丁香油與月桂酸對金黃色葡萄球菌的協(xié)同抑制作用

譚婉靜，張笑薇，白泓，李曉鳳，余以剛，肖性龍

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640）

金黃色葡萄球菌在自然環(huán)境中廣泛存在，是最常見的食源性致病菌之一。污染金黃色葡萄球菌的食品，不僅保質(zhì)期縮短，誤食后還可能引起食物中毒。為了抑制食品中致病菌、腐敗菌等微生物的生長，延長其保質(zhì)期，添加防腐劑是食品生產(chǎn)企業(yè)的首選。隨著化學(xué)防腐劑弊端的出現(xiàn)，以及人們對綠色、安全食品的追求，使用安全、有效的植物源天然防腐劑已成為食品保鮮的趨勢[1，2]。許多天然防腐劑如精油、酶、殼聚糖等已經(jīng)被用于食品保鮮[3]。從植物的不同部位提取出來的植物精油，長期以來一直被用作食品調(diào)味劑，并被美國食品和藥物管理局認(rèn)定是安全的[4，5]。丁香油等精油被證明能夠有效滅活微生物，維持食品品質(zhì)，延長保質(zhì)期[6，7]。中鏈脂肪酸（medium chain fatty acid，MCFA）是一組天然存在于椰子油、棕櫚油和牛奶等食物中的甘油飽和脂肪酸酯[8，9]。在 MCFA 中，月桂酸及其酯類被證明是食品和化妝品中最有效的抗菌劑[10]。盡管精油和中鏈脂肪酸有很多優(yōu)點(diǎn)，但單獨(dú)使用時(shí)要想達(dá)到理想的保鮮效果，仍需要大量添加。對精油和中鏈脂肪酸聯(lián)合使用進(jìn)行抑菌的研究發(fā)現(xiàn)，兩種化合物聯(lián)合時(shí)對大腸桿菌具有協(xié)同殺菌作用，此時(shí)所需的抑菌物濃度更低且效果更好[9]。

生鮮米粉在我國歷史悠久[11]，因其風(fēng)味獨(dú)特、易于消化，在東南亞大部分地區(qū)都很受歡迎[12]。然而，水分含量高、營養(yǎng)豐富，使生鮮米粉很容易受到微生物的污染[13]。因微生物增殖導(dǎo)致保質(zhì)期的縮短，限制了生鮮米粉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[14]。因此，控制生鮮米粉中微生物的生長對延長其保質(zhì)期尤為重要。

革蘭氏陽性細(xì)菌與革蘭氏陰性細(xì)菌具有不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，中鏈脂肪酸和精油聯(lián)合對革蘭氏陽性菌是否具有協(xié)同作用尚未被研究，且二者聯(lián)合在食品中的作用尚未被證實(shí)。本文選擇金黃色葡萄球菌作為模式菌，探究丁香油、百里香油、薄荷油等三種植物精油以及中鏈脂肪酸月桂酸對金黃色葡萄球菌的抑制效果，并篩選出具有協(xié)同抑制作用的組合丁香油與月桂酸，測定協(xié)同組合對金黃色葡萄球菌生長、細(xì)胞膜通透性的影響。此外，還將協(xié)同組合丁香油與月桂酸制成抑菌保鮮液用于生鮮米粉保鮮，通過測定生鮮米粉中的微生物及理化性質(zhì)，并進(jìn)行感官鑒評，評價(jià)該抑菌保鮮液對生鮮米粉的保鮮效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮米粉，購買自當(dāng)?shù)厣r超市；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA），購買自廣州環(huán)凱微生物有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂，購買于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；丁香油、薄荷油，購買自安徽酷爾生物工程有限公司；百里香油，購買自江西雪松天然醫(yī)藥油有限公司；月桂酸，購買自國藥控股化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250A-2恒溫培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；HZQ-F100恒溫振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)儀器有限公司；TYXH-1旋渦混合器，上海蘭儀實(shí)業(yè)有限公司；YXQ-LS-100SⅡ高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SW-CJ-1SD超凈工作臺，蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司；SORVALL Stratos臺式高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；BCD-256KFA冰箱，山東青島海爾股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液的制備

用接種環(huán)蘸取保存于-80 ℃甘油管中的金黃色葡萄球菌，在TSA平板上劃線，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 24 h。隨后用接種環(huán)挑取單菌落接種于 40 mL TSB培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)，活化菌株。無菌環(huán)境下吸取生長到指數(shù)期的菌液1 mL接種于40 mL TSB中，37 ℃、180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期，取菌液于8000 r/min條件下離心5 min收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌 2次，最后重懸于無菌 TSB溶液中得到 106CFU/mL菌懸液。

