帥文苑,何慶華,鐘引鳳,黃云祥,張 航,劉傳勇,張樂平,涂 追*
(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西 南昌 330047;2.南昌大學(xué) 食品學(xué)院,江西 南昌 330047;3.南昌大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,江西 南昌 330031;4.江西省現(xiàn)代分析科學(xué)重點實驗室,江西 南昌 330031)
黃曲霉毒素B1(AFB1)是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物[1-2],主要存在于發(fā)霉的花生、玉米、大米等農(nóng)產(chǎn)品中[3-4],AFB1具有致癌性、致突變性、致毒性等,已被世界衛(wèi)生組織的癌癥機構(gòu)劃定為Ⅰ類致癌物。目前,檢測農(nóng)作物中AFB1的方法包括高效液相色譜法(HPLC)[5-6]、免疫傳感器法[7]、免疫層析法(ICA)[8-9]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[10-11]等。免疫學(xué)檢測方法基于抗體與抗原特異性結(jié)合,具有簡便、高特異性、高靈敏度及高通量等優(yōu)點?,F(xiàn)有的AFB1免疫學(xué)檢測方法采用的抗體主要有單克隆抗體、單鏈抗體等,然而單克隆抗體的制備較為繁瑣,細胞培養(yǎng)及儲存環(huán)境要求嚴(yán)格;單鏈抗體表達量低且常以包涵體的形式存在,應(yīng)用受到一定的限制[12]。納米抗體是通過克隆重鏈抗體的可變區(qū)并表達得到由一個重鏈抗體可變區(qū)構(gòu)成的單域抗體(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody,VHH)[13],具有與原重鏈抗體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及抗原結(jié)合活性,是目前已知的可結(jié)合目標(biāo)抗原的最小單位,具有水溶性高,溫度及pH耐受性好等優(yōu)點。納米抗體由于結(jié)構(gòu)簡單,適合于原核(如大腸桿菌)和真核表達系統(tǒng)進行高效表達,易于獲得,已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療[14]、診斷[15]、免疫分析[16]等領(lǐng)域。
增加免疫學(xué)檢測方法中識別元件對待檢物的親和活性是提高檢測靈敏度的主要途徑之一[17]。已有研究表明,相比于單價納米抗體,多價抗體形式具有更高的表觀親和力,有望建立靈敏度更高的免疫學(xué)檢測方法[18-19]。本課題組前期從羊駝免疫庫中篩選獲得了針對黃曲霉毒素B1的納米抗體(命名為G8),并將其應(yīng)用于黃曲霉毒素的ELISA 檢測以及樣品前處理[20]。本研究以前期獲得的抗AFB1納米抗體G8為研究對象,利用納米抗體分子量小,易于基因操作、原核表達的特點,通過串聯(lián)融合表達的方法,構(gòu)建了單價以及多價納米抗體串聯(lián)體,并分別與綠色熒光蛋白(GFP)編碼片段融合,研究了多價化及融合表達對重組蛋白生物活性的影響,為后續(xù)建立基于熒光信號的免疫學(xué)檢測方法奠定了基礎(chǔ),同時也可為優(yōu)化免疫學(xué)檢測中納米抗體親和活性提供了借鑒和思路。
Varioskan LUX 多功能讀數(shù)儀(美國Thermo 公司);ZHWY-2102C 恒溫搖床(中科院武漢科學(xué)儀器廠);JY92-ⅡDN 超聲波細胞粉碎機(寧波新藝超聲設(shè)備有限公司);LAS 500 凝膠成像儀(BIO-RAD公司);DYY-8C 電泳儀(北京六一儀器廠);Nanodrop 1000 超微量分光光度計(美國Thermo 公司);DHG-9101·DSA 恒溫培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司);T100TMPCR 擴增儀(BIO-RAD 公司);NK-420 電熱恒溫水箱(常州諾基儀器有限公司);YLC-100 干式恒溫器(江蘇金怡儀器科技有限公司);Sorvall Stratos低溫高速離心機(美國Thermo公司)。
