甜菜堿提高LO2細(xì)胞中抗氧化酶的表達(dá)水平

張猛猛，辛璇，賴富饒，吳暉

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640）

甜菜堿（BET）是一種廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中的季胺堿類物質(zhì)，其可作為甲基供體參與蛋氨酸循環(huán)，也可作為滲透調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，目前被廣泛應(yīng)用于食品添加劑、制藥、飼料、日化等領(lǐng)域。由于合成甜菜堿的能力有限，人類需要通過食用富含甜菜堿的食物（如谷物、菠菜等）獲取甜菜堿[1]。一般來(lái)說日常飲食攝入的甜菜堿即可滿足身體所需，但有研究發(fā)現(xiàn)額外補(bǔ)充甜菜堿能夠預(yù)防和輔助治療多種疾病，尤其是對(duì)由疾病、藥物、酒精等多種因素引起的肝損傷有一定的保護(hù)作用[2]。其中的機(jī)制主要和甜菜堿的抗氧化能力密切相關(guān)[3，4]。與常見天然抗氧化劑不同的是，甜菜堿并無(wú)直接的自由基清除能力，其主要通過增強(qiáng)機(jī)體自身的抗氧化能力來(lái)發(fā)揮抗氧化功能[5]。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、過氧化氫酶（CAT）等組成的抗氧化酶系統(tǒng)是機(jī)體抗氧化防御體系的重要組成部分。已有很多文獻(xiàn)報(bào)道甜菜堿能夠提高機(jī)體內(nèi)SOD、GPx、CAT等抗氧化酶的酶活和表達(dá)水平[6，7]，但其中的機(jī)制尚不清楚。事實(shí)上，甜菜堿因卓越的抗氧化能力，在水果保鮮、畜牧養(yǎng)殖等領(lǐng)域也展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用價(jià)值。隨著甜菜堿的應(yīng)用潛力和研究?jī)r(jià)值越來(lái)越被人們所關(guān)注，解析甜菜堿增強(qiáng)抗氧化酶表達(dá)的機(jī)制，不僅能夠深化對(duì)甜菜堿保護(hù)肝臟等功能的認(rèn)識(shí)，還能為甜菜堿進(jìn)一步的研究與應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激的主要通路是轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子 2(Nrf2)-Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)-抗氧化反應(yīng)元件（ARE）通路。該通路能夠調(diào)控抗氧化酶系及Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，以清除過多的活性氧（ROS）造成的氧化應(yīng)激。近些年來(lái)，該通路還被發(fā)現(xiàn)可作為藥物靶點(diǎn)，應(yīng)用于由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的疾病的預(yù)防和治療中[8]。筆者在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，甜菜堿能夠提高處于正常狀態(tài)下的人體肝細(xì)胞LO2細(xì)胞中SOD、CAT等抗氧化酶的酶活[7]，但還不清楚Nrf2-Keap1-ARE通路在其中的作用。本研究擬通過探究甜菜堿對(duì) LO2細(xì)胞抗氧化酶表達(dá)水平的影響，及該影響與 Nrf2-Keap1-ARE通路的關(guān)系，來(lái)揭示甜菜堿提高抗氧化酶表達(dá)水平的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜菜堿（98%純度）購(gòu)自阿拉丁試劑（上海）有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、CCK-8試劑購(gòu)自南京建成生物工程研究所；細(xì)胞核蛋白質(zhì)提取試劑盒、UNIQ-10柱式總 RNA抽提試劑盒、AMV第一鏈cDNA合成試劑盒、2×SG Fast qPCR Master Mix試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；人轉(zhuǎn)錄因子 NF-E2相關(guān)因子 2(Nrf2) ELISA試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher公司；Nrf2、pNrf2、Keap1以及β-actin等蛋白的抗體購(gòu)自Abcam公司；PD98059、LY294002、SP600125、SB203580、GF109203X、Compound C購(gòu)自MCE (MedChemExpress)公司；LO2細(xì)胞系，本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM培養(yǎng)基、胰酶購(gòu)自GIBCO公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)Applied Biosystems公司；Infinite M1000 Pro酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞毒性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LO2細(xì)胞，以1×104cells/孔的數(shù)量接種于96孔板，用DMEM培養(yǎng)液（1%雙抗、10%胎牛血清）在5% CO2，37 ℃條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。去除上清液，加入100 μL含不同濃度甜菜堿的新鮮培養(yǎng)液（62.5、125、250、500、1000 μmol/L），以正常培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照。12 h后棄去含藥培養(yǎng)液，加入100 μL含10% CCK8試劑的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后于450 nm處測(cè)每孔的吸光值。細(xì)胞存活率按以下公式計(jì)算：

細(xì)胞存活率/%=As/Ac×100%

式中：

As——樣品的吸光值；

Ac——陰性對(duì)照的吸光值。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QPCR）

將LO2細(xì)胞配成濃度為1×105cells/mL的細(xì)胞懸液后接種于6孔板，每孔3 mL。培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的甜菜堿（62.5、125、250、500、1000 μmol/L）。12 h后，收集并裂解細(xì)胞，使用UNIQ-10柱式總 RNA抽提試劑盒提取 LO2細(xì)胞總RNA，使用AMV第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用2×SG Fast qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參，結(jié)果用2-ΔΔCt表示。SOD、CAT、GPx、Nrf2、Keap1、β-actin等的引物序列見表1。

表1 所用引物序列Table 1 The primer sequence

1.3.3 甜菜堿對(duì) Nrf2-Keap1-ARE通路中相關(guān)蛋白水平的影響

將LO2細(xì)胞配成濃度為1×105cells/mL的細(xì)胞懸液后接種于10 cm培養(yǎng)皿，每皿10 mL。培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)基，加入250 μmol/L甜菜堿處理12 h。然后收集細(xì)胞，每20 μL細(xì)胞沉淀加入200 μL漿蛋白抽提試劑，冰浴孵育10 min，然后4 ℃條件下12000 r/min離心10 min，上清液為細(xì)胞漿蛋白，沉淀為細(xì)胞核。收集細(xì)胞核沉淀，加入50 μL核蛋白抽提試劑，冰浴10 min，然后于4 ℃條件下12000 r/min離心10 min，所得上清液即為細(xì)胞核蛋白。用 BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞核蛋白中蛋白質(zhì)含量，然后利用Nrf2 ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞核提取物中可與ARE位點(diǎn)結(jié)合的Nrf2蛋白的含量。

細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的相對(duì)水平=C樣品/C對(duì)照

式中：

C樣品——甜菜堿處理組細(xì)胞核內(nèi)的Nrf2蛋白含量，pg/mg蛋白；

C對(duì)照——對(duì)照組細(xì)胞核內(nèi)的Nrf2蛋白含量，pg/ mg蛋白。

按上述條件處理細(xì)胞，使用 NP40裂解細(xì)胞，然后4 ℃條件下12000 r/min離心10 min，收集上清液。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞裂解液中蛋白質(zhì)含量。利用SDS-PAGE分離細(xì)胞裂解液中的蛋白，再將蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上。將膜與 Nrf2、pNrf2、Keap1以及β-actin抗體4 ℃孵育過夜，再與二抗室溫孵育1 h。最后利用特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)蛋白條帶，利用Image J軟件檢測(cè)蛋白條帶灰度值。

蛋白質(zhì)相對(duì)水平=G樣品/G對(duì)照

式中：

G樣品——甜菜堿處理組細(xì)胞內(nèi)的Nrf2與β-actin蛋白條帶灰度值之比；

C對(duì)照——對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)的Nrf2與β-actin蛋白條帶灰度值之比。

1.3.4 激酶抑制劑對(duì)甜菜堿提高抗氧化酶mRNA水平的影響

分別往鋪有細(xì)胞的6 cm培養(yǎng)皿加入250 μmol/L的甜菜堿和不同激酶抑制劑（1 μmol/L PD98059、1 μmol/L LY294002、1 μmol/L SP600125、1 μmol/L SB203580、 2.5 μmol/L GF109203X 、 1 μmol/L Compound C），以不加抑制劑的甜菜堿處理組為對(duì)照，處理12 h后收集細(xì)胞，提取RNA，檢測(cè)Nrf2、Keap1和三種抗氧化酶的mRNA水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示，使用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）并進(jìn)行多組之間均數(shù)的差異性檢驗(yàn)，p＜0.05時(shí)認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 甜菜堿對(duì)LO2細(xì)胞中抗氧化酶表達(dá)的影響

如圖1所示，在250～1000 μmol/L甜菜堿處理12 h后，細(xì)胞內(nèi)的SOD、GPx和CAT等抗氧化酶的mRNA水平顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），最高分別提高了1.08、0.51、0.88倍。這與Yu等人[9]在羊羔體內(nèi)、Elsheikh等人[10]在小鼠體內(nèi)的研究結(jié)果接近，但顯著低于 Cai等人[6]在湖羊體內(nèi)的檢測(cè)結(jié)果。這一結(jié)果的差異可能在于不同的研究所使用的模型、檢測(cè)的組織部位、甜菜堿所用劑量和處理時(shí)間不同。此外，在 250～1000 μmol/L的劑量?jī)?nèi)，SOD、GPx和CAT的mRNA水平并沒有隨著濃度的增加而提高，這表明甜菜堿對(duì)LO2細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶表達(dá)的提高作用是有限的。

需要指出的是，當(dāng)細(xì)胞或組織處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，甜菜堿能否通過提高抗氧化酶的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗氧化功能還存在著一定的爭(zhēng)議。其原因是有的研究發(fā)現(xiàn)甜菜堿能夠提高抗氧化酶的表達(dá)，但也有研究表明甜菜堿對(duì)抗氧化酶的表達(dá)無(wú)顯著影響，甚至有抑制作用[5]。有研究認(rèn)為這一現(xiàn)象是甜菜堿通過非酶抗氧化物質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的結(jié)果：當(dāng)細(xì)胞處于輕度氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞會(huì)通過提高抗氧化酶的表達(dá)來(lái)抵抗氧化應(yīng)激，而甜菜堿可以通過非酶抗氧化物質(zhì)抑制氧化應(yīng)激，從而降低細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的應(yīng)答，也就是抗氧化酶表達(dá)的提高，這時(shí)甜菜堿對(duì)抗氧化酶的表達(dá)表現(xiàn)出抑制作用；當(dāng)細(xì)胞處于過度氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)凋亡程序，關(guān)閉抗氧化酶基因的表達(dá)，而甜菜堿通過非酶抗氧化物質(zhì)緩和氧化應(yīng)激，阻止過度氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡程序，從而解除凋亡程序?qū)寡趸副磉_(dá)的抑制，這時(shí)甜菜堿對(duì)抗氧化酶的表達(dá)表現(xiàn)出提高作用[5]。也就是說這些研究認(rèn)為甜菜堿主要是通過非酶抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮抗氧化功能，其可能對(duì)抗氧化酶的表達(dá)并無(wú)直接的促進(jìn)作用[5，11]。這些之前的研究在探究甜菜堿的抗氧化作用時(shí)，一般會(huì)使用H2O2、對(duì)乙酰氨基酚等物質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞或組織進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)。此時(shí)抗氧化酶水平的變化是甜菜堿和這些物質(zhì)綜合作用的結(jié)果，并不僅僅是甜菜堿本身對(duì)抗氧化酶表達(dá)的作用。本研究是以處于正常生理狀態(tài)的LO2細(xì)胞為模型，本研究的結(jié)果表明甜菜堿是能夠直接刺激細(xì)胞提高抗氧化酶的表達(dá)水平的。因此，本研究認(rèn)為，對(duì)于處于氧化應(yīng)激狀態(tài)的細(xì)胞或組織，甜菜堿也可能通過提高抗氧化酶的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗氧化作用，只是最終的抗氧化酶水平是多種因素綜合作用的結(jié)果。

2.2 甜菜堿對(duì)LO2細(xì)胞中Nrf2-Keap1-ARE通路的影響

細(xì)胞調(diào)控抗氧化酶表達(dá)的主要通路是 Nrf2-Keap1-ARE通路。在正常生理情況下，Nrf2與胞質(zhì)內(nèi) Keap1蛋白耦聯(lián)，并錨定于胞質(zhì)，使其活性處于相對(duì)抑制狀態(tài)，并且Keap1與Nrf2的耦聯(lián)能促進(jìn)Nrf2的泛素化降解，從而使細(xì)胞內(nèi)的Nrf2維持在較低水平；當(dāng)Nrf2從Nrf2-Keap1復(fù)合物中脫離，即Nrf2-Keap1-ARE通路被激活時(shí)，Nrf2蛋白的泛素化降解被抑制，Nrf2蛋白水平會(huì)升高，并由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，再與ARE結(jié)合，從而啟動(dòng)解毒酶和抗氧化酶等基因的表達(dá)[12]。因此細(xì)胞核內(nèi)能與ARE結(jié)合的Nrf2蛋白水平可以用來(lái)表征Nrf2-Keap1-ARE通路是否被激活。為了探究甜菜堿對(duì)Nrf2-Keap1-ARE通路的影響，本研究提取了經(jīng)甜菜堿處理的LO2細(xì)胞的細(xì)胞核，利用包被有ARE結(jié)合位點(diǎn)的ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白的水平。結(jié)果如圖2a所示，甜菜堿處理組內(nèi)能與ARE區(qū)域結(jié)合的Nrf2的蛋白質(zhì)水平相比于對(duì)照組提高了1.21倍（p＜0.05），這表明甜菜堿能激活Nrf2-Keap1-ARE通路。為進(jìn)一步驗(yàn)證甜菜堿對(duì)Nrf2-Keap1-ARE通路的激活，本研究還探究了細(xì)胞內(nèi)總Nrf2蛋白的水平。結(jié)果如圖2b所示。經(jīng)甜菜堿處理的LO2細(xì)胞內(nèi)，Nrf2蛋白質(zhì)水平顯著相對(duì)于對(duì)照組提高了0.80倍（p＜0.05），這進(jìn)一步表明了甜菜堿對(duì)Nrf2-Keap1-ARE通路的激活作用。鴉膽子苦醇是一種源于苦木科植物鴉膽子種子喹諾酮。由于鴉膽子苦醇能夠抑制Nrf2蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)Nrf2蛋白的降解，因此常作為Nrf2蛋白的抑制劑被用于研究 Nrf2-Keap1-ARE通路[13]。為了探究Nrf2-Keap1-ARE通路在甜菜堿提高抗氧化酶表達(dá)中的作用，本研究探究了鴉膽子苦醇對(duì)甜菜堿提高抗氧化酶表達(dá)這一作用的影響。結(jié)果如圖3所示，1 μmol/L的鴉膽子苦醇能完全抑制250 μmol/L甜菜堿對(duì)三種抗氧化酶表達(dá)的提高作用（p＜0.05）。以上結(jié)果表明甜菜堿是通過激活Nrf2-Keap1-ARE通路提高抗氧酶表達(dá)的。

一般來(lái)說，天然產(chǎn)物激活Nrf2-Keap1-ARE通路主要有以下兩種方式，一是提高Nrf2蛋白的表達(dá)水平或降低Keap1蛋白的表達(dá)水平，Nrf2/Keap1蛋白質(zhì)水平的比值越高，意味著與Keap1耦聯(lián)的Nrf2越少，處于活性狀態(tài)下的Nrf2蛋白越多。二是通過提高Nrf2蛋白的磷酸化水平，或促進(jìn)Keap1半胱氨酸巰基的化學(xué)修飾，促進(jìn) Nrf2與 Keap1解離[8，14]?？膳c Keap1半胱氨酸上的巰基通過氧化或烷基化形成共價(jià)加合物的天然產(chǎn)物大多具有親電性，這類化合物主要包括具有氧化性的酚和醌類、邁克爾反應(yīng)受體分子、異硫氰酸酯類、二硫醚和二烯丙基硫化物、含硒化合物等[15]。而甜菜堿并不具屬于這幾類物質(zhì)，也不具有親電性。Nrf2蛋白的磷酸化可由促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、蛋白激酶C（PKC）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）和腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）等激酶催化，而且這些激酶所涉及的MAPK/ERK、PI3K/Akt等信號(hào)通路還能影響Nrf2和Keap1蛋白的表達(dá)[16]。有文獻(xiàn)報(bào)道甜菜堿也可以調(diào)節(jié)PI3K、MAPK等信號(hào)通路[17，18]。因此，甜菜堿提高Nrf2蛋白水平的機(jī)制可能有以下幾種方式，一是提高Nrf2蛋白的表達(dá)水平、二是降低Keap1蛋白的表達(dá)水平，三是促進(jìn)Nrf2蛋白的磷酸化。需要指出的是，由于降低 Keap1蛋白的表達(dá)水平和促進(jìn)Nrf2蛋白的磷酸化可以通過抑制Nrf2蛋白的降解來(lái)提高細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白的水平[12]。因此圖2所展示的Nrf2蛋白水平的提高并不意味這Nrf2蛋白表達(dá)水平的提高。

2.3 甜菜堿對(duì)激活Nrf2-Keap1-ARE通路的機(jī)制

為了探究甜菜堿激活 Nrf2-Keap1-ARE通路的機(jī)制，本研究探究了甜菜堿對(duì)LO2細(xì)胞內(nèi)Nrf2和Keap1的mRNA水平的影響，以及Keap1蛋白質(zhì)水平和Nrf2蛋白磷酸化水平的影響。結(jié)果如圖4。從圖4可知，甜菜堿并未顯著影響Nrf2的mRNA水平（p＞0.05），也就是說甜菜堿可能并不是通過提高Nrf2蛋白的表達(dá)水平激活Nrf2-Keap1-ARE通路的。之前也有研究表明甜菜堿不能影響小鼠肝臟中Nrf2蛋白的表達(dá)水平[19]。還有，經(jīng)甜菜堿處理后，Nrf2蛋白的磷酸化水平并未有明顯增加，這意味著甜菜堿可能也不是通過提高 Nrf2蛋白的磷酸化水平激活Nrf2-Keap1- ARE通路。由圖4可知，經(jīng)甜菜堿處理后，LO2細(xì)胞內(nèi)Keap1的mRNA和蛋白質(zhì)水平分別下降了38.21%和49.15%（p＜0.05），這表明甜菜堿可能是通過抑制Keap1的表達(dá)水平激活Nrf2-Keap1-ARE通路的。為探究甜菜堿提高Keap1表達(dá)水平的機(jī)制與PI3K、MAPK等激酶的關(guān)系，本研究利用ERK抑制劑PD98059、PI3K/AKT抑制劑LY294002、JNK抑制劑SP600125、p38 MAPK抑制劑SB203580、PKC抑制劑GF109203X、AMPK抑制劑Compound C等抑制劑抑制激酶活性，探究了在這些激酶活性被抑制的調(diào)節(jié)下，甜菜堿對(duì)抗氧化酶和Keap1 mRNA水平的影響。結(jié)果如圖5，這些抑制劑并未影響甜菜堿對(duì)Keap1和抗氧化酶mRNA水平的作用（p＞0.05）。這意味著甜菜堿并不是通過PI3K、MAPK等信號(hào)通路影響Keap1的水平的。此外，這些激酶是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化的關(guān)鍵酶，這一結(jié)果也從側(cè)面證實(shí)甜菜堿對(duì)Nrf2-Keap1-ARE通路的激活與Nrf2蛋白的磷酸化無(wú)關(guān)。