1.3.2 抑菌劑母液的制備

月桂酸母液：稱取適量月桂酸固體顆粒，用50%乙醇水溶液溶解，用0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾除菌后加入無菌水稀釋至576 μg/mL，此時(shí)乙醇濃度為25%，37 ℃水浴鍋保存?zhèn)溆谩?/p>

丁香油、薄荷油、百里香油母液：吸取適量精油原液，用50%乙醇水溶液溶解，用0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾除菌后加入無菌水分別配制成512 μg/mL、512 μg/mL、480 μg/mL的丁香油、薄荷油、百里香油母液，此時(shí)乙醇濃度為25%，37 ℃水浴鍋保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 最小抑菌濃度（MIC）的測定

三種精油及月桂酸對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（Minimum inhibition concentration，MIC）的測定參照Purkait等[5]所描述的方法。按照1.3.1所述制備菌懸液，1.3.2的方法配置三種精油及月桂酸母液。在96孔板中每孔加入100 μL菌懸液，再向孔中加入100 μL丁香油母液進(jìn)行等倍稀釋，混合均勻后反復(fù)吹打，此時(shí)丁香油的終濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL。隨后將樣品放置在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察金黃色葡萄球菌生長情況，用接種環(huán)蘸取96孔板中溶液在TSA平板上劃線，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察平板上細(xì)菌生長情況。依此方法測定薄荷油、百里香油及月桂酸對金黃色葡萄球菌的MIC。實(shí)驗(yàn)以不含抑菌物的TSB菌懸液為陰性對照，不含細(xì)菌的TSB為陽性對照，并另外做乙醇空白試驗(yàn)，每組樣品做三個(gè)平行。MIC定義為在肉眼觀察下，抑菌物抑制金黃色葡萄球菌生長的最低濃度。

1.3.4 分級抑菌濃度（FIC）的測定

參照Bag等[15]的方法，采用棋盤滴定法測定三種植物精油和月桂酸聯(lián)合使用時(shí)對金黃色葡萄球菌的分級抑菌濃度（Fractional Inhibitory Concentration，F(xiàn)IC）。按照1.3.1所述制備菌懸液，1.3.2的方法配置三種精油及月桂酸母液。由1.3.3所得結(jié)果，用無菌TSB稀釋抑菌物母液，得到濃度為8×MIC、4×MIC、2×MIC、1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC的溶液。在96孔板中每孔加入100 μL菌液，50 μL不同濃度的精油和月桂酸溶液分別加入到96孔板的橫行豎列中，以得到最終濃度（2×MIC、1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC）。反復(fù)吹打混合均勻后放置在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察96孔板中金黃色葡萄球菌的生長情況，每組樣品三個(gè)平行。記錄并計(jì)算每個(gè)樣品的 FIC值，按照如下公式計(jì)算每組樣品的分級抑菌濃度系數(shù)（Fractional Inhibitory Concentration Indices，F(xiàn)ICI）。

FICI計(jì)算公式：

FICI解釋標(biāo)準(zhǔn)：協(xié)同作用（FICI≤0.5）；相加作用（0.5＜FICI≤1）；無關(guān)（1＜FICI≤4）；拮抗作用（FICI＞4）。

1.3.5 丁香油、月桂酸及其協(xié)同組合對金黃色葡萄球菌生長的影響

根據(jù)1.3.4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇具有協(xié)同作用的組合丁香油和月桂酸進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。參照 Basri和KhaIron[16]的方法，測定丁香油和月桂酸在不同濃度下（1/2×MIC丁香油、1/2×MIC月桂酸、1/4×MIC丁香油+1/4×MIC月桂酸和1/2×MIC丁香油+1/2×MIC月桂酸）單獨(dú)或聯(lián)合使用對金黃色葡萄球菌生長的影響。按照1.3.1所述的方法制備105CFU/mL菌懸液，1.3.2的方法配置三種精油及月桂酸母液，在滅菌試管中加入菌懸液及不同濃度丁香油和月桂酸溶液，得到最終濃度（1/2×MIC丁香油、1/2×MIC月桂酸、1/4×MIC丁香油+1/4×MIC月桂酸和1/2×MIC丁香油+1/2×MIC月桂酸）。將試管放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在0、0.5、1、1.5、2、3、4、8、12、24 h 后從試管中吸取50 μL樣液，用0.85%無菌生理鹽水稀釋后，選取適宜稀釋度，取樣100 μL注入TSA平板上涂布，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后計(jì)算菌落數(shù)。每個(gè)樣品三個(gè)平行。