含單價以及二價、三價抗AFB1納米抗體的質(zhì)粒pET30-G8、pET30-DiG8、pET30-TriG8,含綠色熒光蛋白的質(zhì)粒PMCSG18hRahs-GFP,大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)均由本實驗室保存;人工抗原AFB1-BSA 由本實驗室制備[21];氯化鈉(NaCl)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、氯化鉀(KCl)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)均為分析純,購自上海阿拉丁生化科技公司;Lysis 平衡緩沖液(LE Buffer:50 mmol/L Na2HPO4,0.3 mol/L NaCl,pH 8.0);磷酸鹽緩沖溶液(0.01 mmol/L PBS:137 mmol/L NaCl,2.7 mmol/L KCl,10 mmol/L Na2HPO4,2 mmol/L KH2PO4,pH 7.4);含0.05%吐溫-20 的0.01 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液(PBST);卡那霉素(Kana)、異丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)購自索萊寶公司;限制性內(nèi)切酶SfiⅠ、NotⅠ、NdeⅠ,T4DNA 連接酶(TakaRa 公司);HRP 標(biāo)記His 標(biāo)簽鼠單克隆抗體(Proteintech)、Ni2+-NTA 親和層析(金斯瑞生物科技);DNA 片段純化試劑盒(MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0)(貨號9716)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0)(貨號9762)(TakaRa 公司);質(zhì)粒產(chǎn)物小提試劑盒(DP103-02,天根公司);經(jīng)PAGE 純化的引物由金斯瑞生物科技公司合成(見表1)。
表1 引物列表Table 1 List of primers
1.2.1 原核表達載體的構(gòu)建原核表達載體pET30-G8-GFP、pET30-DiG8-GFP、pET30-TriG8-GFP 的構(gòu)建方法如圖1 所示。經(jīng)引物(G8-F0、G8-R0)獲得G8 編碼片段,限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和SfiⅠ將編碼G8的基因克隆至載體pET30以獲得載體pET30-G8。DiG8、TriG8通過含有編碼柔性linker(GGSGG)的引物(G8-F1、G8-R1)及引物G8-F0、G8-R0 進行重疊延伸PCR(overlap PCR)而得,同樣經(jīng)由限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和SfiⅠ構(gòu)建得到載體pET30-DiG8、pET30-TriG8。pET30-G8、pET30-DiG8、pET30-TriG8和由引物(F0、R0)擴增得到的GFP編碼片段,用SfiⅠ和NotⅠ分別進行雙酶切,試劑盒回收上述酶切片段。將純化得到的載體與目的片段按1∶3的摩爾比用T4DNA連接酶于16 ℃孵育過夜,連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞,涂布于含50 μg/mL 卡那霉素的LB(LBKana)平板,37 ℃培養(yǎng)12 h。采用引物T7 prom和T7 term對單克隆進行菌落PCR驗證,陽性克隆提取質(zhì)粒后再進行雙酶切驗證,雙酶切與預(yù)期相符的克隆送至南京金斯瑞生物科技公司測序。
圖1 抗AFB1納米抗體融合蛋白表達載體構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic of construction of anti-aflatoxin B1 nanobody fusion protein expression vector
1.2.2 納米抗體的融合表達及純化經(jīng)測序驗證結(jié)果正確的重組表達載體pET30-G8-GFP、pET30-DiG8-GFP、pET30-TriG8-GFP,電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB(LB-Kana)平板,37 ℃培養(yǎng)12 h;挑取平板中的單菌落接種于含卡那霉素的5 mL LB 液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫搖床220 r/min 培養(yǎng)12 h;上述菌液按1%的比例接種于1 L LB-Kana 液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫搖床220 r/min 培養(yǎng)至OD600值為0.6 ~ 0.8(約2~3 h);上述培養(yǎng)液中加入IPTG 至終濃度為0.5 mmol/L,18 ℃過夜誘導(dǎo)培養(yǎng)。將誘導(dǎo)培養(yǎng)物6 500 r/min離心15 min,棄上清,收集菌體;1/10體積的LE 緩沖液重懸菌體,冰浴中超聲波破碎菌體至澄清,破碎后的菌體于6 500 r/min 條件下離心20 min,分別收集破碎上清和沉淀。采用Ni2+-NTA 親和層析純化融合蛋白,SDS-PAGE 分析蛋白表達及純化情況。
