冷凍期間豬肌內(nèi)脂肪氧化及肌纖維蛋白凝膠性能的差異分析

尉立剛，孫文艷，范三紅，李倩，楊鈺昆，郭彩霞

（山西大學生命科學學院，山西 太原 030006）

豬肉，作為我國肉類消費的主體，是人們?nèi)粘ｏ嬍持兄匾慕M成部分。統(tǒng)計顯示：2018年我國豬肉的消費量高達6.90億頭[1]，占肉類總產(chǎn)量的63.45%。冷凍儲藏，作為一種經(jīng)濟便捷的保存方法，在肉類產(chǎn)業(yè)中廣泛應用[2]。但是，原料肉在低溫凍藏過程中，其蛋白質(zhì)和脂肪將會發(fā)生一定程度的氧化，導致其品質(zhì)下降[3]。

目前，關(guān)于原料肉在凍藏過程中理化性質(zhì)的改變已引起國內(nèi)外相關(guān)學者的關(guān)注。李倩等人[3]研究了低溫凍藏時間對原料豬肉中肌原纖維蛋白氧化程度的影響，結(jié)果表明：隨凍藏時間的延長，豬肉中肌原纖維蛋白的羰基含量顯著增加，而內(nèi)源性色氨酸熒光、總巰基和表面疏水性顯著下降（p<0.05）。趙鉅陽等[4]調(diào)查了冷凍儲存時間對生豬肉品質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨凍藏時間的增加，生豬肉中可溶性蛋白質(zhì)和彈性顯著降低，而POV、TBARS以及游離氨基酸的含量呈現(xiàn)升高趨勢。此外，隨凍藏時間延長，生豬肉中的風味物質(zhì)差異顯著。因此，生豬肉的品質(zhì)隨著凍藏時間的延長而顯著下降，尤其是凍藏120 d后，其品質(zhì)下降明顯。Brewer等[5]調(diào)查了凍藏時間對真空包裝的豬肉中脂肪氧化的影響后發(fā)現(xiàn)：豬肉中脂肪氧化程度隨凍藏時間的延長而顯著增加。以上研究多集中在原料肉凍藏過程中蛋白質(zhì)氧化、可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸以及原料肉脂肪氧化等方面，而很少涉及到冷凍時間對豬肌內(nèi)脂肪及肌原纖維蛋白凝膠性能影響的相關(guān)報道。

試驗擬以新鮮豬肉為研究對象，-18 ℃下分別凍藏0、1、4、8、12周后，探究冷凍時間對豬肌內(nèi)脂肪和肌原纖維蛋白溶解度、保水性、凝膠白度及強度的影響，以期為豬肉冷凍過程中肌內(nèi)脂肪及肌原纖維蛋白凝膠性能的改變提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

將屠宰后 24 h的豬脊肉（大白豬，180日齡，pH=5.8，亮度值：42.7，紅度值：3.7，黃度值：7.3）置于冰盒中保藏；乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA），上海羅恩試劑有限公司；1,4-哌嗪二乙磺酸（PIPES，純度98%），北京索萊寶科技有限公司；硫代巴比妥酸（TBA，分析純），天津市光復精細化工研究所；氯仿、甲醇、正己烷、鹽酸、氫氧化鉀，分析純，天津市凱通化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Starter2100型pH計，上海奧豪斯儀器有限公司；QT-1型渦旋振蕩器，上海琪特分析儀器有限公司；NS800型分光測色儀，深圳市三恩時科技有限公司；DZ-400/2SK型真空包裝機，上海青葩食品包裝機械有限公司；GC-2010型氣相色譜儀，日本島津公司；Agilent1100型液相色譜儀，安捷倫科技（中國）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 豬脊肉的凍藏

將上述置于冰盒的豬外脊肉運抵試驗室，隨后剔盡脂肪組織，垂直于肌纖維紋路的方向?qū)⒇i脊肉分割成100 g左右的肉塊，封裝后在-18 ℃分別凍藏0、1、4、8和12周，以備肌原纖維蛋白的提取及以下理化指標的測定。

