羧基功能化磁性碳納米管的制備及其對(duì)豬肉中瘦肉精的萃取

連麗麗，陳柏森，鄧藝輝，王希越，張凌赫，婁大偉

（吉林化工學(xué)院 分析化學(xué)系，吉林 吉林 132022）

自20世紀(jì)80年代以來(lái)，鹽酸克倫特羅（CLB）和萊克多巴胺（RAC）等腎上腺素受體激動(dòng)劑被廣泛用作牲畜食品添加劑，以減少被飼養(yǎng)動(dòng)物的脂肪、提高其肌肉生長(zhǎng)，因此也被稱為“瘦肉精”［1-3］。“瘦肉精”可在動(dòng)物組織中累積，人類食用被其污染的肉類后會(huì)引起疲憊、頭暈發(fā)燒、心律失常和新陳代謝紊亂等不良反應(yīng)，嚴(yán)重者會(huì)引發(fā)癌癥、中樞神經(jīng)和心血管疾?。?］。因此，我國(guó)及許多國(guó)家已禁止使用“瘦肉精”作為動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑［5］。然而，由于其成本低廉、作用高效，“瘦肉精”作為飼料添加劑仍屢禁不止。因此，開(kāi)發(fā)復(fù)雜樣品中“瘦肉精”的檢測(cè)方法具有重要意義。

固相萃?。⊿PE）技術(shù)作為最常用的樣品凈化和預(yù)富集步驟，結(jié)合儀器分析，能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中痕量組分的準(zhǔn)確分析［6］。近年來(lái)，在SPE 基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的磁性固相萃?。∕SPE）技術(shù)，作為一種新型樣品前處理手段受到了廣泛關(guān)注［7］。MSPE技術(shù)的關(guān)鍵在于制備對(duì)目標(biāo)分析物具有良好吸附性能的磁性吸附劑。Fe3O4、γ-Fe2O3等磁性納米粒子（NPs）具有較小的尺寸、優(yōu)異的磁響應(yīng)性，在其表面進(jìn)一步修飾多功能基團(tuán)得到的磁性雜化材料可作為MSPE吸附劑。碳納米管是一維線性結(jié)構(gòu)的納米碳材料，可分為單壁碳納米管和多壁碳納米管（CNT），具有比表面積大、易于功能化修飾、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)［8］。將其與Fe3O4、γ-Fe2O3等磁性NPs相結(jié)合構(gòu)建的磁性碳納米管兼具二者優(yōu)點(diǎn)，不但具有良好的磁性，而且具有較高的吸附容量，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境水、食品、生物樣品中獸藥［9］、雌激素［10］、多環(huán)芳烴［11］、農(nóng)藥［12］和染料［13］的富集與分離。

本文在超聲輔助下，通過(guò)氧化-沉淀法合成了羧基功能化磁性碳納米管復(fù)合材料Fe3O4-Cys@CNT。與傳統(tǒng)的磁性碳納米管相比，F(xiàn)e3O4-Cys@CNT具有制備方法簡(jiǎn)單、合成時(shí)間短、綠色環(huán)保及表面富含羧基官能團(tuán)等優(yōu)點(diǎn)。將Fe3O4-Cys@CNT 作為吸附劑，建立了豬肉樣品中痕量CLB 及RAC的MSPE/超高效液相色譜（UPLC）分析方法，并將該方法應(yīng)用于市售豬肉樣品中CLB和RAC的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

配有TUV 紫外檢測(cè)器的H-Class 超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 儀器公司）；EP115 型烘箱（德國(guó)Binder 儀器公司）；JEM-2100F 型透射電鏡（TEM，日本電子株式會(huì)社JEOL）；D8 Advanced X-射線衍射儀（XRD，德國(guó)Bruker公司）。

鹽酸克倫特羅（CLB，純度99%）、萊克多巴胺（RAC，純度99%）購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；甲醇、乙腈（色譜純）購(gòu)于美國(guó)Fisher 公司；半胱氨酸（L-Cys）、CNT（分析純）購(gòu)于上海阿拉丁公司；其它試劑均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取5.0 mg CLB、RAC 標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL潔凈的容量瓶?jī)?nèi)，加入5.0 mL 甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃下保存。移取100 μL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL潔凈的容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇定容至10 mL，得到10 mg/L的CLB、RAC混合工作液，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 色譜條件

色譜柱：BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters儀器公司）；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流動(dòng)相：乙腈∶1%甲酸水（80∶20）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4 磁性吸附劑制備

