一種通過水光譜探究木犀草素濃度測定的新方法

馮昱龍，賀小剛，韓 想，于佳萍，楚剛輝

（新疆特色藥食用植物資源化學(xué)實驗室 喀什大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844000）

木犀草素（Luteolin）是一種常見的天然黃酮類化合物，存在于多種植物中，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等多種生理活性，富含木犀草素的藥物常用于治療心腦血管等疾病［1］。目前，木犀草素的常見檢測方法有高效液相色譜法（HPLC）［2］、反相高效液相色譜法（RP-HPLC）［3］、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）［4］、毛細(xì)管電泳-二極管陣列檢測法（PCE-DAD）［5］等。這些方法雖具有很好的選擇性，但存在分析速度慢、操作較繁瑣、分析成本高、需使用有毒溶劑等缺陷［6］。

“水光譜組學(xué)（Aquaphotomics）”由日本學(xué)者Tsenkova 在2005 年首次提出［7］。水光譜組學(xué)以水為研究對象，分析生命體系的水和各種頻率下近紅外光的相互作用，由于水的OH 鍵很容易被其他分子改變，因此可以通過檢測水分子體系本身的溶質(zhì)變化進(jìn)行研究［8］。水的溶劑化作用和團(tuán)簇構(gòu)造的改變對其結(jié)構(gòu)影響很大，水的近紅外光譜（NIR）中包含了大量的溶質(zhì)信息［9］。不同種類和濃度的溶質(zhì)對水溶劑的影響不同，低濃度溶質(zhì)也會導(dǎo)致水分子結(jié)構(gòu)的變化，因此，近紅外光譜的某些范圍頻譜可以放大溶質(zhì)的信息，甚至可以測量非常低的溶質(zhì)濃度。近紅外光譜法不需要衍生化或其他繁瑣費時的樣品制備過程，檢測不破壞樣品，具有較大的優(yōu)勢。

水光譜組學(xué)的應(yīng)用十分廣泛，由于活性成分對水結(jié)構(gòu)的影響可以改變近紅外光譜中水的光譜信息，將溶液中除水之外的物質(zhì)當(dāng)作擾動因素（如濃度、溫度等）分析光譜中的譜峰變化，可以探究待測物質(zhì)的特性。趙洪濤等［10］將水光譜組學(xué)用于探究低溫水的結(jié)構(gòu)；Chatani等［11］利用實時NIR 光譜和水光譜組學(xué)對胰島素的淀粉樣沉淀過程進(jìn)行了研究；Czarnecki等［12］研究了溫度對N-甲基乙酰胺水溶液結(jié)構(gòu)的影響。同時，近紅外光譜結(jié)合水光譜組學(xué)己成功用于測定低含量的蛋白［13］、糖［14］、鹽和酸［15］等。但這種方法在活性成分研究上并不多見，利用水光譜進(jìn)行低含量木犀草素的測定也未見相關(guān)報道。

物質(zhì)在近紅外譜區(qū)的倍頻和合頻吸收信號弱，譜帶重疊，解析復(fù)雜，而偏最小二乘法（PLS）有較強(qiáng)的信息提取能力，能夠有效降維，并消除自變量間可能存在的復(fù)共線關(guān)系，明顯改善數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確度［16］，是近紅外譜最好的研究方法。

本文基于擾動因素對水光譜的影響，采用Kennard-Stone（KS）法進(jìn)行校正集和驗證集的劃分篩選，通過近紅外光譜方法對低濃度的木犀草素進(jìn)行定量分析，為水環(huán)境下準(zhǔn)確測定木犀草素濃度提供了一種新的可能性和方便高效的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

AntarisⅡ近紅外光譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；SME204E 電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；木犀草素（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、無水乙醇（色譜純，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司）。

1.2 實驗方法

稱取20 mg 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品，加無水乙醇定容至200 mL，得到100 mg/L 的木犀草素乙醇溶液。將配制好的木犀草素乙醇溶液、超純水、無水乙醇置于25 ℃恒溫水浴鍋中待測。取木犀草素乙醇溶液，分別加入不同體積（0.1、0.3、0.5 mL）的水，用乙醇定容，并使溶液總體積為2 mL，配制3 組樣品，即各組中水的體積分別為0.1、0.3、0.5 mL，每組30 個，各組的木犀草素質(zhì)量濃度范圍均為50～80 mg/L（0.17～0.27 mmol/L），梯度為1 mg/L。

1.3 光譜測量

將AntarisⅡ傅里葉變換近紅外光譜儀于室溫下預(yù)熱1 h，選擇透射模塊采集樣品光譜，測量90 個樣本的近紅外光譜，掃描波數(shù)范圍為4 000～10 000 cm?1，儀器分辨率為4 cm-1，測量時儀器每隔1 h自行進(jìn)行背景校正。每個樣品的近紅外光譜均經(jīng)過64 次掃描，重復(fù)3 次，將3 次測量的結(jié)果取平均值作為樣品的最終光譜數(shù)值。為提高近紅外光譜的靈敏度，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)，采用PLS方法構(gòu)建模型。

