基于混合吸附劑磁性固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水中磺胺和喹諾酮類抗生素殘留

魏 丹，張 菊，國 明

（1.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050061；2.浙江省化工研究院有限公司分析測試中心，浙江 杭州 310023）

抗生素作為一種基礎(chǔ)用藥，在各種常見的細菌性疾病治療中發(fā)揮了重要作用［1］，已廣泛應(yīng)用于臨床、畜牧和水產(chǎn)等領(lǐng)域［2］。但由于長期不合理使用并不斷排放進入環(huán)境，大多數(shù)抗生素會沉積或遷移到水體、沉積物和土壤等環(huán)境介質(zhì)形成污染，影響環(huán)境中微生物的生態(tài)平衡。目前，抗生素在我國河流、地下水、湖泊和海洋等天然水體中均有不同程度的檢出［3］。該類藥物進入環(huán)境后難分解，可通過飲用水、食物鏈等方式進入人體，對人體健康造成潛在的風(fēng)險。因此，建立準確、靈敏、可靠的檢測該類抗生素殘留含量的分析方法十分必要。

水體中抗生素殘留常用的檢測方法主要有毛細管電泳法（CE）［4］、高效液相色譜法（HPLC）［5］、高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）［6］等。其中HPLC-MS 法具有靈敏高效、快速準確和專屬性強等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于抗生素殘留分析［7］。由于水體中抗生素的濃度極低，且存在大量干擾物，在儀器檢測前通常需對待測物進行分離和富集。目前用于環(huán)境水體中抗生素的樣品前處理技術(shù)主要有固相萃取（SPE）［7］、磁性固相萃?。∕SPE）［8］、QuEChERS［9］等。QuEChERS適用于多種抗生素的檢測，操作簡便，分析快速，但其選擇性吸附效果和凈化效果比SPE 差。MSPE 是以磁性材料為吸附劑的一種新型SPE，與傳統(tǒng)SPE相比，MSPE具有前處理步驟簡單、有機溶劑消耗少、目標物回收率較高、樣品不易損失等優(yōu)點，已被用于抗生素的檢測中［10-11］。目前關(guān)于抗生素藥物MSPE 萃取的研究報道通常采用一種磁性材料，與目標物相互作用的活性位點較為單一，很難滿足多種類目標物同時測定的檢測要求［12-15］。采用混合吸附劑進行萃取可有效提高對不同種類待測物的萃取能力［16］，但基于混合吸附劑的樣品前處理方法在抗生素檢測中的應(yīng)用鮮有報道。

為滿足水中多種類抗生素的同時測定需求，提高對不同目標物的萃取能力，本研究通過制備磁性大孔有機共聚物材料（Fe3O4@SiO2@PLS）和磁性金屬有機骨架材料（Fe3O4@ZIF-8），將兩種材料共同作為磁性吸附劑，通過優(yōu)化磁性萃取劑用量、吸附時間、樣品pH 值、洗脫劑種類和洗脫時間等實驗條件，建立了檢測實際水樣中常見的4種磺胺類和8種喹諾酮類抗生素的MSPE/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290 infinity 高效液相色譜-6460 Triple Quad 質(zhì)譜儀（帶自動進樣器，美國Agilent 公司）；ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm × 3.0 mm，1.8 μm，美國Agilent 公司）；Milli-Q 超純水器（美國Millipore 公司）；0.22 μm 微孔濾膜（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；KQ-100DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；S-4700型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM，日本Hitachi公司）；傅里葉變換紅外光譜分析儀（FT-IR，德國Bruker公司）。

標準物質(zhì)：磺胺吡啶、馬波沙星、磺胺二甲基嘧啶、氟羅沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、奧比沙星、磺胺異唑、磺胺多辛、喹酸、萘啶酸（純度均≥95%，北京迪馬科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Sigma-Aldrich 公司）；其他試劑均為分析純；乙二醇、二氯甲烷、甲酸、乙酸、氨水等（分析純，杭州雙林化工試劑廠）；三氯化鐵（FeCl3·6H2O）、2-甲基咪唑、硝酸鋅（Zn（NO3）2）、正硅酸乙酯（TEOS）、二乙烯基苯（DVB）、N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）、偶氮二異丁腈（AIBN）、甲基丙烯酸3-（三甲氧基硅基）丙酯（MPS）（Sigma Aldrich 試劑公司）；實驗用水為超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm），由Millipore 超純水發(fā)生器制備。

1.2 溶液配制

準確稱取標準物質(zhì)各0.100 0 g 于100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到1 g/L 的標準儲備溶液，于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存。使用時，用水稀釋至所需濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 磁性凈化材料的制備

首先，采用溶劑熱法制備Fe3O4納米顆粒［17］，用于后續(xù)制備Fe3O4@SiO2@PLS和Fe3O4@ZIF-8。

1.3.1 Fe3O4@SiO2@PLS 的制備參照文獻［18］方法，使用硅烷化試劑TEOS 在Fe3O4表面形成硅層得到Fe3O4@SiO2，然后加入MPS，通過溶膠-凝膠法與Fe3O4@SiO2表面形成雙鍵基團，得到Fe3O4@SiO2@MPS。

稱取3 g Fe3O4@SiO2@MPS 置于1 000 mL 三口燒瓶中，加入500 mL 乙腈，超聲10 min，依次加入6.3 mL DVB、7.5 mL NVP 和0.18 g AIBN，超聲5 min 分散均勻，將燒瓶轉(zhuǎn)移至蒸餾裝置中，收集乙腈，于75 ℃預(yù)聚合反應(yīng)20 min，115 ℃聚合反應(yīng)1 h。反應(yīng)完成后靜置冷卻至室溫，加入蒸餾收集到的乙腈（約150～200 mL），超聲分散后，在外加磁場作用下收集沉淀物，依次用乙腈和乙醇清洗3次，于室溫（25 ℃）干燥，即得核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4@SiO2@PLS。

1.3.2 Fe3O4@ZIF-8 的制備通過低溫水熱法制備Fe3O4@ZIF-8［19］。具體步驟為：稱取0.5 g Fe3O4納米粒子置于燒杯中，加入50 mL 甲醇，攪拌至分散均勻，加入50 mL 2-甲基咪唑甲醇（0.609 mmol·L-1），攪拌至混合均勻。加入50 mL Zn（NO3）2·6H2O 甲醇溶液（0.084 mmol·L-1），轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，70 ℃下水熱反應(yīng)2 h。反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，使用磁鐵分離收集沉淀物，用水和乙醇交替沖洗3次至近中性，所得黑色粉末于60 ℃真空條件下干燥6 h。

1.4 混合吸附劑MSPE萃取

采集的水樣經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾去除懸浮顆粒物，加入HAc 和NH3·H2O 調(diào)至pH 7.0。稱取磁性材料Fe3O4@SiO2@PLS（35 mg）和Fe3O4@ZIF-8（15 mg）置于50 mL 燒杯中，依次用甲醇、去離子水清洗和活化，然后加入10 mL水樣或混合標準溶液（5 μg/L），超聲10 min加速對目標物的吸附；用磁鐵將磁性吸附劑分離收集在燒杯底部，棄去上清液。加入10 mL 5%（體積分數(shù)）氨水甲醇溶液超聲5 min，分3次重復(fù)進行洗脫，合并洗脫溶液在N2下吹至近干，然后溶于1 mL 水中，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，待HPLC-MS/MS分析。萃取流程如圖1所示。

圖1 混合模式MSPE示意圖Fig.1 Schematic illustration for mixed mode magnetic solid phase extraction

1.5 儀器條件

液相色譜條件：ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm × 3.0 mm，1.8 μm）；柱溫：35 ℃，流速：0.3 mL·min-1；進樣體積：2 μL；流動相為甲醇（A）和0.1%（體積分數(shù)）甲酸水溶液（B）。梯度洗脫程序：0～1 min，10% A；1～7 min，10%～40% A；7～10 min，40%～60% A；10～11 min，60%～90%A；11～12 min，90%～10%A，分析時間15 min。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子化源（ESI），采用正離子檢測模式；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進行定量分析。干燥氣（N2）溫度為300 ℃，干燥氣流速為5 L·min-1；霧化氣（N2）壓力為310 kPa；鞘氣（N2）溫度為250 ℃，鞘氣流速為10 L·min-1；毛細管電壓為4 500 V，噴嘴電壓為0 V。質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 12種抗生素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for the 12 antibiotics residues

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性凈化材料的表征

Fe3O4、Fe3O4@SiO2@PLS和Fe3O4@ZIF-8的掃描電鏡圖見圖2。采用溶劑熱法制備的Fe3O4磁性納米顆粒呈規(guī)則的球形，表面相對光滑，顆粒形狀大小較為均勻，具有較大的比表面積（圖2A）。由雙層復(fù)合核殼結(jié)構(gòu)Fe3O4@SiO2@PLS 的掃描電鏡（圖2B）可見，復(fù)合物呈較規(guī)則的球形，尺寸約為500～600 nm，且未見Fe3O4納米顆粒，表明核殼結(jié)構(gòu)Fe3O4@SiO2@PLS 磁性納米材料制備成功。由圖2C 可以看出Fe3O4成功附著于正六邊形ZIF-8 晶體表面，尺寸約為200 nm，表明Fe3O4@ZIF-8 磁性納米材料制備成功。

圖2 Fe3O4（A）、Fe3O4@SiO2@PLS（B）和Fe3O4@ZIF-8（C）的掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of Fe3O4（A），F(xiàn)e3O4@SiO2@PLS（B）and Fe3O4@ZIF-8（C）

采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）對Fe3O4@SiO2@PLS 和Fe3O4@ZIF-8 進行表征，如圖3A 所示，580 cm-1的特征吸收峰對應(yīng)Fe3O4的Fe—O—Fe 伸縮振動［20］，1 068.0 cm-1的峰對應(yīng)Si—O—Si 基團的面內(nèi)伸縮振動［21］，1 634.4、3 436.5 cm-1的峰分別對應(yīng)Si—OH 的彎曲振動和伸縮振動［22］。圖3A 中同時包括Fe3O4和PLS 材料的特征吸收峰，進一步表明PLS 成功包覆于磁性粒子Fe3O4表面。如圖3B 所示，422.8 cm-1的峰對應(yīng)Zn—N 的伸縮振動，說明Zn2+與2-甲基咪唑結(jié)合，588.9 cm-1的特征吸收峰對應(yīng)磁核的Fe—O—Fe 伸縮振動，1 384.1 cm-1的特征吸收峰對應(yīng)ZIF-8 中咪唑環(huán)的伸縮振動，1 569.8 cm-1的吸收峰是由于ZIF-8 結(jié)構(gòu)中咪唑分子C===== N 的伸縮振動引起［23］，3 434.0 cm-1的吸收峰是由于Fe3O4的—OH 伸縮振動引起［24］，圖3B 中同時包括Fe3O4和ZIF-8 材料的特征吸收峰，進一步表明ZIF-8 成功負載在Fe3O4的表面。

圖3 Fe3O4@SiO2@PLS（A）和Fe3O4@ZIF-8（B）的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of Fe3O4@SiO2@PLS（A）and Fe3O4@ZIF-8（B）

Fe3O4、Fe3O4@SiO2@PLS和Fe3O4@ZIF-8的X-射線衍射圖如圖4 所示，30.12°、35.47°、43.11°、53.49°、57.06°和62.62°處 的 特 征 峰 對 應(yīng) 于Fe3O4的（222）、（331）、（400）、（422）、（511）和（440）晶面［25］，12.7°、14.7°、16.4°、18.0°、22.1°、24.5°、26.7°、29.6°和30.6°處的特征峰對應(yīng)于ZIF-8的（112）、（113）、（022）、（222）、（114）、（223）、（134）、（044）和（244）晶面［26］。上述Fe3O4和ZIF-8 特征峰在Fe3O4@ZIF-8 的XRD 圖中出現(xiàn)，由于無定型結(jié)構(gòu)PLS 無尖峰，F(xiàn)e3O4@SiO2@PLS 中的峰與Fe3O4特征峰相對應(yīng)，以上結(jié)果說明Fe3O4@ZIF-8和Fe3O4@SiO2@PLS成功制備。

圖4 Fe3O4、Fe3O4@SiO2@PLS和Fe3O4@ZIF?8的X-射線衍射圖Fig.4 XRD images of Fe3O4，F(xiàn)e3O4@SiO2@PLS and Fe3O4@ZIF?8

2.2 混合吸附劑MSPE條件的優(yōu)化

吸附條件和洗脫條件是影響MSPE 的關(guān)鍵因素?？疾炝宋綏l件和洗脫條件對12 種抗生素萃取效率的影響，每組試驗平行測定3次。

2.2.1 吸附條件的選擇2種磁性材料的組合使用增加了官能團活性位點，增強了其與目標物之間的相互作用，如范德華力（Fe3O4@ZIF-8）、孔徑選擇性（Fe3O4@ZIF-8和Fe3O4@SiO2@PLS）、π-π共軛相互作用（Fe3O4@ZIF-8和Fe3O4@SiO2@PLS）和親水親脂作用（Fe3O4@SiO2@PLS）。因此，2種磁性吸附劑的用量決定了萃取效率。固定磁性吸附劑的總用量為50 mg，考察了Fe3O4@SiO2@PLS和Fe3O4@ZIF-8不同用量組合（50+0 mg、15+35 mg、25+25 mg、35+15 mg和0+50 mg）對水樣中12種抗生素萃取回收率的影響。結(jié)果顯示，單獨使用Fe3O4@SiO2@PLS（50 mg）時，馬波沙星、氟羅沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、奧比沙星和磺胺異唑的回收率僅為30.5%～60.3%，單獨使用Fe3O4@ZIF-8（50 mg）時，8種喹諾酮類藥物的回收率僅為28.2%～41.6%。組合使用2種磁性吸附劑的回收率優(yōu)于單一磁性吸附劑，當Fe3O4@SiO2@PLS和Fe3O4@ZIF-8的組合用量為35+15 mg時，回收率大于75%的目標物個數(shù)最多，12種目標物的回收率為75.1%～103%。因此，選擇最佳組合用量為35 mg Fe3O4@SiO2@PLS和15 mg Fe3O4@ZIF-8。

合適的吸附方式和充足的吸附時間可保證目標物與磁性吸附劑充分的相互作用，達到吸附平衡，有效提升萃取效率?？疾炝藴u旋振蕩和超聲萃取2 種方式對目標物回收率的影響。結(jié)果表明，磁性吸附劑用量為35 mg Fe3O4@SiO2@PLS 和15 mg Fe3O4@ZIF-8，吸附時間為10 min 時，采用渦旋振蕩和超聲萃取對12 種目標物的回收率分別為70.3%～90.4%和72.9%～96.9%，實驗最終選擇超聲萃取方式。進一步考察了不同超聲吸附時間（1、2、5、10、15 min）對目標物回收率的影響（如圖5A），當吸附時間為1～10 min 時，12 種目標物的萃取回收率隨吸附時間的增加而增大，超聲吸附10 min 達到最優(yōu)吸附效果，繼續(xù)增加吸附時間，萃取回收率基本保持不變。因此，選擇超聲吸附時間為10 min。

由于磺胺類和喹諾酮類藥物多為兩性化合物，磺胺類具有芳氨基和磺酰胺基，喹諾酮類含有氨基和羧基，樣品溶液pH 值會影響兩性目標物的存在狀態(tài)以及磁性吸附劑的官能團活性，使得目標物與2種磁性材料之間形成氫鍵作用、靜電作用等進而影響萃取回收率?？疾炝藰悠啡芤簆H 值對目標物回收率的影響（如圖5B），當樣品溶液pH 值為4～7 時，12種目標物的萃取回收率隨pH 值的增加而增大，繼續(xù)增加pH值至9，萃取回收率反而下降。因此，最終選擇樣品溶液pH值為7。

圖5 超聲吸附時間（A）和樣品溶液pH值（B）對12種抗生素萃取效率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic adsorption time（A）and the pH of sample solution（B）on the extraction efficiencies of 12 antibiotics