1.2.3 未融合、單價及多價納米抗體的活性分析采用間接ELISA 分析重組蛋白與人工抗原的結(jié)合活性。將溶于PBS(pH 7.4)的人工抗原AFB1-BSA 以100 μL/孔加至酶標(biāo)孔中,4 ℃包被過夜;PBST 洗板3次,加入5%脫脂牛奶,300 μL/孔,37 ℃封閉2 h;PBST 洗板3次,加入100 μL/孔重組蛋白G8(未融合、單價及多價),37 ℃孵育1 h;PBST 洗板3 次,加入100 μL/孔HRP 標(biāo)記His 標(biāo)簽鼠單克隆抗體,37 ℃孵育1 h;PBST 洗板3 次,加入100 μL/孔TMB 底物顯色液,37 ℃孵育10 min;加入50 μL/孔2 mol/L H2SO4終止反應(yīng),于酶標(biāo)儀中測定OD450值。間接競爭ELISA 與間接ELISA 步驟基本相同,但在加入重組蛋白G8 時,應(yīng)同時加入50 μL/孔重組蛋白G8(未融合、單價及多價)及50 μL/孔AFB1標(biāo)準(zhǔn)品(200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.20、0 ng/mL)進行競爭反應(yīng)。
1.2.4 重組蛋白的熒光檢測在酶標(biāo)板中分別加入相同濃度重組蛋白(G8-GFP、DiG8-GFP、TriG8-GFP)200 μL,放入多功能讀數(shù)儀中,于熒光光譜模式下先設(shè)定激發(fā)波長為472 nm,掃描490~650 nm范圍內(nèi)的發(fā)射光譜;再設(shè)定發(fā)射波長為507 nm,掃描350~490 nm范圍內(nèi)的激發(fā)光譜,繪制激發(fā)及發(fā)射光譜圖,并分別記錄其最大激發(fā)和發(fā)射波長,及對應(yīng)熒光強度。
采用通用引物分別進行菌落PCR,結(jié)果顯示獲得了符合預(yù)期大小的基因片段(圖2A)。將菌落PCR陽性的克隆提取質(zhì)粒,pET30-G8-GFP、pET30-DiG8-GFP和pET30-TriG8-GFP 三種重組質(zhì)粒經(jīng)SfiⅠ和NotⅠ雙酶切驗證后均出現(xiàn)兩條帶,酶切后的3種載體片段5 633 bp、6 026 bp、6 419 bp和GFP基因片段745 bp與預(yù)期相符(圖2B),經(jīng)DNA測序證明三種表達載體構(gòu)建正確。
圖2 菌落PCR驗證及重組質(zhì)粒的雙酶切驗證Fig.2 Identification of colony PCR and double digestion of recombinant plasmid by agarose gel electrophoresis
將三種重組質(zhì)粒pET30-G8-GFP、pET30-DiG8-GFP、pET30-TriG8-GFP 電轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3),經(jīng)終濃度為0.5 mmol/L IPTG于18 ℃條件誘導(dǎo)表達12 h,分別收集誘導(dǎo)前后的菌體。SDS-PAGE顯示,三種蛋白均可在大腸桿菌BL21(DE3)中可溶性表達,且經(jīng)Ni2+-NTA親和層析純化得到的蛋白G8-GFP、DiG8-GFP、TriG8-GFP 的條帶位置與預(yù)期分子量42.87、57.24、70.57 kDa大小保持一致。經(jīng)試劑盒定量,三種蛋白的表達量分別為6.0、7.5、4.0 mg/L,且本實驗未進行表達條件的優(yōu)化,通過優(yōu)化表達條件如誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間、IPTG 濃度等有望進一步提高表達量[20]。三種蛋白在表達過程中,融合蛋白G8-GFP 與DiG8-GFP 可溶性表達較多,易于破碎;而融合蛋白TriG8-GFP 包涵體表達占多數(shù),較難破碎,推測由于該融合蛋白的分子量較大,蛋白在折疊過程中易以聚集形式表達形成包涵體,可溶性表達低,由此可以推測多價納米抗體串聯(lián)數(shù)目較多時,較難獲得可溶性蛋白。