1.4 樣本篩選

KS 法［17］是將所有樣本均看作校正集的候選樣本，首先選擇歐氏距離或馬氏距離最遠(yuǎn)的兩個樣本對進(jìn)入校正集，計算剩余候選樣本中的樣本到校正集中每個已選樣本的距離，找出最小距離值樣本和最大距離值樣本，加入到校正集中，重復(fù)此步驟，直至校正集樣本數(shù)目滿足要求。在建立近紅外定量模型的過程中，KS法基于各個樣本的近紅外光譜數(shù)據(jù)計算兩樣本間的距離，即dx（p，q）是基于近紅外光譜數(shù)據(jù)x計算p、q兩樣本間的距離，其計算公式見式（1）。由此選出的校正樣本能夠均勻地覆蓋整個樣本集實驗區(qū)域，所建模型的預(yù)測能力較好。

1.5 定量模型的建立

利用KS法進(jìn)行樣品校正集和驗證集的劃分，隨后篩選最佳的光譜預(yù)處理方法，以提高模型的準(zhǔn)確性和有效性。在此基礎(chǔ)上，探討利用木犀草素對水光譜的擾動變化測定低濃度木犀草素的可行性，建立用于木犀草素濃度測定的PLS定量模型。

2 結(jié)果與討論

2.1 木犀草素對水近紅外吸收光譜的擾動

由于木犀草素在水中的溶解度較小，易溶于乙醇，首先考察了不同含量（0～100%乙醇，以10%遞增）乙醇-水溶液的光譜，見圖1A。對“1.2”方法配制的含0.5 mL 水的木犀草素溶液進(jìn)行近紅外光譜掃描，選擇濃度間隔相等的樣品做圖，得到圖1B。從圖1A 可以看出，隨著乙醇含量的增加，位于6 900 cm?1和5 170 cm-1處的2 個吸收峰的強(qiáng)度逐漸減弱，這主要歸因于體系中水量的減少和氫鍵網(wǎng)絡(luò)的改變。上述2 個譜峰分別歸屬為OH 基團(tuán)伸縮振動的一級倍頻和OH 基團(tuán)彎曲及伸縮振動的組合頻。由于水結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，6 900 cm?1處的寬峰中包含了各種不同結(jié)構(gòu)OH 基團(tuán)的光譜信息，導(dǎo)致譜峰表現(xiàn)為很寬的重疊峰［18］，各峰的峰值由于差距較小，且與5 170 cm?1處的吸收相比靈敏度較低，線性關(guān)系可能較差。從圖1A 還可以看出，5 170 cm-1處吸收峰的峰高隨著水量的增加而增加，最高峰為純水峰，最低峰為乙醇峰，說明此處的峰受含水量影響大，因此，在后續(xù)分析中主要研究了5 170 cm?1附近區(qū)域光譜的譜峰變化。對于圖1B 中5 170 cm?1附近區(qū)域的光譜，因溶液中木犀草素的濃度較低，30個樣品的光譜圖很難用肉眼區(qū)分。由圖1C可見，隨著木犀草素質(zhì)量濃度的增加，5 170 cm?1附近的光譜峰逐漸下降，這可能是因為木犀草素與水之間存在相互作用并導(dǎo)致水結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

圖1 不同含量乙醇-水溶液（A）和0.5 mL木犀草素水溶液在25 ℃（B）的近紅外吸收光譜及后者在4 800～5 500 cm-1處的放大圖像（0.17～0.27 mmol/L）（C）Fig.1 Near infrared absorption spectra of different contents ethanol-water solutions（A），0.5 mL luteolin solution at 25 ℃（B）and its’enlarged images ranging from 4 800 cm-1 to 5 500 cm-1（0.17-0.27 mmol/L）（C）

2.2 不同含水量木犀草素溶液的近紅外吸收光譜

為考察不同含水量木犀草素溶液的濃度與水光譜峰變化之間的關(guān)系，采集“1.2”配制的含水量分別為0.5、0.3、0.1 mL 的木犀草素溶液在25 ℃時的近紅外吸收光譜，其在5 170 cm-1附近的放大圖如圖2插圖所示。結(jié)果顯示，在不同含水量木犀草素溶液中，隨著木犀草素濃度的增加，5 170 cm-1處的峰高均逐漸下降。

圖2 不同濃度木犀草素溶液在25 ℃時的近紅外吸收光譜Fig.2 Near infrared absorption spectra of different concentrations luteolin solutions at 25 ℃the illustrations are enlarged images；water volume（A-C）：0.5，0.3，0.1 mL

