不同農(nóng)業(yè)剩余物對秀珍菇菌絲生長的影響

吳楠，荊瑞勇，秦智，田風(fēng)華，王麗艷，姚欽，李長田

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163316；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)；3.貴州大學(xué)）

秀珍菇Pleurotus pulmonarius（Fr.）Quél.，學(xué)名肺形側(cè)耳，又名鳳尾菇、鳳尾側(cè)耳、肺形平菇、印度鮑魚菇[1]，隸屬真菌界（Fungi），擔(dān)子菌門（Basidiomvcota），蘑菇綱（Agaricomycetes），蘑菇亞綱（Agaricomycetidae），蘑菇目（Agaricales），側(cè)耳科（Pleurotaceae），側(cè)耳屬（Pleurotus）（http：//www.indexfungorum.org/Names/Names.asp）。秀珍菇肉質(zhì)灰白，口感脆嫩，并產(chǎn)生芳香氣味，是平菇家族的佼佼者，在我國栽培廣泛。一直以來，被人們制作成各種食品和調(diào)味品，廣受歡迎[2-3]。不僅如此，秀珍菇還具有豐富的營養(yǎng)價值，其自身含有大量人體所需必需氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖和維生素，已逐漸成為人們餐桌上的常見菜肴[4-5]。秀珍菇具有多種藥用功能，在醫(yī)學(xué)各個領(lǐng)域發(fā)揮至關(guān)重要的作用。秀珍菇子實體具有抗氧化和抗膽堿酯酶等活性，而且可以降低血糖水平，抵抗血管并發(fā)癥。秀珍菇的多糖-蛋白復(fù)合物可以抑制肝癌細(xì)胞的增值，對人類肝癌治療具有十分重要的意義。它還可以激發(fā)動物的免疫系統(tǒng)，從而表現(xiàn)出顯著的抗白血病能力[6-8]。

在廢棄基質(zhì)利用方面，秀珍菇可利用農(nóng)業(yè)剩余物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，尤其對小麥秸稈中的木質(zhì)素和纖維素有較強(qiáng)的降解能力[9]，因此可以考慮在栽培基質(zhì)中用農(nóng)業(yè)剩余物替代部分或全部木屑，如此可以有效緩解菌林矛盾；在工廠化生產(chǎn)中，秀珍菇在對比其他常見食用菌來說，孢子產(chǎn)出量少，不僅降低了工作人員患呼吸道疾病的風(fēng)險，又能有效減少食用菌栽培設(shè)施的損耗[10]；在降解有害物質(zhì)方面，秀珍菇可通過固體發(fā)酵去除木材中殘余的五氯酚，去除土壤中的工業(yè)油料，并對工業(yè)染料進(jìn)行脫色[11-14]。

國內(nèi)外對于農(nóng)業(yè)廢棄物栽培秀珍菇的研究鮮有報道，因此研究具有一定的創(chuàng)新性，為秀珍菇“以草代木”設(shè)施化栽培提供理論基礎(chǔ)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

秀珍菇編號：CCMJAU 201708（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌工程研究中心提供）。

1.1.2 供試材料

小麥秸稈、玉米秸稈、油菜秸稈、玉米芯、花生秸稈、水稻秸稈、大豆秸稈、楊木屑、棉籽殼、麥麩、生石灰，PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g瓊脂、1 L蒸餾水，pH=7.0。

1.1.3 試驗儀器

BKQ-Z751立式壓力蒸汽滅菌鍋、SCB-1820超凈工作臺、BSP-250生化培養(yǎng)箱、Bio Tek多功能酶標(biāo)儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 初篩培養(yǎng)基的制備

分別稱取7種農(nóng)業(yè)剩余物各25 g，替代對照配方[15]（木屑40%，棉籽殼39%，麥麩20%，生石灰1%）中的木屑和棉籽殼，其他輔料成分不變，等量分裝于5個平板（直徑100 mm）中，含水量78%，121℃高壓滅菌40 min，冷卻至室溫備用。

1.2.2 混合設(shè)計配方

利用單純型格子法，采用多項式二次方程擬合Scheffe模型，將響應(yīng)變量（Y）與自變量（X）進(jìn)行關(guān)聯(lián)，對研究進(jìn)行配方設(shè)計[16]，根據(jù)實驗經(jīng)驗設(shè)定自變量取值范圍，設(shè)計出如下10個配方（表1）：

