去勢(shì)抵抗性前列腺癌潛在關(guān)鍵基因的生物信息學(xué)分析

董婧婷，衡立，康紹叁，劉健，田志崇，張立國(guó)，張金存，李治國(guó)，沈宏，曹鳳宏*

本研究?jī)r(jià)值：

本研究從基因、通路到預(yù)后的角度深入挖掘了與去勢(shì)抵抗性前列腺癌相關(guān)的基因，并發(fā)現(xiàn)CDC20、MAD2L1 和NUSAP1 與去勢(shì)抵抗性前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，為去勢(shì)抵抗性前列腺癌的預(yù)防和治療提供了新的研究方向。

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是癌癥相關(guān)死亡率第二高的惡性疾病［1］，目前主要采取雄激素剝奪療法（androgen-deprivation therapy，ADT）進(jìn)行治療［2］。據(jù)報(bào)道，10%～20%的PCa 患者對(duì)ADT 產(chǎn)生抵抗，最終演變?yōu)槿?shì)抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC），且中位生存期僅為14 個(gè)月［3］，預(yù)后不良，死亡率極高［4］。已有研究發(fā)現(xiàn)在去勢(shì)狀態(tài)下雄激素受體（androgen receptor，AR）信號(hào)的傳導(dǎo)與CRPC潛在分子機(jī)制有關(guān)［5］，但具體機(jī)制仍不十分清楚，且目前臨床上尚無(wú)有效治療CRPC 的方法。因此亟須尋找新的關(guān)鍵基因，為臨床診療提供新思路。

生物信息學(xué)是一門(mén)分析理解生物數(shù)據(jù)的學(xué)科，其可以在生物體表達(dá)的不同位置、不同通路中進(jìn)行富集，從而發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)聯(lián)的生物信息，還可根據(jù)基因本體論（GO）、京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）綜合分析，獲取在癌癥相關(guān)疾病中較為穩(wěn)定的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），是一種能有效發(fā)掘癌癥相關(guān)疾病基因表達(dá)譜的重要工具［6］。已有研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法找到與PCa 相關(guān)的關(guān)鍵基因。SUN 等［7］通過(guò)生物信息學(xué)分析鑒定出ARHGEF38 等關(guān)鍵基因和PCa 進(jìn)展相關(guān)；SHEN 等［8］運(yùn)用基因表達(dá)分析揭示了與PCa 預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因并提出靶向細(xì)胞周期通路可能與PCa 的預(yù)后和治療相關(guān)；GU 等［9］采用生物信息學(xué)方法確定了TOP2A、CCNB2 等關(guān)鍵基因可促進(jìn)PCa 的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步找到和CRPC 發(fā)展密切的候選基因，本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法挖掘與CRPC 進(jìn)展相關(guān)的關(guān)鍵基因。

本研究結(jié)合CRPC 和PCa 樣本的基因表達(dá)譜，首先對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行處理，篩選DEGs，分析DEGs 的功能和途徑以及疾病的信號(hào)通路。然后構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，對(duì)重要模塊進(jìn)行分析并篩選出具有生存意義的關(guān)鍵基因，本研究結(jié)果可為CRPC 發(fā)病機(jī)制、治療和預(yù)后的相關(guān)研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 從國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 的GEO（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載微陣列數(shù)據(jù)集GSE32269。GSE32269 芯片由Affymetrix 公司GPL96 平臺(tái)檢測(cè)，包括29 例CRPC 樣本和22 例原發(fā)性PCa 樣本。

1.2 篩選DEGs 使用R 語(yǔ)言4.0.3 中的Affy 包［10］，將normalize.method 設(shè) 置 為“quantiles”，bgcorrect.method 設(shè)置為“rma”，pmcorrect.method 設(shè)置為“pmonly”，summary.method 設(shè)置為“l(fā)iwong”，提取基因的表達(dá)量。然后采用t 檢驗(yàn)得到兩組樣本基因表達(dá)量的P 值，利用Benjamini-Hochberg 錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率方法，調(diào)整P 值來(lái)降低假陽(yáng)性率［11］。采用校正后P<0.05，差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）>1.5 作為截?cái)嘀档臉?biāo)準(zhǔn)，篩選CRPC 和原發(fā)性PCa 樣本之間的DEGs。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)和模塊分析 為預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間物理和功能的相互作用，本研究使用STRING（https://string-db.org/）構(gòu)建DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)（互作評(píng)分>0.4）［16］。采用Cytoscape 3.7.2 版（http://cytoscape.org/download_old_versions.html）軟件進(jìn)行可視化處理［17］。利用MCODE插件［18］對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊分析，較高分?jǐn)?shù)的模塊在疾病的發(fā)展過(guò)程中具有重要意義。