稱取1.7 g FeSO4和0.7 gL-Cys 分別溶于30 mL 超純水中。將上述兩種溶液迅速混合，加入48 mL 1 mol/L 的NaOH，25 ℃超聲5 min 后，在上述溶液中加入0.3 g CNT，在超聲條件下繼續(xù)反應(yīng)20 min。反應(yīng)結(jié)束后，用無(wú)水乙醇和超純水反復(fù)洗滌產(chǎn)物至潔凈，60 ℃真空干燥6 h，得到Fe3O4-Cys@CNT。

1.5 實(shí)際樣品處理

豬肉樣品購(gòu)自吉林市當(dāng)?shù)爻?。參考?guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB/T 5009.192-2003）［14］提取豬肉樣品中的CLB 及RAC。稱取豬肉樣品10 g 于燒杯中，加入20 mL 高氯酸溶液（0.1 mol/L）進(jìn)行勻漿處理，沉淀蛋白。25 ℃超聲處理20 min 后，在80 ℃水浴條件下加熱10 min，取出冷卻至室溫，于10 000 r/min 離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中。將殘?jiān)? mL 高氯酸溶液（0.1 mol/L）重復(fù)提取，合并2 次提取液，用超純水稀釋至50 mL，并用氫氧化鈉溶液（1 mol/L）將其pH調(diào)至7±0.1，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 磁性固相萃取過(guò)程

將20 mg Fe3O4-Cys@CNT 分散到10 mL 上述提取液中，渦旋振蕩10 min，磁分離后棄去上清液。用3 mL醋酸甲醇（15∶85，體積比）對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行渦旋洗脫，洗脫時(shí)間為10 min。收集洗脫液，氮?dú)鉂饪s后用超純水復(fù)溶至500 μL，進(jìn)行UPLC 分析。在此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)pH 值、萃取時(shí)間、吸附劑用量、洗脫時(shí)間、洗脫溶劑種類及體積等進(jìn)行了優(yōu)化并對(duì)吸附劑的重復(fù)使用性進(jìn)行了評(píng)估。

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性吸附劑的制備

在超聲條件下，采用溫和的氧化-沉淀法合成Fe3O4-Cys@CNT。在堿性條件下，以Fe2+作為鐵源，空氣中的O2作為氧化劑，在保護(hù)劑L-Cys的作用下，O2將Fe2+氧化為Fe3O4。同時(shí)，L-Cys可通過(guò)—SH 官能團(tuán)中的S原子與金屬的絡(luò)合作用被枝接在磁性材料表面，為磁性NPs提供氨基和羧基［15］。在超聲作用下，F(xiàn)e3O4-Cys NPs上的氨基和羧基進(jìn)一步通過(guò)氫鍵與CNT結(jié)合，并均勻地分散在CNT表面。

2.2 磁性吸附劑的表征

圖1A 為Fe3O4-Cys@CNT 的傅里葉變換-紅外光譜（FT-IR）圖。其中，在568 cm-1處的特征吸收為Fe3O4中Fe—O 鍵的拉伸振動(dòng)；在3 438 cm-1處的吸收峰由L-Cys 分子和CNT 中O—H 的伸縮振動(dòng)引起；在1 612 cm-1、1 178 cm-1和1 069 cm-1處的吸收峰分別由C==O、C—N和C—O的伸縮振動(dòng)引起［16］，表明Fe3O4-Cys 成功地修飾于CNT 表面。Fe3O4NPs 賦予了吸附劑磁性，而L-Cys 分子中的氨基及羧基增強(qiáng)了吸附劑的親水性。

圖1 Fe3O4-Cys@CNT的FT-IR譜圖（A）、XRD譜圖（B）以及TEM圖（C、D）Fig.1 FT-IR analysis（A），XRD patterns（B）and TEM images（C and D）of Fe3O4-Cys@CNT

Fe3O4-Cys@CNT 的XRD 譜圖如圖1B 所示。在2θ= 30.26°、35.42°、43.23°、53.91°、57.23°和62.82°處的特征衍射峰，分別對(duì)應(yīng)立方反尖晶石結(jié)構(gòu)Fe3O4的（220）、（311）、（400）、（422）、（511）和（440）晶面的特征衍射［17］，此外，在2θ= 26.3°處觀察到CNT（002）晶面的特征衍射峰［18］。結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4NPs成功地連接在CNT表面，且未發(fā)生晶體結(jié)構(gòu)的變化。

圖1C 和圖1D 為Fe3O4-Cys@CNT 的TEM 圖。由圖可見(jiàn)，F(xiàn)e3O4-Cys 為單分散的球形結(jié)構(gòu)，其粒徑約為20 nm，CNT為細(xì)長(zhǎng)管狀，管內(nèi)徑約為5 nm，管壁厚約為5 nm，F(xiàn)e3O4-Cys NPs均勻地分布在CNT表面。