表1 培養(yǎng)料配方設(shè)計Table1 Design of substrates formula

0%≤X1≤100%

0%≤X2≤100%

0%≤X3≤100%

X為主料，主料成分占整個培養(yǎng)基的79%，其余輔料麥麩、生石灰占21%。X1+X2+X3=100%。對照配方[15]：木屑40%，棉籽殼39%，麥麩20%，生石灰1%。

1.2.3評價指數(shù)

試驗測定了秀珍菇菌絲生長時期的5個評價指數(shù)：菌絲生長速率、纖維素酶酶活、多酚氧化酶酶活、漆酶酶活和蛋白酶酶活。漆酶、多酚氧化酶、蛋白酶酶活的測定參照韓增華等[17]的方法。纖維素酶酶活的測定參照安琪等[18]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩結(jié)果

通過對7種農(nóng)業(yè)剩余物的篩選實驗，結(jié)果表明，不同農(nóng)業(yè)剩余物基質(zhì)的菌絲生長速率之間存在顯著性差異（P＜0.05）（圖1）。大豆秸稈培養(yǎng)基的菌絲生長速率最高（3.50 mm·d-1），并顯著高于對照組（3.39 mm·d-1），其次是小麥秸稈和玉米秸稈，分別為3.27 mm·d-1和3.00 mm·d-1。水稻秸稈和花生秸稈培養(yǎng)基菌絲生長速度最慢，以此為依據(jù)，選擇大豆秸稈、小麥秸稈和玉米秸稈作為適宜的主料基質(zhì)，進(jìn)行下一步配方設(shè)計。

圖1 初篩配方秀珍菇菌絲生長速率差異顯著性分析Fig.1 Analysis on the difference of growth rate of mycelium of Pleurotus pulmonarius with initial screening formula

2.2 各評價指數(shù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2.2.1 秀珍菇菌絲生長速率

菌絲生長速率與各主料之間的回歸方程如下：

Y=3.87X1+3.76X2+3.27X3-1.78X1X2-1.57X1X2-0.046X2X3+1.79X12X2X3-92.21X1X22X3+73.38X1X2X32

結(jié)果表明，二次多項回歸模型和線性混合模型的P值均呈極顯著水平（表2）。相關(guān)系數(shù)R2=0.990 6，表明回歸模型與菌絲生長速率數(shù)據(jù)有99.06%的符合度，很好的擬合了三種農(nóng)業(yè)剩余物與菌絲生長速率之間的關(guān)系。如圖2所示，所有數(shù)據(jù)點均集中分布在斜線周圍，表明菌絲生長速率的實測值與預(yù)測值擬合較好。方程中自變量的系數(shù)K反映了方程中自變量的影響程度，即貢獻(xiàn)程度[19]?；貧w方程系數(shù)K（X1）＝3.87＞K（X2）＝3.76＞K（X3）＝3.27，表明這三種農(nóng)業(yè)剩余物做主料對菌絲生長速率的貢獻(xiàn)程度如下：小麥秸稈＞玉米秸稈＞大豆秸稈。交互作用X1X2、X1X3、X1X22X3、X1X2X32是極顯著的（表2），表明小麥秸稈、玉米秸稈和大豆秸稈三者間的交互作用可顯著影響菌絲生長速率。圖3是三種主料交互作用下的菌絲生長速率3D視圖，顏色越趨于紅色表明數(shù)值越高，顏色越趨于藍(lán)色表明數(shù)值越低。由圖3可看出，交互作用X1X2、X1X3和X1X22X3可顯著降低秀珍菇的菌絲生長速率，交互作用X1X2X32可顯著增高秀珍菇的菌絲生長速率。

圖3 小麥秸稈、玉米秸稈和大豆秸稈對菌絲生長速率影響的3D視圖Fig.3 3D view of the effect of wheat straw，corn straw，and soybean straw agro-residues on mycelia growth rate

表2 菌絲生長速率的二次多項回歸模型方差分析Table 2 Variance analysis of the quadratic polynomial regression model for mycelium growth rate

圖2 預(yù)測值與實際菌絲生長速率之間的線性相關(guān)圖Fig.2 Linear correlation plot between the predicted and actual values for mycelia growth