1.5 鑒定關(guān)鍵基因 選擇滿足以下2 個(gè)約束條件的DEGs 作為關(guān)鍵基因：（1）該基因位于關(guān)鍵模塊中（模塊分?jǐn)?shù)>40）；（2）使用Cytoscape 軟件計(jì)算，同時(shí)符合最大鄰域分量（maximum neighborhood component，MNC）、 最 大 鄰 域 分 量 密 度（density of maximum neighborhood component，DMNC）和最大集團(tuán)中心性（maximal clique centrality，MCC）前30 位的基因。

1.6 關(guān)鍵基因的生存分析和受試者工作特征（ROC）曲線分析 癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）數(shù)據(jù)庫(kù)擁有龐大的PCa 樣本量，能提供大量的臨床信息［19］。基于TCGA 并在基因表達(dá)和生存分析的交互式網(wǎng)絡(luò)應(yīng) 用（Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2，GEPIA2）（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index） 下， 對(duì)這些關(guān)鍵基因采用Mantel-Cox 檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析［20］，評(píng)價(jià)患者預(yù)后，其中總生存期是指從隨機(jī)化分組開(kāi)始至因任何原因引起死亡的時(shí)間；無(wú)病生存期是指從隨機(jī)化分組開(kāi)始至疾病復(fù)發(fā)或由于疾病進(jìn)展導(dǎo)致患者死亡的時(shí)間。然后繪制關(guān)鍵基因的ROC 曲線，用R 軟件pROC包［21］計(jì)算ROC 曲線下面積（AUC），可以直觀地分析關(guān)鍵基因?qū)RPC 的診斷價(jià)值，一般認(rèn)為AUC>0.50，越接近于1 則診斷價(jià)值越高［22］。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRPC 的DEGs 篩選 通過(guò)對(duì)微陣列數(shù)據(jù)集GSE32269 分析共篩選出279 個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因175 個(gè)，下調(diào)基因104 個(gè)（圖1，彩圖掃描文章首頁(yè)二維碼）。

圖1 CRPC 的DEGs 篩選Figure 1 Identification of differentially expressed genes in castration-resistant prostate cancer

2.2 CRPC 的DEGs GO 富集分析和KEGG 信號(hào)通路分析 GO 富集分析結(jié)果顯示，CRPC 的DEGs 主要參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞分裂、有絲分裂姐妹染色單體分離、有絲分裂核分裂和有絲分裂胞質(zhì)分裂等BP（圖2A、表1），主要分布在細(xì)胞外外泌體、細(xì)胞外基質(zhì)等CC（圖2B、表2），主要有細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、蛋白質(zhì)結(jié)合等MF（圖2C、表3）。KEGG 結(jié)果顯示，CRPC 的DEGs 主要參與黏著斑、PI3K-Akt信號(hào)通路和細(xì)胞周期等途徑（圖3）。

圖2 CRPC 的DEGs GO 富集分析結(jié)果Figure 2 GO enrichment results of differentially expressed genes in castration-resistant prostate cancer

表1 CRPC 的DEGs 主要參與的生物過(guò)程Table 1 Major biological processes in which differentially expressed genes in castration-resistant prostate cancer being involved

表2 CRPC 的DEGs 主要參與的細(xì)胞成分Table 2 Major cellular components of differentially expressed genes involved in castration-resistant prostate cancer development

表3 CRPC 的DEGs 主要參與的分子功能Table 3 Major molecular functions of differentially expressed genes involved in castration-resistant prostate cancer development

圖3 CRPC 的DEGs KEGG 富集分析結(jié)果Figure 3 KEGG enrichment results of differentially expressed genes involved in castration-resistant prostate cancer development

2.3 CRPC 的DEGs PPI 分析及關(guān)鍵基因篩選 應(yīng)用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的279 個(gè)DEGs 進(jìn)行PPI 分析，通過(guò)移除分離和單獨(dú)連接的節(jié)點(diǎn)，應(yīng)用Cytoscape 將蛋白網(wǎng)絡(luò)可視化，得到一個(gè)由224 個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 665 條邊組成的PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖4A）。使用MCODE 識(shí)別出了最重要的模塊（分?jǐn)?shù)=42.093），由43 個(gè)節(jié)點(diǎn)和863 條邊組成（圖4B）。根據(jù)篩選條件共鑒定出15 個(gè)關(guān)鍵基因（圖4C）， 分 別 是CDC20、CCNB2、PRC1、MAD2L1、PBK、NUSAP1、RRM2、SMC2、MELK、KIF4A、DTL、ZWINT、CEP55、RACGAP1 和CDKN3（表4）。