1.2.2 肌原纖維蛋白的提取

依據(jù)Yu等[6]的方法，對肌原纖維蛋白進行提取。將上述凍藏的豬肉在4 ℃下解凍，切割成條狀，按1:4（g/mL）的比例加磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L磷酸鈉，0.1 mol/L氯化鈉，2 mmol/L氯化鎂，1 mmol/L EGTA，pH=7.0），置于均質(zhì)機均質(zhì)60 s，隨后，在3340 r/min離心15 min，棄上清液，重復上述操作三次。按1:4（g/mL）的比例加入0.1 mol/L的NaCl溶液，攪拌，用0.1 mol/L的HCl調(diào)pH至6.25，用四層紗布過濾，離心棄上清液，得肌原纖維蛋白。以BSA為標準品，雙縮脲法測定肌原纖維蛋白濃度。

1.2.3 肌原纖維蛋白中殘余脂肪氧化值的測定

肌原纖維蛋白中殘余脂肪的氧化程度參照Yu等[7]的方法進行測定。稱2.0 g左右的肌原纖維蛋白于50 mL燒杯中，隨后加入3 mL 1%的TBA溶液（0.075 mol/L的NaOH為溶劑）和17 mL 2.5%的TCA溶液（0.036 mol/L的HCl為溶劑），混勻后移至比色管，加熱煮沸0.5 h，冷卻至室溫。隨后，取10 mL上清液于25 mL比色管中，加入10 mL氯仿，渦旋儀振蕩混勻，在4500 r/min下離心15 min。取6 mL上清液，加入3 mL石油醚，渦旋儀振蕩混勻，在上述相同轉(zhuǎn)速下離心，取下層液在532 nm處測定吸光度。同時以2 mL的PIPES溶液（15 mmol/L）代替樣品作試驗空白。肌原纖維蛋白中殘余脂肪的TBARS按公式(1)計算。

式中：

A1——樣品的吸光度；

A2——空白的吸光度；

m——肌原纖維蛋白的質(zhì)量，g。

1.2.4 肌原纖維蛋白溶解度的測定

依據(jù)曹云剛等[8]的研究方法對肌原纖維蛋白的溶解度進行測定。用15 mmol/L的PIPES緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH=6.25）將提取出的肌原纖維蛋白稀釋為2 mg/mL，攪拌60 min（4 ℃），4500 r/min離心0.5 h。吸取1 mL上清液，加入4 mL堿性酒石酸銅溶液，37 ℃水浴中反應0.5 h，540 nm比色，同時以蒸餾水做空白。蛋白溶解度按公式（2）計算。

式中：

C1——上清液液中肌原纖維蛋白濃度，mg/mL；

C2——肌原纖維蛋白濃度，mg/mL。

1.2.5 肌原纖維蛋白凝膠的制備

凝膠的制備方法參照曹云剛等人[8]的描述。首先，將肌原纖維蛋白用15 mmol/L的PIPES緩沖液稀釋至30 mg/mL，隨后分別稱取稀釋過的肌原纖維蛋白約5.0 g于10 mL燒杯（測定肌原纖維蛋白的保水性）中，約30 g于50 mL燒杯（測定肌原纖維蛋白的白度及凝膠強度）中，保鮮膜密封燒杯，在程序升溫水浴鍋中以10 ℃/min的升溫速率從25 ℃加熱至75 ℃，保持20 min，隨后冰浴中冷卻0.5 h，以備保水性、白度和凝膠強度的測定。

1.2.6 肌原纖維蛋白凝膠保水性的測定

參照賈娜等[9]的方法對凝膠保水性進行測定。具體如下：將上述制備的凝膠（約5.0 g）放入50 mL離心管（m1），離心10 min（3000 r/min，4 ℃），隨后將離心管倒置于濾紙上20 min，稱重（m3）。凝膠保水性按公式（3）計算。

式中：

m1——離心前肌原纖維蛋白凝膠樣品的質(zhì)量，g；

m2——離心管的質(zhì)量，g；

m3——經(jīng)吸水后凝膠和離心管的質(zhì)量，g。

1.2.7 肌原纖維蛋白凝膠白度的測定

參照夏秀芳等人[10]的方法對凝膠白度進行測定。將上述制備的肌原纖維蛋白凝膠置于室溫下平衡 30 min。采用 3nh分光測色儀對樣品的白度進行測定，記錄L*、a*和b*值。凝膠白度按公式（4）計算。