1.3.6 丁香油、月桂酸及其協(xié)同組合對金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜通透性的影響

當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性被破壞時(shí)，細(xì)胞大分子內(nèi)容物（如核酸和蛋白質(zhì)）被釋放到培養(yǎng)基中[17]。與1.3.5相同，制備經(jīng)不同濃度丁香油和月桂酸處理的樣品，對照組不添加抑菌物。樣品置于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在培養(yǎng)0、1、2、4、8、24 h后，取樣，8000 r/min離心 5 min，收集上清液，用多功能酶標(biāo)儀分別測定上清液在260 nm和280 nm處的吸光值，以評估核酸和蛋白質(zhì)的泄漏情況。每組樣品做三個(gè)平行。

按照1.3.1的方法制備菌懸液，8000 r/min離心5 min收集菌體，用5%葡萄糖溶液重懸，反復(fù)洗滌，至菌液的電導(dǎo)率與 5%葡萄糖溶液的電導(dǎo)率相當(dāng)，此菌液作為等滲液。按照1.3.2的方法配置丁香油和月桂酸母液，與1.3.5相同，制備經(jīng)不同濃度丁香油和月桂酸處理的樣品，對照組不添加抑菌物，其中菌懸液使用等滲液替代。樣品置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，分別于0、1、2、3、4、5、6、10、24 h測定樣品電導(dǎo)率，記為 L2。5%葡萄糖與不同濃度的丁香油和月桂酸混合，其電導(dǎo)率記為L1。等滲液沸水浴5 min，冷卻后測定電導(dǎo)率，記為L0。每組樣品做三個(gè)平行。金黃色葡萄球菌經(jīng)不同濃度丁香油和月桂酸及其組合處理后，相對電導(dǎo)率（Relative Electric Conductivity，REC）由下列公式計(jì)算：

1.3.7 生鮮米粉保鮮效果評價(jià)

生鮮米粉（共10批次）從當(dāng)?shù)匾患疑r超市購買，并在2 h內(nèi)運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。根據(jù)感官可接受性和食品基質(zhì)對保鮮效果的影響，制備濃度為丁香油2 μg/mL、月桂酸9 μg/mL的抑菌保鮮液。將生鮮米粉隨機(jī)分為兩組：1-對照組（記為CK），浸泡在蒸餾水中；2-處理組（記為 T），浸泡在丁香油（2 μg/mL）和月桂酸（9 μg/mL）抑菌保鮮液中。每組樣品在相應(yīng)的處理溶液中浸泡1 min后，撈出瀝干并包裝在聚乙烯袋中，在4 ℃保存并進(jìn)行菌落總數(shù)、酸度值測定及感官分析實(shí)驗(yàn)。

將生鮮米粉在95 ℃的水浴中殺菌40 min[18]，撈出瀝干，將金黃色葡萄球菌菌懸液接種到生鮮米粉中，使得生鮮米粉中初始金黃色葡萄球菌菌落數(shù)達(dá)到 5～7 lg CFU/g。將生鮮米粉隨機(jī)分為兩組：1-對照組（記為CK），浸泡在蒸餾水中；2-處理組（記為T），浸泡在丁香油（2 μg/mL）和月桂酸（9 μg/mL）抑菌保鮮液中。每組樣品在相應(yīng)的處理溶液中浸泡1 min后，撈出瀝干并包裝在聚乙烯袋中，在4 ℃保存并進(jìn)行金黃色葡萄球菌菌落數(shù)測定。

為了確定抑菌保鮮液的保鮮效果，按照 GB 4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》的方法并略作修改，測定生鮮米粉中的菌落總數(shù)（TPC）。將25 g生鮮米粉用225 mL 0.85%無菌生理鹽水均質(zhì)后，用0.85%無菌生理鹽水配制成10倍系列稀釋液，選取適宜稀釋度進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。每組樣品做三個(gè)平行。

酸度值的測定參照 GB 5009.239-2016《食品酸度的測定》第一法并有改動，每組（15 g）樣品用150 mL蒸餾水研磨成勻漿，均質(zhì)，在勻漿中滴入 5滴三氯甲烷進(jìn)行浸提。浸提完成后，勻漿以5000 r/min離心5 min，收集上清液，測定酸度值。每組樣品做三個(gè)平行。