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

2.3.1 萃取條件的優(yōu)化考察了溶液pH 值（pH 3～11）對(duì)目標(biāo)分析物萃取效率的影響。如圖2A 所示，在pH 值為5、7、9 時(shí)2 種目標(biāo)物的回收率較好且在pH 9 時(shí)達(dá)到最佳。CLB 的酸度系數(shù)（pKa）值為9.9，RAC 的酸度系數(shù)pKa1值為8.9、pKa2值為10.3［19］，經(jīng)測(cè)定Fe3O4-Cys@CNT 的零點(diǎn)電位（pHpzc）為6.5。因此，在強(qiáng)酸性介質(zhì)中，磁性吸附劑與目標(biāo)分析物之間的靜電斥力增強(qiáng)，使得萃取效率大大降低。隨著pH值的增大，吸附劑與目標(biāo)物之間的靜電斥力逐漸降低，CLB及RAC與CNT之間的氫鍵作用及π-π作用［20］使得Fe3O4-Cys@CNT在較寬的pH值范圍內(nèi)對(duì)二者均具有較高的萃取效率。在強(qiáng)堿性（pH 11）介質(zhì)中，F(xiàn)e3O4-Cys@CNT表面的負(fù)電荷與帶負(fù)電的分析物之間靜電斥力增強(qiáng)，使得吸附劑對(duì)分析物的萃取效率下降。因此，選擇最佳pH值為9。

圖2 溶液pH（A）、吸附劑用量（B）、洗脫溶劑種類（C）和洗脫時(shí)間（D）對(duì)目標(biāo)物回收率的影響Fig.2 Effects of pH value（A），adsorbent mass（B），eluent type（C）and elution time（D）on the recoveries of analytes C：1.methanol；2.acetonitrile；3.acetic acid/methanol（15∶85）；4.acetic acid/acetonitrile（15∶85）；5.ammonia/methanol（10∶90）

進(jìn)一步考察了吸附劑Fe3O4-Cys@CNT 質(zhì)量（5～30 mg）對(duì)CLB 及RAC 萃取效率的影響。由圖2B 可看出，隨著吸附劑質(zhì)量從5 mg增至10 mg，萃取效率快速增加，當(dāng)吸附劑質(zhì)量增至15 mg時(shí)萃取效率達(dá)到平衡。因此，選擇吸附劑Fe3O4-Cys@CNT的最佳用量為15 mg。此外，在5～30 min范圍內(nèi)對(duì)萃取時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。由于吸附劑具有足夠的吸附位點(diǎn)，CLB及RAC在前5 min能夠被快速萃取，并在10 min時(shí)達(dá)到吸附平衡。因此，選擇最佳萃取時(shí)間為10 min。

2.3.2 洗脫條件的優(yōu)化考察了甲醇、醋酸/甲醇（15∶85，體積比，下同）、氨水/甲醇（10∶90）、乙腈、醋酸/乙腈（15∶85）5 種溶劑對(duì)目標(biāo)分析物萃取效率的影響。如圖2C 所示，以醋酸/甲醇（15∶85）和醋酸/乙腈（15∶85）作為洗脫溶劑時(shí)目標(biāo)物的萃取效率高于甲醇和乙腈，由于乙腈毒性較大，因此選擇醋酸/甲醇（15∶85）作為洗脫溶劑。此外，酸性/堿性甲醇的洗脫效果均優(yōu)于甲醇。一方面，在甲醇中加入酸/堿溶液，破壞了分析物與吸附劑間的氫鍵作用，使分析物與洗脫溶劑的親和力增強(qiáng)［21］。另一方面，CLB 及RAC 均為極性化合物，在甲醇中添加酸/堿溶液提高了洗脫溶劑的極性，從而能夠更好地將目標(biāo)分析物從吸附劑表面洗脫［22］。進(jìn)一步考察了洗脫時(shí)間在2～20 min 范圍內(nèi)對(duì)萃取效率的影響。如圖2D 所示，當(dāng)洗脫時(shí)間為10 min 時(shí)，2 種目標(biāo)物的萃取效率達(dá)到最優(yōu)且不再增加（RAC 和CLB 的萃取效率分別為85.87%、83.06%），因此選擇洗脫時(shí)間為10 min。同時(shí)考察了洗脫溶劑體積（0.5～4 mL）對(duì)萃取結(jié)果的影響，當(dāng)洗脫溶劑體積為3 mL 時(shí)，F(xiàn)e3O4-Cys@CNT 對(duì)CLB 及RAC的萃取效率最佳。