圖4 CRPC 的DEGs PPI 網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵基因Figure 4 PPI network and key genes involved in castration-resistant prostate cancer development

表4 CRPC 的DEGs 關(guān)鍵基因詳細(xì)情況Table 4 Details of key genes of differentially expressed genes involved in castration-resistant prostate cancer development

2.4 關(guān)鍵基因與CRPC 患者預(yù)后的關(guān)系 對(duì)15 個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示，CDC20（n=245）、MAD2L1（n=246）和NUSAP1（n=246）高表達(dá)組CRPC總生存期分別短于CDC20（n=245）、MAD2L1（n=246）和NUSAP1（n=246）低表達(dá)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.049，P=0.035，P=0.020）， 見(jiàn) 圖5。CDC20、MAD2L1 和NUSAP1 高表達(dá)組CRPC 無(wú)病生存期分別短于CDC20、MAD2L1 和NUSAP1 低表達(dá)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=7.5E-05，P=0.043，P=0.002），見(jiàn)圖6。繪 制CDC20、MAD2L1 和NUSAP1 預(yù) 測(cè)CRPC 發(fā) 生 的ROC 曲線，結(jié)果顯示，AUC 分別為0.933、0.762、0.950（圖7）。

圖5 CDC20、MAD2L1 和NUSAP1 高表達(dá)組與低表達(dá)組總生存期比較的生存曲線Figure 5 Overall survival curves between castration-resistant prostate cancer patients with highly and low expressed CDC20，MAD2L1 and NUSAP1

圖6 CDC20、MAD2L1 和NUSAP1 高表達(dá)組與低表達(dá)組無(wú)病生存期比較的生存曲線Figure 6 Disease-free survival curves between castration-resistant prostate cancer patients with highly and low expressed CDC20，MAD2L1 and NUSAP1

圖7 CDC20、MAD2L1 和NUSAP1 預(yù)測(cè)CRPC 發(fā)生的ROC 曲線Figure 7 ROC curves of CDC20，MAD2L1 and NUSAP1 predicting castration-resistant prostate cancer

3 討論

CRPC 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，AR 擴(kuò)增、AR 突變及AR 變異等多種機(jī)制均參與CRPC 的發(fā)生、發(fā)展［23］，但具體機(jī)制仍難以明確。本研究采用生物信息學(xué)方法分析芯片數(shù)據(jù)集共篩選出279 個(gè)DEGs，通過(guò)GO 和KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)DEGs 主要富集于細(xì)胞分裂、有絲分裂和細(xì)胞周期。已有研究表明，有絲分裂停滯可抑制CRPC 的進(jìn)展［24］。CRPC 的發(fā)生、發(fā)展和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期的基因密切相關(guān)［25-27］，提示細(xì)胞分裂、有絲分裂和細(xì)胞周期是影響CRPC 發(fā)生、發(fā)展的重要因素。

本研究在這些DEGs 中鑒定出可能參與CRPC 發(fā)生和進(jìn)展的15 個(gè)關(guān)鍵基因，對(duì)其進(jìn)一步驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)，CDC20、MAD2L1 和NUSAP1 的高表達(dá)均與CRPC 總生存期及無(wú)病生存期呈負(fù)相關(guān)，且AUC 均>0.50，表明CDC20、MAD2L1 和NUSAP1 的表達(dá)能影響CRPC 的預(yù)后，且對(duì)CRPC 有較高的診斷價(jià)值。