4 ℃冷藏72 h后，對各組樣品進(jìn)行感官分析。生鮮米粉在沸水中漂燙3 min。熱燙后，由10名訓(xùn)練有素的專家對米粉的顏色、外觀、氣味、口感和質(zhì)地進(jìn)行1到10的可接受性評分，其中10=非常喜歡，1=非常不喜歡。評分低于5分意味著沒有通過可接受性感官測試。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS Statistics 23軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性顯著分析，p＜0.05為顯著差異，用Origin 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖。

表1 生鮮米粉感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of fresh rice noodles

2 結(jié)果與討論

2.1 最小抑菌濃度和分級抑菌濃度

如表2所示，丁香油對金黃色葡萄球菌的MIC低于薄荷油和百里香油。三種精油對金黃色葡萄球菌的MIC為 2.0～7.5 μg/mL。月桂酸對金黃色葡萄球菌的MIC為9.0 μg/mL。結(jié)果表明，三種精油和月桂酸對金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用。

表2 植物精油與月桂酸聯(lián)合作用時(shí)對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度和分級抑菌濃度系數(shù)Table 2 The MICs and FICI values of combination of the essential oils and lauric acid against S.aureus

不同的抑菌物聯(lián)合使用時(shí)可能會產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。三種植物精油與月桂酸聯(lián)合作用對金黃色葡萄球菌的抑菌效果如表2所示，其中丁香油-月桂酸的FICI為0.50，表現(xiàn)為協(xié)同作用，薄荷油-月桂酸和百里香油-月桂酸表現(xiàn)為相加作用。Kim等[9]的研究指出，百里香酚-月桂酸聯(lián)合處理對大腸桿菌 O157:H7表現(xiàn)出協(xié)同殺菌作用，0.50+1.00 mmol/L和1.00+1.00 mmol/L的處理使細(xì)菌數(shù)量由 7.54 lg CFU/mL降至 0.43 lg CFU/mL或無法檢測。百里香酚是百里香油的主要成分，二者作用效果存在差異，且金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157:H7的細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同。Gomori等[19]證實(shí)百里香油中百里香酚比例的下降，導(dǎo)致精油的抗菌和抗生物膜形成能力的變化，并且與微生物的類型也有關(guān)系。本研究揭示了丁香油和月桂酸對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）的協(xié)同抑制作用。

2.2 丁香油、月桂酸及其協(xié)同組合對金黃色葡萄球菌生長的影響

生長曲線結(jié)果如圖1所示。從時(shí)間-殺菌動力學(xué)曲線上可以觀察到，丁香油、月桂酸聯(lián)合處理時(shí)，金黃色葡萄球菌的數(shù)量比單獨(dú)使用丁香油、月桂酸時(shí)有所減少。對照組24 h后細(xì)菌數(shù)量增加至9 lg CFU/mL左右。丁香油或月桂酸單獨(dú)處理時(shí)，對金黃色葡萄球菌的抑制作用有限，當(dāng)兩種抑菌物聯(lián)合處理時(shí)，對金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用。低濃度聯(lián)合處理（1/4 MIC+1/4 MIC）作用8 h后，細(xì)菌數(shù)量下降2～3 lg CFU/mL，然后逐漸增加，24 h恢復(fù)到初始濃度。高濃度聯(lián)合處理（1/2 MIC+1/2 MIC），2 h內(nèi)細(xì)菌數(shù)量降至檢測不到。結(jié)果證實(shí)了丁香油、月桂酸組合對金黃色葡萄球菌的協(xié)同抗菌效果。我們的結(jié)果與 Purkait等[5]的研究一致，兩種物質(zhì)聯(lián)合抑菌效果優(yōu)于單一成分抑菌效果。

2.3 細(xì)胞膜通透性的影響

260 nm和280 nm處的吸光度被廣泛用作核酸和蛋白質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)滲漏到細(xì)胞外的標(biāo)志[20，21]。如表3所示，丁香油和月桂酸單獨(dú)處理金黃色葡萄球菌時(shí)，260 nm和280 nm處的吸光度與對照組無顯著差異。經(jīng)1/2 MIC+1/2 MIC處理的金黃色葡萄球菌的核酸和蛋白質(zhì)釋放量較對照組顯著增加，260 nm、280 nm處的吸光值分別由1.64、1.71升高至1.81、2.28，表明核酸和蛋白質(zhì)的漏出量是各處理中最高的。Cui等[20]的研究表明，丁香油處理后細(xì)菌結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變，核酸泄漏，260 nm吸光度增加。當(dāng)不同濃度的月桂酸處理細(xì)胞時(shí)，與陰性對照相比，核酸泄漏的量也明顯增加，260 nm處吸光度的增加證明了這一點(diǎn)[22]。同樣，丁香油和封裝大氣壓等離子體聯(lián)合使用對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的280 nm處吸光度比對照組或兩種物質(zhì)單獨(dú)處理組的吸光度高[23]。因此，丁香油和月桂酸聯(lián)合使用，二者協(xié)同損傷細(xì)胞膜，增加細(xì)胞膜的通透性，從而導(dǎo)致更多的核酸和蛋白質(zhì)泄漏。

