xì)胞后FOXO4基因的相對(duì)表達(dá)量；B. miR-127 mimic、mimic NC分別與FOXO4野生、突變、缺失型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后相對(duì)熒光素酶活性A. Relative expression of FOXO4 gene after miR-127 mimic or mimic NC transfected into sheep follicular granulosa cells; B. The relative luciferase activity of miR-127 mimic, mimic NC and FOXO4 wild, mutant, and deletion plasmids transfected into 293T cells圖6 相對(duì)熒光素酶活性和FOXO4基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative luciferase activity and relative expression of FOXO4 gene

2.3 oar-miR-127對(duì)凋亡基因Casp3和Bax表達(dá)水平的影響

為探究miR-127對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的影響，轉(zhuǎn)染miR-127后檢測(cè)凋亡基因Casp3和Bax的mRNA表達(dá)變化。結(jié)果如圖7所示，與mimic NC組相比，miR-127 mimic能極顯著上調(diào)Casp3和Bax基因的表達(dá)(P<0.001)。

2.4 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FOXO4對(duì)細(xì)胞凋亡基因表達(dá)水平的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FOXO4的綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中凋亡基因Casp3、Bax和BCL2的mRNA表達(dá)水平(圖8)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FOXO4后，Casp3和Bax基因相對(duì)表達(dá)量與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1相比沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，但BCL2基因相對(duì)表達(dá)量與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1相比顯著降低0.4倍(P<0.05)。

A. 凋亡基因Casp3相對(duì)表達(dá)量；B. 凋亡基因Bax相對(duì)表達(dá)量。***.P<0.001A. Relative expression of apoptosis gene Casp3; B. Relative expression of apoptosis gene Bax. ***.P<0.001圖7 轉(zhuǎn)染miR-127顆粒細(xì)胞凋亡基因Casp3和Bax的表達(dá)水平Fig.7 Relative expression level of apoptosis genes Casp3 and Bax in granulosa cells

3 討 論

綿羊卵泡的發(fā)育與顆粒細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)[18]。卵泡的成熟過(guò)程中，大約99%的卵泡被淘汰而產(chǎn)生閉鎖，卵巢顆粒細(xì)胞是影響卵泡發(fā)育的重要“中介”，顆粒細(xì)胞凋亡會(huì)直接導(dǎo)致卵泡閉鎖，進(jìn)而影響生殖功能[19]。miRNA在調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[15]。對(duì)oar-miR-127進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子FOXO4與miR-127的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，抑制了miR-127的表達(dá)；miR-127與靶基因FOXO4的3′-UTR區(qū)結(jié)合，抑制綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中FOXO4基因的表達(dá)，并促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，明確了miR-127在卵泡顆粒細(xì)胞中的作用，間接表明miR-127通過(guò)靶向FOXO4可能促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡，為闡明miR-127和FOXO4調(diào)控卵泡閉鎖機(jī)理提供了一定的理論依據(jù)。miR-127是內(nèi)源性具有調(diào)控功能的非編碼RNA[20]，不同組織中miR-127的表達(dá)量不同，其在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于正常軟骨細(xì)胞，miR-127靶向下調(diào)adipoR1基因的表達(dá)，促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的增殖[21]。miR-127-3p可直接靶向于Ddit3基因的CDS區(qū)域，調(diào)控靶基因表達(dá)，顯著促進(jìn)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞分化[22]；miR-127-5p特異性結(jié)合IRAK4，負(fù)調(diào)控其表達(dá)，誘導(dǎo)了肺炎鏈球菌肺泡上皮細(xì)胞凋亡[23]，miR-127-3p靶向下調(diào)MAPK4基因表達(dá)來(lái)抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]。miR-96-5p通過(guò)靶向FOXO4抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖[10]，表明了miRNA可以通過(guò)靶向FOXO4調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡。FOXO4是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一[25-26]，能夠加速細(xì)胞集落的衰老，通過(guò)抑制細(xì)胞的凋亡進(jìn)而維持人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的活力和功能[27]。miR-421通過(guò)抑制FOXO4基因的表達(dá)進(jìn)而抑制致鼻咽癌細(xì)胞的增殖和凋亡[28]；FOXO4在人黃素化的壁顆粒細(xì)胞中表達(dá)[29]，表明其參與卵泡發(fā)育和黃體生成過(guò)程，在卵泡顆粒細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，但有關(guān)FOXO4在卵泡顆粒細(xì)胞中作用的相關(guān)報(bào)道較少，其對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的作用機(jī)理和卵泡閉鎖的影響還需要深入研究。miR-128-3p通過(guò)抑制FOXO4和MMP9的表達(dá)來(lái)抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[30]。

A、B、C.表示過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FOXO4后凋亡基因Casp3、Bax和BCL2相對(duì)表達(dá)量A, B, C. Represent the relative expression levels of apoptosis genes Casp3, Bax and BCL2 after overexpression of transcription factor FOXO4, respectively圖8 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FOXO4顆粒細(xì)胞中凋亡基因的表達(dá)水平Fig.8 The expression level of apoptotic genes in granulosa cells with overexpressed transcription factor FOXO4

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)證實(shí)了綿羊miR-127與轉(zhuǎn)錄因子FOXO4之間存在反饋抑制環(huán)路。此外，F(xiàn)OXO4通過(guò)下調(diào)抑凋亡基因BCL2的表達(dá)，miR-127通過(guò)上調(diào)促凋亡基因Casp3和Bax的表達(dá)，促進(jìn)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡。