銀杏葉提取物對糖尿病腎病大鼠腎功能、心功能、炎性反應(yīng)、β2-MG及RBP4水平的影響

江梅，劉曙艷，牛萬彬

（焦作市第二人民醫(yī)院，河南 焦作 454150）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）在臨床上最常見的慢性并發(fā)癥之一，主要癥狀表現(xiàn)為高血糖、胰島素分泌缺乏及代謝紊亂等，易造成機(jī)體微循環(huán)障礙、刺激機(jī)體炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)可引起終末期腎臟疾病，影響患者的治療及預(yù)后［1-2］。目前，臨床關(guān)于DN 的發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，但較多研究指出其與糖代謝紊亂、血脂代謝異常、炎性反應(yīng)等密切有關(guān)。且近年來較多研究發(fā)現(xiàn)，腎小管損傷與DN 進(jìn)展及預(yù)后關(guān)系密切，因此早期干預(yù)治療具有十分重要的作用［3］。黃酮類、萜類內(nèi)酯為銀杏葉提取物（GBE）的主要活性成分，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎及心肌保護(hù)等藥理作用，因此被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療［4-5］。目前，臨床關(guān)于GBE 在DN 中的臨床研究較多，但大都集中于DN 腎功能及炎性反應(yīng)方面，關(guān)于GBE 對DN 腎小管功能的作用研究較少［6］。為進(jìn)一步探究GBE對DN的防治效果，本研究從腎功能、腎小管、炎性反應(yīng)及心功能等方面出發(fā)，觀察GBE 干預(yù)下DN 大鼠體內(nèi)腎功能、腎小管、炎性反應(yīng)及心功能的變化，為臨床DN 的防治提供參考，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康8周齡雄性SD（清潔級(jí)）大鼠36只，實(shí)驗(yàn)前所有大鼠均進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，為期1周，室內(nèi)分組籠養(yǎng)，控制室溫為（22 ± 2）℃，并在8∶00—20∶00 時(shí)間段進(jìn)行自然光線或開燈照射，其余時(shí)間均關(guān)燈。實(shí)驗(yàn)大鼠均為專人負(fù)責(zé)喂養(yǎng)，飲水自由，喂養(yǎng)飼料和飲用水的量均依照大鼠成長速度進(jìn)行調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)大鼠及喂養(yǎng)飼料均購自福州福醫(yī)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及器材

1.2.1 試劑及藥品

鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）；銀杏葉片（每片含黃酮醇苷9.6 mg 及萜類內(nèi)酯2.4 mg，國藥準(zhǔn)字Z20053069，?？谄媪χ扑幑煞萦邢薰?，9.6 mg ×24 s）；24 h 尿蛋白（貨號(hào)：C035-2）、BUN（貨號(hào)：20160511）、Cr（貨號(hào)：C011-2）、IL-6（貨號(hào)：000004）、IL-8（貨號(hào)：L00417）、TNF-α（貨號(hào)：YM-S0122）、β2-MG（貨號(hào)：KGE019）及RBP4（貨號(hào)：DRB400）試劑盒均購自上海博湖生物科技有限公司。

1.2.2 主要儀器設(shè)備

德國Simens 公司Acuson Sequoia512C 彩色多普勒超聲診斷系統(tǒng)（配備15L8w-S 線陣探頭，頻率為12～14 MHz）；超速低溫離心機(jī)；精密電子天平；日立7600全自動(dòng)生化分析儀（日本）。

1.3 分組及造模

36 只雄性大鼠，體質(zhì)量200～250 g，隨機(jī)分為3 組，分別為對照組、糖尿病腎病模型組（DN 組）及銀杏葉提取物干預(yù)組（DN + GBE 組），每組12 只。對照組不予造模，DN 組及DN + GBE 組均參照2015年Elsherbiny 建模方法完成DM 誘導(dǎo)DN 模型。然后對DN 組及DN+GBE 組一次性腹腔注射STZ 溶液（由pH值為4.5 的檸檬酸鈉緩沖液配置而成），注射劑量為60 mg/kg。對照組大鼠采用等體積pH 值為4.5的緩沖液注射。建模48 h后，檢測大鼠空腹血糖，血糖水平超過250 mg/dL的大鼠視為糖尿病造模成功。

1.4 給藥方法

DN + GBE 組給予GBE 干預(yù)，灌胃前使用蒸餾水將藥物稀釋，劑量為96 mg/kg；對照組及DN 組給予同等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)12周。

1.5 觀測指標(biāo)

1.5.1 大鼠一般情況

實(shí)驗(yàn)期間，觀察各組大鼠飲水情況、進(jìn)食情況、尿量、體質(zhì)量及精神狀況等。

1.5.2 腎功能指標(biāo)水平

分別在干預(yù)第4、8、12 周將大鼠置于代謝籠中，收集大鼠尿液進(jìn)行24 h 尿蛋白定量檢測；同時(shí)采集大鼠主動(dòng)脈血，抗凝處理，離心，分離血清，并保存于-20 ℃?zhèn)錅y，尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）采用日立7600 全自動(dòng)生化分析儀檢測。

1.5.3 炎性因子水平

白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子（TNF-α）均采用ELISA 法在干預(yù)4、8、12 周后檢測。

1.5.4 心功能指標(biāo)情況

左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）采用彩色多普勒超聲診斷儀在干預(yù)4、8、12 周后檢測。

1.5.5 腎小管損傷標(biāo)志物水平

分別在干預(yù)4、8、12 周后，收集大鼠尿液，采用ELISA 法檢測β2-MG 及RBP4 水平。以上操作均按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，不同時(shí)點(diǎn)計(jì)量資料采用重復(fù)測量方差分析，以P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎功能指標(biāo)水平比較

時(shí)點(diǎn)比較，干預(yù)4、8、12 周時(shí)3 組的24 h 尿蛋白、BUN 及Cr 水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；組間比較，對照組24 h 尿蛋白、BUN 及Cr 水平低于DN +GBE 組（P＜0.05），DN + GBE 組24 h 尿蛋白、BUN 及Cr水平低于DN組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎功能指標(biāo)水平比較（±s）

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎功能指標(biāo)水平比較（±s）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與DN組比較，bP ＜0.05；與干預(yù)4周比較，*P ＜0.05。

組別對照組DN組DN+GBE組F時(shí)點(diǎn)，P值F交互，P值F組間，P值n 12 12 12時(shí)間干預(yù)4周干預(yù)8周干預(yù)12周干預(yù)4周干預(yù)8周干預(yù)12周干預(yù)4周干預(yù)8周干預(yù)12周24 h尿蛋白（mg/24 h）5.67±1.68 5.56±1.72 5.49±1.75 12.45±2.98a 14.78±3.09a 16.11±3.27a*9.71±2.30ab 8.42±2.26ab 7.89±2.12ab 3.527，0.069 30.375，0.000 54.078，0.000 BUN（mmol/L）9.12±2.66 9.64±2.56 9.02±2.58 23.45±6.45a 24.12±6.60a 25.68±6.85a 17.68±3.54ab 16.32±3.25ab 15.78±3.12ab 0.019，0.891 4.661，0.016 42.283，0.000 Cr（μmol/L）9.34±1.88 9.87±1.94 9.41±1.81 24.08±4.14a 26.54±4.26a 28.80±4.91a*22.10±3.44ab 20.12±3.56ab 17.78±3.68ab*0.088，0.769 24.391，0.000 111.504，0.000

2.2 炎性因子水平比較

時(shí)點(diǎn)比較，干預(yù)4、8、12周時(shí)3組的IL-6、TNF-α水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；組間比較，對照組IL-6、TNF-α 水平低于DN + GBE 組（P＜0.05），DN + GBE 組IL-6、TNF-α 水平低于DN 組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)炎性因子水平比較（±s，n=12）

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)炎性因子水平比較（±s，n=12）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與DN 組比較，bP ＜0.05；與干預(yù)4 周比較，*P ＜0.05。

組別對照組DN組DN+GBE組F時(shí)點(diǎn)，P值F交互，P值F組間，P值時(shí)間干預(yù)4周干預(yù)8周干預(yù)12周干預(yù)4周干預(yù)8周干預(yù)12周干預(yù)4周干預(yù)8周干預(yù)12周IL-6（μg/L）3.02±0.29 3.16±0.36 3.21±0.38 15.12±2.68a 16.89±2.82a 18.71±2.94a*9.62±3.13ab 8.42±3.04ab 7.89±2.96ab 2.406，0.130 12.469，0.000 144.474，0.000 TNF-α（mg/L）2.45±0.45 2.67±0.39 2.56±0.48 9.45±2.28a 9.86±2.14a 10.32±2.09a 6.12±1.56ab 5.28±1.46ab 4.68±1.32ab*0.416，0.523 8.178，0.001 96.238，0.000

2.3 心功能指標(biāo)比較

時(shí)點(diǎn)比較，干預(yù)4、8、12周時(shí)3組的LVEF、LVFS值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；組間比較，對照組LVEF、LVFS 值高于DN + GBE 組（P＜0.05），DN +GBE 組LVEF、LVFS 值高于DN 組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)心功能比較（±s，n=12）

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)心功能比較（±s，n=12）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與DN組比較，bP ＜0.05。

組別對照組DN組DN+GBE組F時(shí)點(diǎn)，P值F交互，P值F組間，P值時(shí)間干預(yù)4周干預(yù)8周干預(yù)12周干預(yù)4周干預(yù)8周干預(yù)12周干預(yù)4周干預(yù)8周干預(yù)12周LVEF（%）82.67±3.45 82.12±3.67 82.73±3.94 71.24±5.72a 70.68±5.84a 70.79±5.84a 77.95±3.47ab 76.42±3.14ab 78.12±3.24ab 0.019，0.890 0.130，0.878 26.900，0.000 LVFS（%）47.66±3.98 47.12±4.06 47.05±4.11 36.89±4.42a 36.95±4.08a 36.13±4.16a 41.22±3.30ab 41.08±3.40ab 42.45±3.24ab 0.008，0.928 1.543，0.229 29.270，0.000

2.4 β2-MG及RBP4水平比較

時(shí)點(diǎn)比較，干預(yù)4、8、12 周時(shí)3 組的β2-MG 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），RBP4 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；組間比較，對照組β2-MG、RBP4水平低于DN + GBE 組（P＜0.05），DN + GBE 組β2-MG、RBP4水平低于DN組（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)β2-MG及RBP4水平比較（±s，n=12）

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)β2-MG及RBP4水平比較（±s，n=12）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與DN 組比較，bP ＜0.05；與干預(yù)4 周比較，*P ＜0.05。

組別對照組DN組DN+GBE組F時(shí)點(diǎn)，P值F交互，P值F組間，P值時(shí)間干預(yù)4周干預(yù)8周干預(yù)12周干預(yù)4周干預(yù)8周干預(yù)12周干預(yù)4周干預(yù)8周干預(yù)12周β2-MG（mg/L）6.12±1.60 6.45±1.54 6.52±1.66 56.78±7.88a 28.32±7.96a 31.19±8.42a*20.96±5.09ab 18.45±5.21ab 16.08±5.15ab*155.440，0.000 97.323，0.000 157.309，0.000 RBP4（mg/L）10.88±2.96 11.42±3.12 11.73±3.09 27.78±5.42a 29.45±6.12a 31.66±6.65a 17.90±4.17ab 16.32±4.24ab 15.78±4.08ab 1.521，0.226 6.030，0.006 67.659，0.000

3 討論

DN 為DM 患者常見并發(fā)癥之一，近年來發(fā)病率逐年攀升。相關(guān)資料指出，DN是造成患者終末期腎病的重要原因，其地位僅次于腎小球腎炎，發(fā)生后可引起患者腎功能損傷，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致尿毒癥，增加疾病病死率［7-8］。目前關(guān)于DN 的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，其早期主要表現(xiàn)為基底膜肥厚及腎血流增加，經(jīng)進(jìn)展可表現(xiàn)為蛋白排泄增加、腎小球硬化及腎臟炎癥，造成腎功能障礙。既往研究發(fā)現(xiàn)，血糖、血脂、氧化應(yīng)激反應(yīng)等與DN的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，DN疾病初期，炎性細(xì)胞可在腎小球中積聚，可能參與DN 的發(fā)病過程［9-10］。故現(xiàn)階段改善患者腎功能及心功能、降低炎癥反應(yīng)為DN治療的關(guān)鍵點(diǎn)。銀杏葉性味苦、澀、平，具有活血止痛及保護(hù)心腦血管等作用。銀杏葉提取物為銀杏葉中提取的有效成分，包含黃酮類、有機(jī)酸類及萜類內(nèi)酯等活性成分，具有抗氧化應(yīng)激、抗血小板、抑制腎小管細(xì)胞凋亡及改善微循環(huán)等作用［11］。有研究指出，銀杏葉提取物可有效清除機(jī)體自由基，具有抑制毛細(xì)血管通透性，改善機(jī)體新陳代謝及末梢血液循環(huán)障礙等作用［12］。

高糖狀態(tài)下，腎小球微循環(huán)受到損害，可激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，進(jìn)一步促進(jìn)NO 的代謝，造成內(nèi)源性血管舒張，損傷內(nèi)皮細(xì)胞及腎小球［13］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，腎小球腎病以蛋白尿增多及腎功能參數(shù)變化為主要特征，因此可升高BUN 及Cr 水平，降低肌酐清除率；且在炎癥反應(yīng)的刺激下，炎性因子聚集于腎小球及間質(zhì)中，可加重DN 腎損傷［14］。龐欣欣等［15］研究發(fā)現(xiàn)，DN 患者微量蛋白尿升高之前，其腎小管損傷標(biāo)志物會(huì)出現(xiàn)異常升高，提示DN 患者腎小管病變要早于腎小球損傷。基于這一結(jié)論，近年來較多研究者指出，除腎小球指標(biāo)可較為準(zhǔn)確預(yù)測DN 患者腎功能外，腎小管標(biāo)志物對DN 腎功能預(yù)測的敏感性也較高。β2-MG 及RBP4 均為靈敏的腎小管損傷標(biāo)志因子，其可從腎小球中自由濾過，且絕大部分在近端腎小管中被吸收，并在腎小管上皮細(xì)胞中分解破壞，因此正常情況下β2-MG 的排出量較少。另有研究指出，β2-MG、RBP4 與DN 患者Cr 及尿微量白蛋白呈正相關(guān)。本研究中，干預(yù)4、8、12 周后對照組24 h 尿蛋白、BUN、Cr、β2-MG、RBP4 水平均低于低于DN + GBE 組，DN+GBE 組24 h 尿蛋白、BUN、Cr、β2-MG、RBP4 水平低于DN 組。提示GBE 可有效改善DN 模型大鼠腎功能，改善大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)，降低細(xì)胞壞死及基底膜增厚，進(jìn)而發(fā)揮腎臟的保護(hù)作用。

炎癥因子在DN 發(fā)生中的作用機(jī)制已得到證實(shí)。IL-6 為機(jī)體促炎細(xì)胞因子，可刺激肝細(xì)胞合成，從而生成急性期蛋白，參與炎癥反應(yīng)。已有研究指出，IL-6 可促進(jìn)機(jī)體白細(xì)胞吞噬能力的提高，進(jìn)一步增加毛細(xì)血管通透性，進(jìn)而造成微量白蛋白增高。IL-6還可降低胰島β 細(xì)胞功能，降低胰島素，促使DN 發(fā)生［16］。而hs-CRP 為急性反應(yīng)蛋白，可引起機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，并進(jìn)一步導(dǎo)致動(dòng)脈硬化，促進(jìn)DN 形成。TNF-α 為DN 的重要介質(zhì)，其水平可隨DN 病程的延長而升高，并可促進(jìn)胰島素抵抗，造成機(jī)體氧化自由基反應(yīng)，加重DN 患者腎功能損傷［17］。一項(xiàng)國外研究指出，IL-6、hs-CRP 與纖維蛋白原的關(guān)系密切［18］。本研究中，干預(yù)4、8、12 周后對照組IL-6、TNF-α 水平均低于低于DN+GBE 組，DN+GBE 組IL-6、TNF-α 水平低于DN 組。提示GBE 可有效改善DN模型大鼠炎性反應(yīng)，在DN形成中具有抗炎作用。

DM 主要為胰島素缺乏、生物活性受損及代謝紊亂引起，可造成心血管、腎臟及神經(jīng)等一系列組織損害。DN 為DM 的嚴(yán)重并發(fā)癥，若未及時(shí)進(jìn)行有效治療，可并發(fā)尿毒癥，增加死亡風(fēng)險(xiǎn)。有研究指出，DM可引起心肌細(xì)胞凋亡，造成心肌順應(yīng)性改變，影響心功能，也可能參與DN 的發(fā)病過程［19］。本研究結(jié)果顯示，DN + GBE 組LVEF、LVFS 值高于DN 組。證實(shí)GBE 組大鼠心室收縮功能顯著改善，提示GBE 具有減少心肌細(xì)胞凋亡、改善大鼠心功能作用。

綜上所述，銀杏葉提取物可有效改善DN 大鼠腎功能及心功能，并減輕大鼠腎小管損傷，減少炎癥因子釋放。