2.2.2 秀珍菇多酚氧化酶活性分析

多酚氧化酶活性與各主料之間的回歸方程如下：

Y=3.59X1+2.45X2+3.16X3+18.66X1X2-5.30X1X3+10.84X2X3-17.19X12X2X3-321.55X1X22X3+69.12X1X2X32

多酚氧化酶是一種引起食用菌子實體酶促褐變的酶類，但在菌絲生長階段，其活性越高表明菌絲降解基質(zhì)的能力越強(qiáng)，所以多酚氧化酶活性是可以顯示出菌絲活力強(qiáng)弱的重要因素。由表3可知，兩種模型的P值均呈極顯著水平。相關(guān)系數(shù)R2=0.970 2。11個配方的所有數(shù)據(jù)均勻集中分布在一條線上，表明秀珍菇多酚氧化酶活性的實測值與預(yù)測值擬合較好（圖4）?；貧w方程系數(shù)K（X1）＝3.59>K（X3）＝3.16>K（X2）＝2.45，表明這三種農(nóng)業(yè)剩余物做主料對多酚氧化酶活性的貢獻(xiàn)程度如下：小麥秸稈>大豆秸稈>玉米秸稈。交互作用X1X2、X1X3、X2X3、X1X22X3、X1X2X32是極顯著的（表3），表明三者間的交互作用可顯著影響多酚氧化酶活性。由圖5可看出，交互作用X1X2、X1X3和X2X3可顯著提高多酚氧化酶活性，交互作用X1X22X3、X1X2X32可顯著降低多酚氧化酶活性。

圖4 預(yù)測值與實際多酚氧化酶活性之間的線性相關(guān)圖Fig.4 Linear correlation plot between the predicted and actual values for activity of polyphenol oxidase

圖5 小麥秸稈、玉米秸稈和大豆秸稈對多酚氧化酶活性影響的3D視圖Fig.5 3Dview of the effect of wheat straw，corn straw，and soybean straw agro-residues on activity of polyphenol oxidase

表3 多酚氧化酶的二次多項回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for fitted quadratic polynomial model of polyphenol oxidase activity

2.2.3 秀珍菇纖維素酶酶活測定結(jié)果

纖維素酶活性與各主料之間的回歸方程如下：

Y=24.17X1+8.89X2+11.71X3-15.07X1X2+23.54X1X3+3.83X2X3-740.48X12X2X3-15.57X1X22X3+83.21X1X2X32

農(nóng)業(yè)剩余物基質(zhì)中含有大量纖維素，纖維素酶是食用菌菌絲降解纖維素的關(guān)鍵酶，纖維素酶活性越高，菌絲降解纖維素能力越強(qiáng)。兩種模型的P值均呈極顯著水平，擬合度較好（表4）。相關(guān)系數(shù)R2=0.990 8。11個配方的所有數(shù)據(jù)均勻集中分布在一條線上，表明纖維素酶活性的實測值與預(yù)測值擬合較好（圖6）。回歸方程系數(shù)K（X1）＝24.17>K（X3）＝11.71>K（X2）＝8.89，表明小麥秸稈對纖維素酶活性的貢獻(xiàn)程度最大，其次是大豆秸稈和玉米秸稈。交互作用X1X2、X1X3、X2X3、X1X2X3、X1X2X32是極顯著的（表4），表明三者間的交互作用可顯著影響多酚氧化酶活性。由圖7可看出，交互作用X1X3、X2X3和X1X22X3可顯著提高纖維素酶活性，交互作用X1X2和X12X2X3可顯著降低纖維素酶活性。

圖6 預(yù)測值與實際纖維素酶活性之間的線性相關(guān)圖Fig.6 Linear correlation plot between the predicted and actual values for activity of cellulase

圖7 小麥秸稈、玉米秸稈和大豆秸稈對纖維素酶活性影響的3D視圖Fig.7 3D view of the effect of wheat straw,corn straw，and soybean straw agro-residues on activity of cellulase

表4 纖維素酶活性的二次多項回歸模型方差分析Table 4 ANOVA for fitted quadratic polynomial model of cellulase activity

