英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽組分咀嚼片配方的研究

董憲慧，李夢竹，穆秋霞，類彥波，崔素萍

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)國家雜糧工程技術(shù)研究中心；4.大慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心）

不良的飲食習(xí)慣、環(huán)境污染以及藥物濫用，會導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生過量的自由基，引發(fā)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)[1]，人體需要額外補(bǔ)充抗氧化劑來維持體內(nèi)氧化/抗氧化平衡。抗氧化劑分為合成抗氧化劑和天然抗氧化劑[2]。合成抗氧化劑由于存在健康風(fēng)險(xiǎn)而受到嚴(yán)格限制[3]。天然抗氧化劑來源廣泛，具有安全、無毒、高效的特點(diǎn)[4]，已成為抗氧化劑領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)?？寡趸淖鳛樘烊豢寡趸瘎寡趸愿?，易于人體消化吸收[5]，還具有治療癌癥、瘧疾、高血壓等疾病的潛力[6-7]。因此，抗氧化肽在食品添加劑、化妝品和保健品等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。

抗氧化肽主要有動物來源和植物來源的[8]，植物蛋白抗氧化肽具有延長食品保質(zhì)期[9-11]、增強(qiáng)記憶[12-13]及醒酒[14]等作用。由于抗氧化肽的粉劑不便于攜帶和食用，片劑可以彌補(bǔ)這一不足。陳安國[15]利用火麻活性肽制備的抗氧化產(chǎn)品口感飽滿，抗氧化活性高，具有降血壓、抗疲勞的功效；劉國飛[16]利用豌豆肽、玉米肽、黑豆肽制備的復(fù)合肽固體飲料和咀嚼片，抗氧化效果好、成本低、易于工業(yè)化生產(chǎn)；邵偉[17]利用大豆肽制作的咀嚼片便于保存攜帶、能緩解身體疲勞。咀嚼片具有易于保存運(yùn)輸，攜帶、食用方便等特點(diǎn)[18]，且嚼碎吞服后產(chǎn)品表面積增加，不需在胃中解崩，易于有效物質(zhì)消化吸收[19]，兼具粉劑和片劑的優(yōu)點(diǎn)，非常適宜承載抗氧化肽產(chǎn)品。

團(tuán)隊(duì)前期研究表明，英國紅蕓豆各抗氧化肽組分的DPPH自由基清除率均大于70%，抗氧化性最強(qiáng)的組分具與維生素C的抗氧化性相近[20]，國外暫無對于蕓豆蛋白抗氧化肽產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用，國內(nèi)僅有張景田[21]利用包括白蕓豆肽在內(nèi)的多種小分子肽制備具有益肌骨損傷愈合功效的固體飲料，研究較少，并未充分發(fā)揮蕓豆蛋白抗氧化肽的利用價(jià)值。擬以英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽組分為主料，研究咀嚼片的最佳配方及壓片條件，為英國紅蕓豆抗氧化肽產(chǎn)品的開發(fā)提供途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

英國紅蕓豆：購于大慶市新瑪特超市；輔料（山楂粉：河北美威藥業(yè)股份有限公司；甘露醇、麥芽糊精、微晶纖維素、硬脂酸鎂：河南千志商貿(mào)有限公司）過80目篩子備用。

堿性蛋白酶：活性≥200000活力單位/克，北京鑫澤天佑生物科技有限公司；DPPH：北京博奧拓達(dá)科技有限公司；維生素C：天津金?；瘜?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、膽酸鈉：北京索萊寶科技有限公司；煌綠乳糖膽鹽肉湯、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-4A型粉末壓片機(jī)：天津市拓普儀器有限公司；CHRIST Alpha型冷凍干燥機(jī)：德國Marin Christ公司；U-2910紫外可見分光光度計(jì)：上海斯邁歐分析儀器有限公司；ZBS-6E智能崩解試驗(yàn)儀：天津市天大天發(fā)科技有限公司；WB-98A型片劑脆碎度：北京國立和分析儀器技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽組分的制備

英國紅蕓豆蛋白質(zhì)的提取及抗氧化肽組分的制備方法見參考文獻(xiàn)[22]，抗氧化肽組分真空冷凍干燥后低溫儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抗氧化肽組分咀嚼片的研制

（1）單因素試驗(yàn)