CDC20 不僅是一種關(guān)鍵的E3 連接酶，還是一種細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑，可與腺瘤性息肉病大腸埃希菌（APC）結(jié)合，識(shí)別D-box 或KEN 盒底物以促進(jìn)蛋白酶體的降解。CDC20 與APC 結(jié)合后，可通過(guò)破壞關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，在有絲分裂的中期到后期發(fā)揮致癌功能［28］。已有研究報(bào)道，上調(diào)的CDC20 在包括胰腺導(dǎo)管腺癌、乳腺癌、白血病、膀胱癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和胃癌［29-31］等多種惡性腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用，并與這些癌癥的不良預(yù)后相關(guān)。DAI 等［32］通過(guò)遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CDC20 可增強(qiáng)PCa 細(xì)胞的遷移能力。ZHANG 等［33］證明CDC20 可通過(guò)腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞中的β-連環(huán)蛋白來(lái)驅(qū)動(dòng)PCa 發(fā)生，其表達(dá)下降可抑制CD44+PCa 干細(xì)胞的表達(dá)，且與PCa 患者的不良預(yù)后相關(guān)。有研究證明，敲低CDC20 可抑制轉(zhuǎn)移性CRPC的發(fā)生并增強(qiáng)CRPC 對(duì)多西他賽的敏感性，而CDC20的過(guò)表達(dá)則可通過(guò)依賴Bim 的方式促進(jìn)CRPC 細(xì)胞系對(duì)多西紫杉醇耐藥［34］。

MAD2L1 是有絲分裂紡錘體組裝檢查點(diǎn)的一個(gè)組成部分，阻止有絲分裂后期發(fā)生，直到所有染色體在中期排列正確。已有研究表明，MAD2L1 可促進(jìn)人前列腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)［35］，其過(guò)表達(dá)與小細(xì)胞肺癌侵襲性和轉(zhuǎn)移有關(guān)，并可通過(guò)被MiR-200c-5p 抑制而降低人肝細(xì)胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移［36-37］。MAD2L1 和CDC20 之間可以相互作用，在調(diào)節(jié)有絲分裂中共同發(fā)揮重要功能［35］。CHOI 等［38］發(fā)現(xiàn)CDC20 和MAD2L1 共同高表達(dá)能促進(jìn)尿路上皮膀胱癌的不良預(yù)后，表明CDC20 和MAD2L1在癌癥相關(guān)疾病中可以相互影響，共同發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，CDC20 和MAD2L1 的高表達(dá)均與CRPC的不良預(yù)后相關(guān)，提示CDC20 和MAD2L1 可能是影響CRPC 發(fā)生和預(yù)后的潛在基因。

NUSAP1 在紡錘體微管組織中起作用，是一種核仁-紡錘體相關(guān)蛋白。NUSAP1 在細(xì)胞增殖中特異性表達(dá)，并在細(xì)胞周期和細(xì)胞質(zhì)分裂中起至關(guān)重要的作用［39］。已有研究證實(shí)NUSAP1 是PCa 進(jìn)展的生物標(biāo)志物之一，可通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平來(lái)促進(jìn)PCa 的侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移，從而推動(dòng)PCa 的進(jìn)展［40-41］。GORDON 等［42］發(fā)現(xiàn)，使用慢病毒敲低NUSAP1 減少了DU145 或PC-3-RB1 細(xì)胞的增殖和侵襲，表明NUSAP1 可影響PCa 細(xì)胞增殖和侵襲。據(jù)報(bào)道，NUSAP1 在多種癌癥中過(guò)度表達(dá)且NUSAP1 的表達(dá)升高與這些癌癥的進(jìn)展密切相關(guān)，包括乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌等［43-49］。本研究結(jié)果提示，NUSAP1 的高表達(dá)與CRPC 的總生存期及無(wú)病生存期呈負(fù)相關(guān)，對(duì)CRPC 有較好的診斷價(jià)值。以上研究結(jié)果表明，NUSAP1 可能是影響CRPC 早期診斷和預(yù)后的潛在因子。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)CRPC 及原發(fā)性PCa 組織樣本的DEGs 分析，鑒定出3 個(gè)關(guān)鍵基因：CDC20、MAD2L1 和NUSAP1，這3 個(gè)關(guān)鍵基因與CRPC 疾病的診斷和預(yù)后密切相關(guān)，為CRPC 疾病進(jìn)展的分子機(jī)制研究及預(yù)后判斷提供了新靶點(diǎn)。但由于缺乏實(shí)驗(yàn)分析，其具體機(jī)制目前尚不十分明確，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

作者貢獻(xiàn)：董婧婷、沈宏、曹鳳宏進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，研究的實(shí)施；董婧婷、康紹叁進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；董婧婷、劉健、田志崇進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；康紹叁、劉健、李治國(guó)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；董婧婷、衡立、張金存進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；董婧婷撰寫(xiě)論文；衡立、張立國(guó)進(jìn)行論文的修訂；沈宏、曹鳳宏負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。