2.2.4 秀珍菇漆酶活性分析

漆酶活性與各主料之間的回歸方程如下：

Y=5.79X1+5.17X2+6.74X3+57.00X1X2+25.22X1X3+19.05X2X3-216.04X12X2X3+44.99X1X22X3-292.61X1X2X32

漆酶是降解木質(zhì)素的關(guān)鍵酶，在食用菌菌絲生長過程中起著至關(guān)重要的作用，因此漆酶活性也是判斷菌絲活力大小的一個重要依據(jù)。相關(guān)系數(shù)R2=0.991 6。11個配方的所有漆酶活性數(shù)據(jù)均勻集中分布在一條線上，表明漆酶酶活的實測值與預(yù)測值擬合較好（圖8）?；貧w方程系數(shù)K（X3）＝6.74>K（X1）＝5.79>K（X2）＝5.17，表明大豆秸稈對漆酶活性的貢獻(xiàn)程度最大，其次是小麥秸稈和玉米秸稈。交互作用X1X2、X1X3、X2X3是極顯著的（表5），表明三者間的交互作用可顯著影響漆酶活性。由圖9可看出，交互作用X1X2、X1X3、X2X3均可顯著提高漆酶活性。

圖8 預(yù)測值與實際漆酶活性之間的線性相關(guān)圖Fig.8 Linear correlation plot between the predicted and actual values for activity of laccase

圖9 小麥秸稈、玉米秸稈和大豆秸稈對漆酶活性影響的3D視圖Fig.9 3D view of the effect of wheat straw，corn straw，and soybean straw agro-residues on activity of laccase

表5 漆酶的二次多項回歸模型方差分析Table 5 ANOVA for fitted quadratic polynomial model of laccase activity

2.2.5 秀珍菇蛋白酶活性分析

蛋白酶活性與各主料之間的回歸方程如下：

Y=0.18X1+0.16X2+0.17X3+0.021X1X2+0.016X1X3+0.047X2X3+2.26X12X2X3-2.87X1X22X3-0.039X1X2X32

蛋白酶是當(dāng)基質(zhì)中氮源不足時，菌絲分泌出來充當(dāng)?shù)吹囊环N酶類，所以蛋白酶活性高，表明基質(zhì)中氮源過少，不利于菌絲生長。根據(jù)表6可知，兩種模型的P值均呈極顯著水平，擬合度較好。相關(guān)系數(shù)R2=0.875 3。11個配方的所有蛋白酶活性數(shù)據(jù)均勻集中分布在一條線上，表明蛋白酶酶活的實測值與預(yù)測值擬合較好（圖10）。回歸方程系數(shù)K（X1）＝0.18>K（X3）＝0.17>K（X2）＝0.16，表明小麥秸稈對蛋白酶活性的貢獻(xiàn)程度最大，其次是大豆秸稈和玉米秸稈。交互作用X2X3、X12X2X3、X1X22X3是極顯著的（表6），表明三者間的交互作用可顯著影響蛋白酶活性。由圖11可看出，交互作用X2X3、X12X2X3可顯著提高蛋白酶活性，X1X22X3可顯著降低蛋白酶活性。

圖10 預(yù)測值與實際蛋白酶活性之間的線性相關(guān)圖Fig.10 Linear correlation plot between the predicted and actual values for activity of protease

圖11 小麥秸稈、玉米秸稈和大豆秸稈對蛋白酶活性影響的3D視圖Fig.11 3D view of the effect of wheat straw，corn straw，and soybean straw agro-residues on activity of protease

表6 蛋白酶的二次多項回歸模型方差分析Table 6 ANOVA for fitted quadratic polynomial model of protease activity

2.2.6 配方預(yù)測

利用單純型格子法中Optimization功能，設(shè)定菌絲生長速率、多酚氧化酶、漆酶、纖維素酶和蛋白酶期望響應(yīng)值，優(yōu)化出1個適合秀珍菇菌絲體生長的農(nóng)業(yè)剩余物配方：小麥秸稈61.4%，玉米秸稈17.6%，麥麩20.0%，石灰1.0%。下一步進(jìn)行配方驗證，看預(yù)測出的配方是否適合秀珍菇菌絲培養(yǎng)。