在硬脂酸鎂添加量1%、微晶纖維素添加量適當(dāng)調(diào)整的條件下，分別考察主料（40%、50%、60%、70%、80%）、麥芽糊精（3%、4%、5%、6%、7%）、甘露醇（10%、15%、20%、25%、30%）、山楂粉（1%、2%、3%、4%、5%）等添加量對咀嚼片感官品質(zhì)的影響，每個(gè)處理做3次重復(fù)。

（2）正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對咀嚼片配方進(jìn)行正交優(yōu)化，采取L9（33）正交設(shè)計(jì)，進(jìn)一步確定咀嚼片的配方。

（3）驗(yàn)證試驗(yàn)

按照正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)組合制作咀嚼片并進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.3 咀嚼片評價(jià)

（1）感官品質(zhì)評價(jià)

選擇10位身體健康的食品科學(xué)與工程專業(yè)在讀研究生，對咀嚼片進(jìn)行感官評定，評分標(biāo)準(zhǔn)[23]見表1。

表1 英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽組分咀嚼片感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory scoring criteria for British red kidney bean protein antioxidant peptide component chewable tablets

（2）片重差異、脆碎度的分析

由大慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心按照《中國藥典》（2015版）[24]方法測定咀嚼片的重量差異和脆碎度。

（3）微生物指標(biāo)分析

依據(jù)GB/T 4879.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-菌落總數(shù)測定》和GB/T 4879.3-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)—大腸菌群計(jì)數(shù)》分別對咀嚼片進(jìn)行微生物指標(biāo)分析。

（4）人體每日服用劑量的確定

將維生素C和英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽組分按質(zhì)量濃度分別為1、2、4、5、10、20、40、50 mg·mL-1進(jìn)行羥基自由基清除率的測定，通過維生素C每日的攝入量確定咀嚼片的攝入量。

1.3.4 抗氧化性分析

參照參考文獻(xiàn)[25]的方法對英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽組分、咀嚼片及咀嚼片中肽組分的DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率和還原力進(jìn)行測定。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

利用IBM SPSSStatistics 23軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化肽組分咀嚼片的制備

2.1.1 抗氧化肽組分添加量對咀嚼片感官質(zhì)量的影響

固定混合料中其它輔料的添加比例，抗氧化肽組分添加量對咀嚼片感官品質(zhì)的影響見表2。

表2 抗氧化肽組分及麥芽糊精添加量對咀嚼片感官品質(zhì)的影響Table 2 Effects of antioxidant peptide content and maltodextrin content on sensory quality of chewable tablets

當(dāng)添加量為60%時(shí)，感官評分最高，且差異顯著（P＜0.05）。因此，在咀嚼片的配方中，確定肽組分的添加量為60%?？寡趸慕M分顏色為淺棕色，味苦澀并有特殊的味道。隨著抗氧化肽組分添加量的增加，咀嚼片顏色逐漸變深，苦味和肽特有的味道逐漸增加。由于肽具有吸濕性，吸濕后的肽會表現(xiàn)出流動性差、黏性強(qiáng)等不良特點(diǎn)，影響片劑的可壓性[26]。當(dāng)肽含量逐漸增大時(shí)，肽吸收的水分受擠壓到顆粒表面將可溶物質(zhì)溶解，待壓力撤除后溶解物析出，相鄰顆粒間產(chǎn)生“固體橋”，使顆粒間牢固結(jié)合，咀嚼片表面因而固結(jié)成塊[27]，導(dǎo)致表面粗糙度增加，硬度逐漸增大。

2.1.2 麥芽糊精添加量對咀嚼片感官質(zhì)量的影響

麥芽糊精口感滑膩、具有特殊的糊味，易被人體消化吸收。因其具有溶解性、穩(wěn)定性和填充效果較佳、吸濕性低、粘結(jié)性較強(qiáng)等特點(diǎn)，常被用作粉末壓片中的填充劑和粘合劑[28]。當(dāng)主料添加量為60%，山楂粉、甘露醇、硬脂酸鎂添加量分別為3%、21%、1%，麥芽糊精添加量為3%～7%時(shí)，麥芽糊精添加量對咀嚼片感官質(zhì)量的影響見表2。隨著麥芽糊精添加量的增加，咀嚼片的外觀色澤無明顯變化，表面逐漸細(xì)膩，硬度逐漸增大。這是由于麥芽糊精的添加降低了粉劑的吸濕性，使咀嚼片表面固結(jié)的程度降低而變得細(xì)膩；由于麥芽糊精的黏性使粉劑顆粒間結(jié)合更緊密，導(dǎo)致硬度增大。麥芽糊精量增加，咀嚼片苦味有所減弱，但隨著麥芽糊精量繼續(xù)增加，其本身的糊味逐漸顯現(xiàn)，與苦味相疊加造成口感更苦。因此，麥芽糊精添加量為5%時(shí)，顏色乳白、硬度適中、口感最佳，且差異顯著（P＜0.05）。