表3 金黃色葡萄球菌大分子內(nèi)容物滲漏Table 3 Leakage of macromolecule content of S.aureus

細(xì)胞膜是細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)各種離子和無機(jī)鹽的通道，當(dāng)細(xì)胞膜受損滲透性改變時(shí)，電解質(zhì)溢出胞外，因此可以通過測量培養(yǎng)液電導(dǎo)率的變化來反映細(xì)胞膜的損傷程度[24]。丁香油和月桂酸聯(lián)合處理金黃色葡萄球菌時(shí)，電導(dǎo)率的變化如圖2所示。經(jīng)丁香油、月桂酸混合溶液處理后，隨著時(shí)間的延長，培養(yǎng)液電導(dǎo)率逐漸增加。隨著丁香油和月桂酸濃度的增加，電導(dǎo)率也增加。與對照組相比，經(jīng)低、高濃度丁香油、月桂酸協(xié)同處理組電導(dǎo)率由2.50%升高至12.20%、29.50%。同樣，丁香油、月桂酸單獨(dú)使用時(shí)，對金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜的影響有限。對照組培養(yǎng)液中電導(dǎo)率的微小變化可能與細(xì)胞的正常溶解和死亡有關(guān)[17]。一些研究表明，丁香油和月桂酸顯著影響細(xì)胞膜，引起細(xì)胞溶解，導(dǎo)致細(xì)胞完整性喪失和細(xì)胞膜通透性增加，這與我們的研究結(jié)果一致[20，25]。細(xì)胞膜是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)（如核酸、蛋白質(zhì)和多種離子）通過的屏障，這些物質(zhì)是促進(jìn)細(xì)胞膜功能所必需的[26]。因此，細(xì)胞膜損傷引起的核酸、蛋白質(zhì)和多種離子的外泄可造成細(xì)菌的死亡[27]。

2.4 生鮮米粉保鮮效果評價(jià)

菌落總數(shù)是衡量食品是否安全衛(wèi)生的重要指標(biāo)，我國現(xiàn)有的食品標(biāo)準(zhǔn)基本上均對菌落總數(shù)有明確要求。各組生鮮米粉的菌落總數(shù)變化如圖3所示。從結(jié)果可以看出，在貯藏72 h期間，對照組生鮮米粉的菌落總數(shù)在 24 h內(nèi)超過了規(guī)定的安全限值（5.48 lg CFU/g）[12]，與對照組相比，處理組生鮮米粉的細(xì)菌數(shù)量緩慢增加，菌落總數(shù)超過規(guī)定限值的時(shí)間為72 h，表明抑菌保鮮液對生鮮米粉中微生物的生長有抑制作用。從初始細(xì)菌數(shù)量看，處理組生鮮米粉的初始菌落數(shù)比對照組的低至少1.5 lg CFU/g，表明抑菌保鮮液浸泡可以顯著降低生鮮米粉的初始細(xì)菌量，對生鮮米粉中的微生物有良好的抑制及殺滅作用。Dunn等[28]的研究表明，丁香油或百里香油乳劑可有效減少辣椒上沙門氏菌的交叉污染，多數(shù)情況下沙門氏菌數(shù)量低于檢測限（1 CFU/10 g；p＜0.05），可作為采后農(nóng)產(chǎn)品清洗系統(tǒng)中氯的合適替代品。同樣，Tangwatcharin和Khopaibool[29]發(fā)現(xiàn)將月桂酸、月桂酸單甘油酯以及乳酸聯(lián)合使用時(shí)，可顯著抑制鮮豬里脊中金黃色葡萄球菌以及菌落總數(shù)的生長。