式中：

L*——亮度值；

a*——紅度值（正、負值分別表示偏紅、偏綠）；

b*——黃度值（正、負值分別表示偏黃、偏藍）。

1.2.8 肌原纖維蛋白凝膠強度的測定

參照曹云剛等人[8]的方法對肌原纖維蛋白的凝膠強度進行測定。將上述制備的肌原纖維蛋白凝膠在25 ℃下平衡 30 min，用濾紙吸去樣品表面水分，用TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀對蛋白凝膠強度進行測定。儀器的參數(shù)為：圓柱塑膠探頭（TMS 25.4 mm），測試速度：30 mm/min，起始力：0.050 N；穿刺距離：4 mm；回升距離：50 mm。探頭刺破凝膠所需壓力即為肌原纖維蛋白的凝膠強度。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

試驗均設(shè)為三次重復（不同日期），結(jié)果用均值±標準偏差的形式表示。試驗數(shù)據(jù)用Statistix 9.0軟件進行方差分析和顯著性分析（LSD法），文章中的圖均用Origin 8.5進行繪制，試驗結(jié)果中的不同字母代表差異顯著（p<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷凍時間對肌原纖維蛋白中殘余脂肪氧化的影響

如圖1所示，在原料豬肉凍藏0~12周的時間中，肌原纖維蛋白中殘余脂肪的TBARS值呈現(xiàn)上升趨勢。在凍藏1周時，與新鮮的豬肉相比，肌原纖維蛋白中殘余脂肪的 TBARS值未見顯著變化（p>0.05），其TBARS值為0.07 mg/kg蛋白。凍藏4周時，脂肪的TBARS值為0.17 mg/kg蛋白。隨凍藏時間的持續(xù)增加（12周），TBARS值增至0.22 mg/kg蛋白（p<0.05）。因此，隨原料肉凍藏時間延長，肌內(nèi)脂肪的氧化程度不斷加劇。趙鉅陽等[4]認為生豬肉TBARS升高主要是由于凍藏期間肉中水分緩慢升華，使得水分原來的空間更易被氧氣所占據(jù)，導致原料肉氧化，TBARS升高。Igene等[11]對凍藏的雞胸肉中丙二醛的濃度進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞肉在凍藏后期，丙二醛的濃度顯著升高，因此，凍藏期間丙二醛濃度增大很可能是導致本研究中TBARS值升高的原因，這與Vivien等[12]的研究結(jié)果基本一致。

2.2 冷凍時間對肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響

如圖2所示，隨凍藏時間的延長，肌原纖維蛋白凝膠的保水性顯著下降（p<0.05）。與新鮮原料肉相比（46.67%），經(jīng) 4周凍藏之后，其凝膠保水性降至36.60%（p<0.05）。隨冷凍時間的持續(xù)增加（12周），肌原纖維蛋白的凝膠保水性降至 33.57%（p<0.05）。原料肉在冷凍的過程中，肌原纖維蛋白不可避免地將會發(fā)生氧化[3]。賈娜等[9]研究顯示：氧化后的肌原纖維蛋白，其三維立體網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)遭到破壞，導致肌原纖維蛋白束水力和凝膠網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的致密型有所降低，保水性下降。因此，凍藏過程中肌原纖維蛋白的氧化可能是導致其凝膠保水性降低的原因之一。

2.3 冷凍時間對肌原纖維蛋白溶解度的影響

如圖3所示，隨凍藏時間的延長，原料肉中肌原纖維蛋白的溶解度呈顯著下降趨勢（由56.08%下降到35.92%）。與新鮮肉中的肌原纖維蛋白相比，經(jīng) 1周凍藏之后，肌原纖維蛋白的溶解度有所下降，但不顯著（p>0.05），且凍藏1周時的肌原纖維蛋白的溶解度是 49.68%。隨凍藏時間增加（8周），肌原纖維蛋白的溶解度降至 37.20%（p<0.05）。Sompongse等[13]對凍藏期間肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性進行研究，結(jié)果提示凍藏過程中肌原纖維蛋白中的巰基會氧化成二硫鍵，導致肌原纖維蛋白的重鏈發(fā)生一定程度的聚合，致使溶解度下降。此外，溶解度下降的另一個原因可能是在凍藏過程中肌原纖維蛋白發(fā)生氧化[3]，導致原先隱藏的疏水基團發(fā)生暴露，進而誘導了疏水相互作用的發(fā)生，使得原料肉中肌原纖維蛋白的溶解度下降[8]。