2.2.7 驗證試驗

將預(yù)測出的最優(yōu)配方與對照配方共同進(jìn)行一次平板實驗，測定菌絲生長速率、多酚氧化酶酶活、纖維素酶酶活、漆酶酶活和蛋白酶酶活，驗證結(jié)果如表7所示：5種評價指標(biāo)均顯著優(yōu)于對照配方，因此，農(nóng)業(yè)剩余物配方可以替代對照配方進(jìn)行秀珍菇菌絲培養(yǎng)。

表7 驗證試驗結(jié)果分析Table 7 Analysis of test results

3 討論

木腐菌草腐化已逐漸成為我國食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢，雖然利用農(nóng)業(yè)剩余物進(jìn)行食用菌栽培的研究很多，但是利用單純型格子法進(jìn)行優(yōu)化卻鮮有報道。單純型格子法是混料設(shè)計方法，通過回歸分析，可知不同農(nóng)業(yè)剩余物間的交互作用對菌絲生長速率和各種酶活的影響[19]。因此，研究以7種不同農(nóng)業(yè)剩余物（小麥秸稈、水稻秸稈、大豆秸稈、玉米秸稈、玉米芯、花生秸稈、油菜秸稈）為研究對象，通過初篩，篩選出小麥秸稈、玉米秸稈和大豆秸稈等三種農(nóng)業(yè)剩余物進(jìn)行配方設(shè)計，最終設(shè)計出10個配方。

建立這10個配方對菌絲生長速率、多酚氧化酶酶活、纖維素酶酶活、漆酶酶活和蛋白酶酶活的統(tǒng)計模型。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，三種農(nóng)業(yè)剩余物單獨做主料時，小麥秸稈基質(zhì)的菌絲生長最快，其次是玉米秸稈和大豆秸稈。這與吳楠等[20]研究的不同農(nóng)業(yè)剩余物對紅平菇影響結(jié)果相似。在酶活方面，三種農(nóng)業(yè)剩余物單獨做主料時，纖維素酶活性最高的是小麥秸稈，其次是大豆秸稈；漆酶活性最高的是大豆秸稈，其次是小麥秸稈。造成這種結(jié)果可能是因為這三種農(nóng)業(yè)剩余物的營養(yǎng)成分如纖維素、木質(zhì)素含量不同[21]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)可知，小麥秸稈、玉米秸稈和大豆秸稈的纖維素含量分別為39.26%、37.15%和30.83%，木質(zhì)素含量分別為22.10%、22.14%和32.80%[22]，所以小麥秸稈纖維素含量最高，大豆秸稈木質(zhì)素最高。由此結(jié)果可說明，基質(zhì)中纖維素和木質(zhì)素含量是影響纖維素酶酶活和漆酶酶活的重要因素。

三種農(nóng)業(yè)剩余物共同作用時，4號配方多酚氧化酶和漆酶活性最高，1號配方和5號配方纖維素酶活性最高，8號配方蛋白酶活性最低，以上結(jié)果表明，幾種農(nóng)業(yè)剩余物共同作用比單獨作用對幾種重要酶活的影響更顯著。推測造成這種結(jié)果是由于不同基質(zhì)的C/N不同。C/N的差異也是影響食用菌評價指標(biāo)的重要因素之一。小麥秸稈、玉米秸稈和大豆秸稈的碳氮比分別為70.92、39.30和75.03[22]。小麥秸稈在菌絲生長速率、多酚氧化酶酶活和纖維素酶酶活3個方面的貢獻(xiàn)率最大，由此說明小麥秸稈是一種適合秀珍菇菌絲培養(yǎng)的農(nóng)業(yè)剩余物。如果在小麥秸稈的基礎(chǔ)上，添加適量玉米秸稈，將更有利于秀珍菇菌絲生長。

4 結(jié)論

通過單純型格子法優(yōu)化得到一個農(nóng)業(yè)剩余物配方：小麥秸稈61.4%，玉米秸稈17.6%，麥麩20.0%，石灰1.0%。通過實驗驗證，該配方培養(yǎng)出的菌絲各農(nóng)藝性狀均優(yōu)于對照配方，表明小麥秸稈和玉米秸稈可替代木屑和棉籽殼進(jìn)行秀珍菇菌絲培養(yǎng)。希望可為以后秀珍菇木腐菌草腐化栽培提供一個參考依據(jù)。