2.2.2 洗脫條件的選擇洗脫劑是影響MSPE萃取效率的重要因素之一。由于大多數(shù)磺胺類和喹諾酮類藥物為極性化合物，易溶于甲醇和乙腈等極性溶劑，文獻多選擇甲醇和乙腈作為洗脫劑［22-26］。由于甲醇的沸點低于乙腈，更易揮發(fā)濃縮，因此實驗選擇甲醇作洗脫劑，進一步對比了體積均為10 mL 的甲醇、2%甲酸甲醇溶液、5%氨水甲醇溶液對12 種目標物的洗脫效果。如圖6A 所示，以2%甲酸甲醇溶液作為洗脫劑時目標物的回收率＜10.8%，使用5%氨水甲醇溶液時的回收率優(yōu)于2%甲酸甲醇。由于堿性條件下大多數(shù)目標物和磁性材料表面呈負電模式，形成靜電斥力有利于洗脫，當洗脫劑為5%氨水甲醇溶液時，12種目標物的回收率為74.9%～118%，洗脫效果最優(yōu)。因此，最終選擇10 mL 5%氨水甲醇溶液作為洗脫劑。同時考察了不同超聲洗脫時間（2～10 min）對目標物萃取回收率的影響。如圖6B所示，當洗脫時間為2～5 min時，12種目標物的萃取回收率隨洗脫時間的增加而增大，當洗脫時間為5 min時，12種目標物的萃取回收率達到最大值，繼續(xù)增加洗脫時間，萃取回收率基本保持穩(wěn)定，因此超聲洗脫時間選擇5 min。

圖6 洗脫劑種類（A）與洗脫時間（B）對12種抗生素萃取效率的影響Fig.6 Effect of the type of elution solvent（A）and the elution time（B）on the extraction efficiencies of 12 antibiotics

2.3 方法驗證

配制系列質(zhì)量濃度（0.5、1、2、5、10 μg/L）的12 種抗生素混合標準溶液，在最優(yōu)條件下進行MSPE/HPLC-MS/MS 分析，采用外標法進行定量。以12 種目標物的質(zhì)量濃度為橫坐標（x，μg/L），以對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標（y），進行線性回歸分析得到線性方程。結(jié)果表明，12 種抗生素在0.5～10 μg/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.996 1～0.999 8。分別以3 倍和10 倍信噪比（S/N）確定檢出限（LOD）和定量下限（LOQ），得到12 種抗生素的LOD 和LOQ 分別為0.01～0.14 μg/L 和0.04～0.45 μg/L（見表2）。以1 μg/L空白加標樣品進行3次重復(fù)測定，以所得相對標準偏差（RSD）為日內(nèi)精密度，以連續(xù)測定3 d所得的RSD為日間精密度。如表2所示，12種抗生素的日內(nèi)RSD為0.90%～5.2%，日間RSD為3.9%～10%，表明方法具有良好的精密度。

表2 方法的線性關(guān)系、檢出限、定量下限及相對標準偏差Table 2 Linear relations，LODs，LOQs and RSDs of the developed method

2.4 實際樣品測定

采集杭州市3 類（飲用水、西溪濕地水和西湖水）9 個點位的水樣采用本方法進行測定，結(jié)果表明，所采集的3 種水樣均未檢出12 種抗生素。對空白樣品進行3 個水平（1、5、8 μg/L）的加標回收實驗，每個水平測定3 次，平均加標回收率和RSD 見表3。加標回收率為75.0%～107%，RSD 為0.50%～5.5%，說明所建立方法具有良好的精密度和準確度，適用于實際環(huán)境水樣中12種抗生素的檢測。

表3 實際樣品中12種抗生素的加標回收率Table 3 Recoveries of 12 antibiotics residues in real samples

（續(xù)表3）

3 結(jié) 論

本研究制備了具有良好性能的Fe3O4@SiO2@PLS 和Fe3O4@ZIF-8 磁性材料，2 種磁性材料共同作為吸附劑時，兼具大孔有機共聚物和金屬有機骨架的吸附優(yōu)勢。對影響MSPE 萃取效率的主要因素進行了優(yōu)化，建立了混合模式MSPE/HPLC-MS/MS測定水中12種抗生素殘留的分析方法。與其他應(yīng)用于抗生素的MSPE 方法相比，具有簡便快速、有機溶劑用量少和樣品不易損失等優(yōu)點。本文的磁性吸附劑制備方法簡便，分析方法適用性高，通過調(diào)節(jié)2 種磁性吸附劑的組合用量，實現(xiàn)了水中8 種喹諾酮和4種磺胺類抗生素的檢測。