2.3 光譜預(yù)處理方法

由于不同濃度樣品的光譜差異性很小，為了考察不同含水量木犀草素溶液的濃度與水光譜峰變化之間的關(guān)系，需采用化學(xué)計量學(xué)方法放大光譜差異。由

圖3 0.3 mL木犀草素溶液的近紅外吸收光譜差譜圖Fig.3 Difference spectrum of near infrared absorption spectrum of 0.3 mL luteolin solution

圖4 0.3 mL含水量下不同濃度木犀草素吸光度差異的雷達(dá)圖Fig.4 Radar diagram of absorbance differences of luteolin at different concentrations in 0.3 mL water

2.4 不同濃度木犀草素水光譜定量校正模型的建立

以PLS 建立木犀草素溶液的定量校正模型，將90 個 樣 品 光 譜 經(jīng) 過 無 處 理、 一 階 導(dǎo) 數(shù)（1st）、Savitzky-Golay 平滑（SG）、連續(xù)小波變換（CWT）、多元散射校正（MSC）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換（SNV）、MSC+CWT、SNV+1st 等光譜預(yù)處理［21-23］，再通過蒙特卡洛交叉驗證（MCCV）法［24］確定模型的因子數(shù)（Component number），選擇波數(shù)范圍為4 450～5 800 cm-1。經(jīng)KS變量優(yōu)選獲得最優(yōu)校正集，并獲得更佳的定量模型，KS-PLS由Matlab R2014軟件實現(xiàn)。

由于所得近紅外光譜中既包含木犀草素的光譜信息，也包含其他雜質(zhì)信息，因此本研究采用合適的光譜預(yù)處理方法提取特征信息后再進(jìn)行分析。表1 為各種光譜預(yù)處理后得到的木犀草素定量模型的預(yù)測能力，以交叉驗證均方根誤差（RMSECV）、相關(guān)系數(shù)R值和預(yù)測殘差值（RPD）作為評價模型的指標(biāo)，其中，RMSECV 值反映了校正模型結(jié)果的誤差，一般RMSECV 值越小定量結(jié)果準(zhǔn)確度越好。RPD值反映了定量模型的預(yù)測能力，一般RPD 值越大定量結(jié)果越好［25］。由表1 可知，光譜預(yù)處理后，木犀草素樣品的變量數(shù)均為1 557個，主因子數(shù)最大為9；其中CWT的RMSECV 誤差最小，SNV的R和RPD值最大。綜合來看，SNV 預(yù)處理的數(shù)據(jù)較好，能夠達(dá)到定量分析的要求。此時定量模型的RMSECV 為1.947 8，RPD為4.292 7，說明模型穩(wěn)健，誤差小。

表1 經(jīng)過KS處理的木犀草素PLS 模型的結(jié)果Table 1 Results of luteolin PLS model with KS treatment

2.5 不同濃度木犀草素水光譜模型的驗證

預(yù)測均方根誤差（RMSEP）反映了預(yù)測模型的誤差，RMSEP 值越小表示預(yù)測結(jié)果越準(zhǔn)確。使用6個外部預(yù)測集樣品檢驗所建木犀草素定量校正模型的預(yù)測能力，預(yù)測集的實驗條件與校正集基本相同。采用SNV 光譜預(yù)處理后進(jìn)行驗證，并建立了預(yù)測濃度與參考濃度之間的關(guān)系圖（圖5），得到預(yù)測的R為0.994 7，RMSEP 為2.077 7，預(yù)測集的樣本回收率為98.0%～105%。結(jié)果表明，所建光譜模型的定量預(yù)測效果較好，能夠更準(zhǔn)確地進(jìn)行木犀草素含量的測定。

圖5 木犀草素參考濃度和預(yù)測濃度的相關(guān)關(guān)系Fig.5 Correlation between reference and predicted concentration of luteolin

3 結(jié) 論

本文以木犀草素為對象，基于近紅外光譜快速、無損的優(yōu)勢，通過研究木犀草素對水近紅外吸收光譜的擾動，建立了一種水溶液中木犀草素濃度的快速檢測方法。采用差譜技術(shù)使光譜差距可視化，并比較了不同光譜預(yù)處理方法的效果，最終確定采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換法進(jìn)行光譜預(yù)處理，通過PLS法建立定量校正模型，模型的相關(guān)系數(shù)R為0.994 7，RMSECV為1.947 8，RPD為4.292 7。用該模型預(yù)測6 個外部樣品組成的預(yù)測集，其RMSEP 為2.077 7，回收率為98.0%～105%。結(jié)果證明近紅外光譜技術(shù)結(jié)合水光譜組學(xué)為低濃度木犀草素的測定提供了新的方法，為水中其他活性成分的測定提供了一種新的思路。