2.4 冷凍時間對肌原纖維蛋白凝膠強度的影響

如圖4所示，隨著凍藏時間的延長，肌原纖維蛋白的凝膠強度整體呈下降趨勢。與新鮮原料肉相比較，經(jīng)8周凍藏后，肌原纖維蛋白的凝膠強度由0.25降低至0.14（p<0.05）。原料肉在低溫凍藏過程中，脂肪和肌原纖維蛋白將會發(fā)生氧化，導致肌原纖維蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，使得肌原纖維蛋白分子間的作用力和氫鍵作用被削弱，導致熱誘導后所生成的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不致密，保水性下降，從而致使肌原纖維蛋白凝膠強度下降[14]。此外，凍藏過程中氧化所導致的肌原纖維蛋白溶解度下降，促使參與成膠的蛋白量減少，可能也是導致肌原纖維蛋白凝膠強度下降的原因[15]。

2.5 冷凍時間對肌原纖維蛋白凝膠白度的影響

從圖5中得知，隨凍藏時間延長，肌原纖維蛋白的凝膠白度值整體呈下降趨勢。與新鮮原料肉相比，經(jīng)12周凍藏后，肌原纖維蛋白的白度值由59.71降至26.53（p<0.05）。Xia等[16]研究顯示脂肪氧化將會導致過氧自由基含量的增加，從而誘發(fā)蛋白質(zhì)氧化，形成的氧化產(chǎn)物與氨基酸側(cè)鏈發(fā)生非酶促反應，導致肌原纖維蛋白的白度值下降。因此，凍藏期間肌內(nèi)脂肪以及肌原纖維蛋白的氧化將會導致凝膠白度的下降。此外，脂肪氧化所引起的肌原纖維蛋白與色素蛋白發(fā)生交聯(lián)也可能是凝膠白度下降的原因之一[17]。

2.6 相關(guān)性分析

由表1可知，凍藏時間與TBARS呈極顯著正相關(guān)（p<0.01），與溶解度、凝膠保水性、凝膠白度以及凝膠強度呈極顯著負相關(guān)（p<0.01），由此推斷凍藏時間對TBARS、溶解度、凝膠保水性、凝膠白度及強度有較大影響。TBARS與溶解度、凝膠保水性、凝膠白度及凝膠強度呈極顯著負相關(guān)（p<0.01）；溶解度與凝膠保水性和凝膠白度呈極顯著正相關(guān)（p<0.01），與凝膠強度呈顯著正相關(guān)（p<0.05）；凝膠保水性與凝膠白度和強度呈極顯著正相關(guān)（p<0.01）；凝膠白度與凝膠強度呈極顯著正相關(guān)（p<0.01）。這個結(jié)果進一步表明：凍藏時間對原料肉肌內(nèi)脂肪和肌原纖維蛋白的凝膠性能影響較大。

表1 豬肉中理化性質(zhì)的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of physical and chemical properties in pork

凍藏時間對豬肌內(nèi)脂肪和肌原纖維蛋白的凝膠性能影響也可用各指標之間的LDA分析來評估。通常，從原點開始，通過與測量指標之間形成向量，兩個向量之間的相關(guān)性可通過它們之間夾角的余弦值來確定[18]。如圖6所示，在TBARS與溶解度、凝膠保水性、凝膠白度以及凝膠強度之間都為鈍角矢量角，這表明這些指標之間呈現(xiàn)負相關(guān)，說明隨肌內(nèi)脂肪氧化程度的加劇，肌原纖維蛋白的溶解度、凝膠保水性、凝膠白度以及凝膠強度都顯著下降。凝膠保水性、溶解度、凝膠白度以及凝膠強度之間呈銳角矢量角，這個結(jié)果表明這些指標之間呈現(xiàn)正相關(guān)。因此，肌原纖維蛋白溶解度的下降可能也是導致凝膠保水性、凝膠白度和凝膠強度下降的原因。

3 結(jié)論

試驗主要研究了冷凍時間對豬肌內(nèi)脂肪氧化及肌原纖維蛋白凝膠性能的影響。結(jié)果表明：隨凍藏時間的增加，肌內(nèi)脂肪氧化程度增加，肌原纖維蛋白的溶解度、凝膠保水性、凝膠白度以及凝膠強度均呈下降趨勢。這些指標之間的相關(guān)性及LDA分析結(jié)果表明：凍藏所導致的肌內(nèi)脂肪氧化可能是肌原纖維蛋白溶解度、保水性、凝膠白度及凝膠強度下降的原因之一。因此，在原料肉低溫凍藏過程中，控制肌內(nèi)脂肪氧化對保證原料肉的品質(zhì)尤為重要。