圖3 三種融合蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expression and purifi?cation of three fusion proteins
采用間接ELISA對三種融合蛋白的結(jié)合活性進行分析,結(jié)果顯示三種融合蛋白(G8-GFP,DiG8-GFP,TriG8-GFP)均能特異性結(jié)合人工抗原AFB1-BSA,說明納米抗體在多價化后仍然保持抗原識別活性(圖4)。經(jīng)方陣滴定,確定人工抗原AFB1-BSA的工作濃度為2.5 μg/mL,融合蛋白G8、G8-GFP、DiG8-GFP 以及TriG8-GFP 的最佳工作濃度分別為0.5、2.125、3.125、8.90 μg/mL。
以AFB1標(biāo)準(zhǔn)品進行間接競爭ELISA,結(jié)果表明,G8、G8-GFP 以及DiG8-GFP 建立間接競爭ELISA 的IC50分別為12.10、14.10、2.19 ng/mL,提示單價融合蛋白IC50與未融合蛋白相似,雙價融合蛋白IC50較未融合蛋白提高了5.5倍(圖5)。三價融合蛋白TriG8-GFP的靈敏度降低,與標(biāo)準(zhǔn)品競爭趨勢不明顯,未能計算得到IC50值(圖5),該結(jié)果與本實驗室前期工作相吻合[22],推測可能是該融合方式對蛋白表達與折疊存在一定的影響。He 等[23]通過柔性連接子Linker(G4S)3共15個氨基酸構(gòu)建多價納米抗體,將其生物素化并固定在鏈霉親和素衍生的細菌磁性納米顆粒上,用于檢測四溴雙酚A,結(jié)果顯示多價納米體的結(jié)合活性由高到低依次為:三價、二價、一價。本研究構(gòu)建的多價納米體同樣采用了柔性Linker,然而長度僅為前者的三分之一,提示納米抗體的連接方式對活性有較大的影響。融合GFP蛋白的ELISA 數(shù)據(jù)偏差較未融合GFP 更大,且背景吸附值較高(圖4、5),ELISA 的條件有待進一步優(yōu)化以降低背景吸附和提高精密度。TriG8-GFP 由4 個串聯(lián)的結(jié)構(gòu)域組成,在表達過程中可能未完全正確折疊,導(dǎo)致非特異性吸附而不能被標(biāo)準(zhǔn)品阻斷。
圖4 間接ELISA分析3種融合蛋白的活性Fig.4 Bioactivity analysis of three fusion proteins by indirect ELISA
圖5 間接競爭ELISA分析G8、G8-GFP、DiG8-GFP及TriG8-GFP的活性Fig.5 Indirect competitive ELISA of bioactivity analysis of G8,G8-GFP,DiG8-GFP and TriG8-GFP
同一濃度(0.70 mg/mL)三種融合蛋白(G8-GFP、DiG8-GFP、TriG8-GFP)的熒光光譜如圖6 所示。三種融合蛋白的最大激發(fā)波長均在472 nm左右,最大發(fā)射波長均在507 nm左右,與GFP相比最大激發(fā)和發(fā)射波長未發(fā)生改變。融合蛋白G8-GFP 與DiG8-GFP 的熒光強度均在3 000 及以上,與GFP相當(dāng)且DiG8-GFP 表現(xiàn)出更高的熒光強度,而融合蛋白TriG8-GFP 的熒光強度僅在1 700 左右,相對熒光強度最弱(圖6)。在表達過程中,推測三價串聯(lián)的納米抗體的融合蛋白TriG8-GFP的分子量較大,納米抗體與熒光蛋白在表達過程中未能正確折疊,使得其熒光強度降低。由此推測,三價納米抗體串聯(lián)與熒光蛋白融合表達可能會影響其熒光活性,從而對基于熒光活性的免疫學(xué)檢測存在一定干擾。
圖6 三種融合蛋白的激發(fā)及發(fā)射光譜圖Fig.6 Excitation and emission spectra of three fusion proteins
納米抗體因其特殊結(jié)構(gòu)可在大腸桿菌系統(tǒng)中進行高效可溶性表達,且串聯(lián)后重組蛋白仍能可溶性表達。本研究以針對AFB1的納米抗體和GFP 建立了研究模型,單價融合蛋白與未融合納米抗體G8 相比結(jié)合活性并未顯示較大差異,而雙價納米抗體與重組蛋白G8相比IC50提高了5.5 倍,且融合后GFP 的熒光強度及最大激發(fā)和發(fā)射波長并未發(fā)生改變,同時二價融合蛋白熒光活性表現(xiàn)較高,表明通過串聯(lián)方式獲得的針對AFB1二價納米抗體的結(jié)合活性和熒光活性均較好。納米抗體多價化的方式主要包括聚集體形式、串聯(lián)表達等。本研究采用納米抗體直接串聯(lián)多價化方式,獲得的二價納米抗體與熒光蛋白的融合活性較好,為后續(xù)建立熒光免疫檢測方法奠定了基礎(chǔ),具有一定的應(yīng)用前景。