2.1.3 山楂粉添加量對咀嚼片感官品質(zhì)的影響

山楂粉添加量對咀嚼片感官品質(zhì)的影響見3。

山楂粉的顏色偏紅，口味酸甜、具有山楂特有的濃香，其中含有的大量膳食纖維，能提高產(chǎn)品的咀嚼性，又因其具有吸濕性，使其黏性增加[29]。當(dāng)主料添加量為60%，麥芽糊精、甘露醇、硬脂酸鎂添加量分別為5%、21%、1%，山楂粉添加量為1%～5%時(shí)，隨著山楂粉添加量的增加，顏色略微加深，苦味得到改善，由于黏性和吸濕性增加導(dǎo)致硬度變大，當(dāng)山楂粉添加量為3%時(shí)，顏色乳白、硬度適中、口感最佳，且差異顯著（P<0.05）。

2.1.4 甘露醇添加量對咀嚼片感官品質(zhì)的影響

甘露醇入口即溶，有清涼感，且無吸濕性，常作為填充劑[30]和矯味劑。甘露醇添加量對咀嚼片感官品質(zhì)的影響結(jié)果如表3。當(dāng)主料添加量為60%，麥芽糊精、山楂粉、硬脂酸鎂添加量分別為5%、3%、1%，甘露醇添加量為10%～30%時(shí)，隨著甘露醇添加量的增加，咀嚼片的外觀無明顯變化，苦味逐漸減小，表面逐漸細(xì)膩，硬度逐漸減小，當(dāng)甘露醇添加量為30%時(shí)，硬度適中，且差異顯著（P＜0.05）。

表3 山楂粉及甘露醇添加量對咀嚼片感官品質(zhì)的影響Table 3 Effects of hawthorn powder and mannitol content on sensory quality of chewable tablets

2.1.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化咀嚼片的配方

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)（表4），在抗氧化肽組分添加量為60%條件下，選取麥芽糊精（因素A）、山楂粉（因素B）、甘露醇（因素C）3因素做正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表5、6和7。

表4 咀嚼片配方L 9（33）因素水平表Table 4 L9（33）factors and levels of chewable tablets formulation

表5 咀嚼片配方正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal experimental results of chewable tablet formulations

續(xù)表5 咀嚼片配方正交試驗(yàn)結(jié)果Continued table 5 Orthogonal experimental results of chewable tablet formulations

表6 咀嚼片配方的正交試驗(yàn)Table 6 Influences of orthogonal test on the formula of chewable tablets

表7 咀嚼片配方方差分析表Table 7 Analysis of variance of chewable tablet formula

由正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析可知，因素A（麥芽糊精）、B（山楂粉）和C（甘露醇）的影響均未達(dá)到顯著水平。因此，正交試驗(yàn)中的得到的較優(yōu)壓片方案A1B1C3為最優(yōu)方案，配方中的添加量分別為：抗氧化肽組分60%，麥芽糊精4%、山楂粉2%、甘露醇30%、硬脂酸鎂1%、微晶纖維素3%時(shí)，壓片的效果較好，形成的咀嚼片顆粒光滑、圓整，口感最佳。

2.1.6驗(yàn)證試驗(yàn)

采用粉末直接壓片方法在26 MPa下，對最優(yōu)配方A1B1C3進(jìn)行驗(yàn)證性壓片，產(chǎn)品的感官評分為87.5±1.02，高于正交試驗(yàn)中各組的感官評分，且顏色乳白、口感適中、硬度適中。