圖4為在4 ℃下，72 h貯藏時(shí)間內(nèi)生鮮米粉中金黃色葡萄球菌的生長變化情況。對照組中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)呈現(xiàn)先減少后增加趨勢，這可能是金黃色葡萄球菌在適應(yīng)新環(huán)境時(shí)產(chǎn)生的滯后現(xiàn)象[30]。在貯藏終點(diǎn)，對照組金黃色葡萄球菌菌落數(shù)增加至 7.96 lg CFU/g。在72 h貯藏期內(nèi)，處理組金黃色葡萄球菌菌落數(shù)低于對照組，貯藏期間處理組菌落數(shù)降低了1.65 lg CFU/g。此外，與對照組相比，處理組的金黃色葡萄球菌初始菌落數(shù)降低了0.92 lg CFU/g。由Oliveira等人[31]的研究可知，丁香油對金黃色葡萄球菌有較好的抑制效果，且與濃度成比例。Kelsey等[32]的研究表明，月桂酸能有效抑制金黃色葡萄球菌的生長。

酸度是評價(jià)生鮮米粉品質(zhì)的主要指標(biāo)之一，食品中酸度值的增加會對感官質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。圖5a展示了生鮮米粉在儲藏過程中酸度值的變化。在儲藏的前24 h內(nèi)，各組生鮮米粉的酸度均保持相對穩(wěn)定。24 h后，對照組的酸度值至少增加0.8 °T，而處理組生鮮米粉的酸度值變化不大。值得注意的是，隨著儲藏時(shí)間的不斷延長，生鮮米粉的酸度值與細(xì)菌數(shù)量呈正相關(guān)，表明微生物是生鮮米粉腐敗變質(zhì)的主要決定因素。在富含碳水化合物的食品中，由于微生物的活動，食品中的酸度變化是常見的，它們消耗碳水化合物并利用新陳代謝來產(chǎn)酸和降低pH[12]。Li等[33]研究發(fā)現(xiàn)新鮮面條在儲藏過程中pH值持續(xù)下降，pH值與菌落總數(shù)呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01）。此外，Angiolillo等[34]的研究表明，不加任何添加劑的意大利面因微生物腐敗，會出現(xiàn)pH下降和大腸菌群增加。這些結(jié)果表明，抑菌保鮮液處理可以通過抑制細(xì)菌的生長來控制酸度值的增加。

感官特性是食品變質(zhì)的最直接反映，隨著儲存時(shí)間的增加，食品的顏色、外觀、氣味、口感和質(zhì)地逐漸發(fā)生不可接受的變化。每組生鮮米粉的感官得分如圖5b所示，對照組生鮮米粉的氣味平均得分最低，處理組生鮮米粉的顏色平均得分最高。另外，各組生鮮米粉樣品在儲藏過程中質(zhì)地和外觀的平均得分變化不大。所有特征的平均得分都在可接受閾值以上。結(jié)果表明，72 h后，處理組生鮮米粉的感官品質(zhì)和可接受性均高于對照組。在碳水化合物和蛋白質(zhì)含量較高的食品中，由于微生物作用造成食品品質(zhì)劣變是較為常見現(xiàn)象，其中包括微生物大量增殖、發(fā)酵產(chǎn)酸、pH值下降等。因此本文分析，經(jīng)過抑菌保鮮液處理的生鮮米粉，是通過抑制其中微生物的生長，進(jìn)而保持了生鮮米粉的品質(zhì)。

綜合菌落總數(shù)、金黃色葡萄球菌菌落數(shù)、酸度值、感官評分等評價(jià)指標(biāo)，在4 ℃下貯藏72 h，丁香油和月桂酸抑菌保鮮液處理對生鮮米粉有較好的保鮮效果，對其中金黃色葡萄球菌的生長具有良好的抑制作用。

3 結(jié)論

3.1 丁香油、薄荷油、百里香油及月桂酸對金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用。且丁香油和月桂酸組合，對金黃色葡萄球菌具有協(xié)同抑制作用。細(xì)胞膜通透性的測定結(jié)果表明，丁香油與月桂酸協(xié)同作用，可影響細(xì)胞膜，導(dǎo)致通透性增加，胞內(nèi)物質(zhì)滲漏，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

3.2 丁香油（2 μg/mL）和月桂酸（9 μg/mL）抑菌保鮮液處理生鮮米粉，可抑制生鮮米粉表面微生物的生長，對其中金黃色葡萄球菌的生長具有較好的抑制效果，延緩酸度值的增加，維持較好的感官品質(zhì)，使生鮮米粉貨架期延長了近48 h，有可能成為生鮮米粉或其他生鮮產(chǎn)品的可替代復(fù)合保鮮液。