2.4 吸附劑的重復(fù)使用性

為考察Fe3O4-Cys@CNT 的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，將吸附劑連續(xù)用于提取液中CLB 及RAC 的萃取。結(jié)果表明Fe3O4-Cys@CNT 復(fù)合材料性質(zhì)穩(wěn)定，重復(fù)4個(gè)循環(huán)后，萃取效率降低不超過(guò)3%，重復(fù)5個(gè)循環(huán)后，萃取效率降低13.6%，說(shuō)明Fe3O4-Cys@CNT能夠重復(fù)使用4次。

2.5 方法評(píng)價(jià)

2.5.1 線性關(guān)系、檢出限及定量下限在10 mL 空白豬肉提取液中添加不同質(zhì)量濃度的CLB 及RAC標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳MSPE條件下進(jìn)行樣品前處理及UPLC檢測(cè)。以目標(biāo)物的峰面積（Y）與其質(zhì)量濃度（X，μg/L）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。并分別以3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）計(jì)算得到該方法的檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）。結(jié)果表明，CLB 和RAC均在0.5～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.997 4），LOD和LOQ分別為0.15 μg/L和0.50 μg/L。

2.5.2 準(zhǔn)確度與精密度在10 mL 空白豬肉樣品提取液中添加CLB 及RAC 標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制3 個(gè)濃度水平（1、10、100 μg/L）的加標(biāo)樣品溶液，在優(yōu)化條件下進(jìn)行樣品前處理及檢測(cè)（每個(gè)水平平行測(cè)定3 次）。結(jié)果表明，在3 個(gè)加標(biāo)水平下，CLB 的回收率分別為112%、100%和95.1%，RAC 的回收率分別為96.6%、104%和98.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于11%。說(shuō)明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.5.3 與其他方法的對(duì)比表1為所建立的MSPE/UPLC方法與檢測(cè)CLB及RAC的文獻(xiàn)方法的比較結(jié)果。與文獻(xiàn)方法相比，本方法的線性范圍更寬，檢出限比多數(shù)文獻(xiàn)方法更低。此外，F(xiàn)e3O4-Cys@CNT合成時(shí)間僅需25 min，經(jīng)充分干燥后即可使用，且具有制備方式綠色、簡(jiǎn)便、成本低廉等優(yōu)勢(shì)。由于具有磁性，F(xiàn)e3O4-Cys@CNT能夠通過(guò)磁分離的方式從溶液中快速、方便地分離，從而提高了樣品前處理的效率。

表1 建立的MSPE方法與其他用于測(cè)定不同樣品中CLB及RAC方法的比較Table 1 Comparison of the developed MSPE method with other methods for the determination of CLB and RAC in different samples

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

從當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)隨機(jī)抽取5 份（1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)、4 號(hào)、5 號(hào)）豬肉樣品，采用本方法測(cè)定其中CLB 及RAC 的含量。其中3 號(hào)和5 號(hào)樣品中檢出CLB，質(zhì)量濃度分別為0.76 μg/L 和1.5 μg/L，均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 5009.192-2003）規(guī)定的最高允許添加量［14］。圖3A 為5 號(hào)陽(yáng)性豬肉樣品的色譜圖，圖3B 為1號(hào)豬肉空白樣品、加標(biāo)及加標(biāo)萃取后的色譜圖。由圖可見(jiàn)，經(jīng)MSPE處理后，目標(biāo)物的峰形良好，峰信號(hào)顯著增強(qiáng)，雜峰減少，表明有效去除了基質(zhì)干擾。

圖3 5號(hào)陽(yáng)性豬肉樣品（A）與1號(hào)豬肉樣品（B）的色譜圖Fig.3 Chromatograms of a No.5 positive pork sample（A）and a No.1 pork sample（B）

3 結(jié) 論

本研究在超聲輔助條件下，使用低成本、環(huán)保的化學(xué)試劑，通過(guò)簡(jiǎn)便的氧化-沉淀法制備了羧基功能化磁性碳納米管復(fù)合材料Fe3O4-Cys@CNT。該材料兼具Fe3O4及CNT 的優(yōu)勢(shì)，L-Cys 的成功修飾使吸附劑表面具有豐富的活性基團(tuán)，這些特點(diǎn)使得Fe3O4-Cys@CNT 易于固液分離，具有萃取時(shí)間短（萃取和洗脫時(shí)間共20 min）、萃取效率較高（RAC 和CLB 的萃取效率分別為85.87%、83.06%）等優(yōu)勢(shì)。以Fe3O4-Cys@CNT 作為吸附劑，建立了同時(shí)檢測(cè)豬肉樣品中痕量CLB 及RAC 的MSPE/UPLC 方法。該方法對(duì)CLB及RAC的LOD均為0.15 μg/L，回收率為95.1%～112%，RSD小于11%，為復(fù)雜食品和生物樣品中瘦肉精的檢測(cè)提供了新思路。