以上結(jié)果雖然表明甜菜堿能夠降低 Keap1的表達(dá)水平，但其中的機(jī)制仍不清楚。甜菜堿是機(jī)體內(nèi)一種重要的甲基供體，可顯著影響DNA、RNA和蛋白質(zhì)的甲基化修飾。甜菜堿的很多生理活性，如降脂、抗乙肝病毒等活性都與其甲基供體的角色密切相關(guān)[20，21]。甜菜堿對(duì)機(jī)體非酶抗氧化系統(tǒng)的增強(qiáng)作用也與其作為甲基供體參與蛋氨酸循環(huán)有關(guān)[5]。常見的甲基供體除甜菜堿外，還有膽堿、蛋氨酸、s-腺苷甲硫氨酸、葉酸等。而這些甲基供體也被報(bào)道過能夠激活 Nrf2通路，其中葉酸就是通過降低Keap1 mRNA水平激活Nrf2通路的[22-25]。因此，甜菜堿激活Nrf2-Keap1-ARE通路的機(jī)制可能與其作為甲基供體的角色有關(guān)。DNA啟動(dòng)子的甲基化修飾會(huì)顯著抑制基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。已有研究報(bào)道，提高 Keap1啟動(dòng)子甲基化水平，可以降低 Keap1 mRNA的水平[12]。而甜菜堿可顯著影響DNA的甲基化修飾。已有研究報(bào)道甜菜堿能顯著提高機(jī)體某些蛋白DNA啟動(dòng)子的甲基化水平[26]。還有，Keap1 m6A RNA甲基化水平也會(huì)影響其Keap1的蛋白質(zhì)水平[27]。而甜菜堿也報(bào)道過能夠影響細(xì)胞內(nèi)RNA m6A的甲基化水平[28]。因此，甜菜堿抑制Keap1蛋白水平的機(jī)制，一方面可能涉及Keap1基因啟動(dòng)子的甲基化修飾，另一方面也可能與Keap1 mRNA的m6A甲基化有關(guān)。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道 Nrf2蛋白第437位精氨酸的甲基化修飾能夠增強(qiáng)其與ARE區(qū)域的結(jié)合能力[29]。已有研究表明甜菜堿能夠促進(jìn)某些蛋白質(zhì)（如信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白1）中精氨酸的甲基化修飾[30]。這暗示著甜菜堿還可能通過Nrf2蛋白的甲基化來(lái)影響Nrf2與ARE的結(jié)合，進(jìn)而影響Nrf2-Keap1-ARE通路。也就是說圖2a中的結(jié)果除了與進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的 Nrf2蛋白水平有關(guān)，還可能與Nrf2蛋白的甲基化有關(guān)。事實(shí)上，機(jī)體調(diào)節(jié)Nrf2-Keap1-ARE通路的機(jī)制多種多樣，如Nrf2蛋白的乙?；揎?、抑制Keap1 mRNA的翻譯等[12，31]。因此，甜菜堿激活Nrf2-Keap1-ARE通路的機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)甜菜堿是通過激活 Nrf2-Keap1-ARE通路提高LO2細(xì)胞內(nèi)SOD、GPx和CAT等抗氧化酶的mRNA水平的，而甜菜堿激活Nrf2-Keap1-ARE通路的機(jī)制與其降低Keap1的表達(dá)水平有關(guān)。本研究的結(jié)果將為解析甜菜堿的抗氧化機(jī)制提供一個(gè)新的視角。