2.2 性能分析

2.2.1 重量差異

英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽組分咀嚼片的片重差異見表8。

表8 片重差異檢查結(jié)果Table 8 Weight variation test results

根據(jù)《中國藥典》（2015版），平均片重在0.30 g及以上的片劑，片重差異限度為±5%。表10中的最大片重差異為-1.8%，符合藥典規(guī)定。

2.2.2 脆碎度

2015年版《中國藥典》四部通則第0923號崩解時(shí)限測定法規(guī)定平均減失重量不得超過1%。咀嚼片平均減失重量在7%左右，不符合中國藥典的規(guī)定。甘露醇添加量增大會導(dǎo)致咀嚼片硬度減小、脆碎度變大[31]，當(dāng)甘露醇添加量為25%時(shí)，咀嚼片的脆碎度達(dá)到1.51%，不符合標(biāo)準(zhǔn)。來思彤[32]研究發(fā)現(xiàn)，隨著制片壓力增大，咀嚼片硬度增大、脆碎度降低。因此，在甘露醇添加量增大咀嚼片的口感變佳的情況下，需進(jìn)一步探索制片壓力對咀嚼片性能的影響。

2.2.3 微生物限度測定

《中國藥典》（2015版）中非無菌藥品微生物限度檢查指標(biāo)見表9，其中n為樣本數(shù)量、c為最大可允許超過m值的樣本數(shù)、m為微生物指標(biāo)可接受水平的限量值、M為微生物指標(biāo)的最高安全限量值。咀嚼片菌落總數(shù)為1 000 CFU·mL-1，大腸桿菌為5 CFU·mL-1，符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

表9 微生物限量指標(biāo)Table 9 Microbial limit index

2.2.4 人體每日服用劑量的確定

維生素C與抗氧化肽組分羥基自由基的清除率變化見圖2。

當(dāng)維生素C質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 mg·mL-1時(shí)，清除率達(dá)到99%以上，而抗氧化肽組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為31.4 mg·mL-1時(shí)，具有與維生素C相同的清除率，因此人體攝入抗氧化肽組分的量應(yīng)為維生素C的15.7倍。人體每日需額外攝入維生素C約100 mg[33]，因此推算，人體須攝入抗氧化肽組分1 570 mg，按每片咀嚼片含抗氧化肽組分180 mg計(jì)算，每天需服用約9片，建議每天3次每次服用3片。

2.2.5 抗氧化肽組分咀嚼片抗氧化性能分析

在抗氧化肽組分含量為2 mg·mL-1時(shí)，咀嚼片、咀嚼片中的抗氧化肽組分、單純抗氧化肽組分（對照）的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率及還原力結(jié)果見表10。

由表10可知，咀嚼片、咀嚼片中的抗氧化肽組分的DPPH自由基清除率與對照相比略有下降但不顯著（P＞0.05）；咀嚼片、咀嚼片中的抗氧化肽組分的羥基自由基清除率和還原力與對照相比顯著增加（P＜0.05），但DPPH自由基清除率變化并不顯著。研究表明，不同種類抗氧化肽的抗氧化性表現(xiàn)方式不盡相同，酪蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化性表現(xiàn)為自由基的清除能力[34]、酪蛋白磷酸肽的抗氧化性主要表現(xiàn)為金屬離子螯合能力[35]。肽抗氧化性的強(qiáng)弱不但與相對分子質(zhì)量以及氨基酸組成有關(guān)[36]，而且與其結(jié)構(gòu)特征尤其是肽鍵形式有關(guān)[37]，在壓片的過程中巨大的壓力可能會對抗氧化肽結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。此外，咀嚼片輔料中的其他成分也會與抗氧化肽相互作用影響抗氧化性[38]。因此，將肽組分制成咀嚼片后抗氧化性的變化原因較為復(fù)雜，具體原因有待后續(xù)研究。

圖1 相同濃度維生素C與抗氧化肽組分羥基自由基的清除率變化Fig.1 Changes in the scavenging rate of the same concentration of vitamin Cand antioxidant peptide hydroxyl free radicals

表10 咀嚼片的抗氧化性分析Table 10 Antioxidant analysis of chewable tablets

3 結(jié)論

采用粉末直接壓片方法在26 MPa下，英國紅蕓豆抗氧化肽組分咀嚼片的最佳配方中各種材料的添加量分別為：抗氧化肽組分60%、麥芽糊精4%、山楂粉2%、甘露醇30%、硬脂酸鎂1%、微晶纖維素3%。使用該配方制作的咀嚼片性狀穩(wěn)定、口感良好、易于吸收，具有一定的抗氧化能力，為有效的抗氧化產(chǎn)品。研究說明將英國紅蕓豆抗氧化肽制成咀嚼片為其提供有效的產(chǎn)品開發(fā)途徑，可以更好發(fā)揮其價(jià)值。